Identificazione di specifiche popolazioni di neuroni sensoriali per lo studio dei canali ionici espressi

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i neuroni afferenti mediante marcatura retrograda del colorante e studiare i canali ionici in questi neuroni utilizzando l'elettrofisiologia e l'immunochimica del patch clamp. Ciò si ottiene iniettando prima DAI nel tessuto bersaglio per etichettare i neuroni afferenti innervanti. Il secondo passo consiste nell'isolare i neuroni afferenti dai gangli delle radici dorsali.

Successivamente, i neuroni marcati vengono bloccati per registrare i canali ionici gated, il passaggio finale consiste nell'identificare i canali ionici espressi nei neuroni marcati utilizzando l'immunochimica. In definitiva, utilizzando una combinazione di patch, clamp e immunochimica, siamo in grado di identificare il modello di espressione e le proprietà funzionali dei canali ionici nei neuroni afferenti. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ad altri metodi esistenti è che è un metodo non invasivo e il DAI che utilizziamo, DAI I, è noto per il suo rapido assorbimento da parte dei terminali neuronali.

Mancanza di trasferimento tra i neuroni e ritenzioni a lungo termine all'interno dei neuroni che iniettiamo. A dimostrare la procedura saremo io e Stephanie, tecnico di ricerca del nostro laboratorio per l'iniezione di colorante. Per prima cosa, radere i peli sulla zona del polpaccio su entrambe le zampe del ratto anestetizzato usando un rasoio elettrico.

Quindi, riempire una siringa sterile CC con 200 microlitri di soluzione AI all'1,5%. Inserire lentamente l'ago parallelamente all'asse lungo di ciascun muscolo gastro e iniettare 100 microlitri di dai nel muscolo prima di ritirare l'ago dal muscolo. Tirare indietro lo stantuffo della siringa per assicurarsi che il colorante non fuoriesca più dalla punta.

Attendi 10 secondi e poi ritira l'ago dal muscolo. Sono necessari da quattro a cinque giorni per la distribuzione del colorante per la dissezione. Mettere un becher con 10 millilitri di HBSS, una piastra di Petri da 35 millimetri e una piastra di Petri da 100 millimetri sul ghiaccio.

Quindi, pesare sette milligrammi di collagenasi, un milligrammo di DNA e 10 milligrammi di tripsina preriscaldare, un bagno d'acqua agitante a 37 gradi Celsius e riscaldare una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di EBSS nel bagno. Dopo aver soppresso il ratto prima della dissezione, tagliare rapidamente la pelle sul dorso dell'animale. Quindi rimuovere il tessuto connettivo e muscolare lungo la colonna vertebrale per una migliore esposizione.

Successivamente, rimuovere la sezione lombare della colonna vertebrale. Quindi, posizionare la colonna vertebrale isolata nella piastra di Petri da 100 millimetri. Applicare la soluzione HBSS refrigerata utilizzando una pipetta sterile per pascolo per mantenere la preparazione umida e fredda.

Taglia i muscoli dai lati della colonna vertebrale. Eseguire una laminectomia dorsale utilizzando rongeurs o forbici per rimuovere delicatamente l'osso e chiudere le rientranze contenenti i gangli della radice dorsale. Ripetutamente. Applicare HBSS ghiacciato durante questa procedura.

Al microscopio, isolare il DRG tagliando i nervi periferici e centrali, lasciando uno o due millimetri di nervo per facilitare la manipolazione dei gangli. Quindi posizionare il DRG isolato nella piastra di Petri da 35 millimetri contenente un tampone HBSS ghiacciato. Ripetere le procedure fino a quando tutti i DRG L quattro e L cinque sono stati isolati.

Rimuovere i nervi e i vasi sanguigni in eccesso utilizzando micro forbici e pinze. Tagliare il DRG per una migliore esposizione agli enzimi, ma non rivestire il DRG per la dissociazione dei neuroni DRG. Aggiungere gli enzimi al terreno EBSS caldo, quindi agitare per sciogliere e filtrare sterilizzare.

Quindi posizionare tutto il DRG nella soluzione enzimatica con una testa sterile per tubi da pascolo. Dopodiché, far bollire il pallone con il 95% di ossigeno e il 5% di CO2 per 60 secondi prima di tappare ermeticamente il pallone. Quindi incubare il pallone nel bagnomaria agitato a 37 gradi Celsius per 60 minuti a 240 giri/min.

Al termine dell'incubazione vigorosamente. Agitare il matraccio 50 volte per dissociare il DRG in condizioni sterili. Aggiungere cinque millilitri di MEM plus al pallone per fermare le attività enzimatiche.

Trasferire il contenuto del pallone in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri e centrifugare a 16 volte G per sei minuti. Successivamente, rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere delicatamente cinque millilitri di MEM plus al tritrato del campione con la pipetta.

Per rompere il pellet, ripetere la fase di centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante e aggiungere 500 microlitri di MEM più un tritrato delicato con la punta della pipetta da un millilitro su una pipetta per ottenere una sospensione cellulare. Successivamente, posizionare un vetrino di vetro rivestito di polilisina in un piatto vuoto e sterile da 35 millimetri. Quindi aggiungere una goccia della sospensione cellulare al centro del vetrino coprioggetto.

Ripetere questa procedura fino all'esaurimento della soluzione cellulare. Posizionare le piastre da 35 millimetri in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per un'ora per consentire ai neuroni di aderire alle labbra dei vetrini coprioggetti dopo un'ora. Aggiungere altri due millilitri di supporto in ogni piatto e rimetterli nell'incubatore per eseguire la registrazione con patch clamp.

Innanzitutto, identificare i neuroni DRG marcati con colorante utilizzando un microscopio con epifluorescenza. Quindi, riempire l'elettrodo di vetro con la soluzione interna. Picchiettare delicatamente per rimuovere eventuali bolle intrappolate.

Quindi posizionare l'elettrodo nel portaelettrodo. Abbassare l'elettrodo sulla cella utilizzando un micromanipolatore. Una volta che l'elettrodo tocca la cella, applicare un'aspirazione delicata attraverso il tubo di aspirazione fino a formare una tenuta ermetica.

Quindi bloccare la tensione della membrana al potenziale di tenuta desiderato. Ottenere la configurazione del morsetto patch dell'intera cella applicando un'aspirazione più forte. Per rimuovere il patch della membrana sulla punta dell'elettrodo, una volta stabilita la configurazione del patch clamp dell'intera cella, avviare la registrazione.

In questa procedura, fissare i neuroni sui vetrini coprioggetti con il 4% di para formaldeide per un'ora. Quindi permeare i neuroni con il 2% tra 20 in PBS per 10 minuti. Quindi, incubare le cellule in soluzione bloccante per un'ora.

Le cellule di prova vengono incubate nella soluzione bloccante più l'anticorpo primario durante la notte. Il set di controllo dei neuroni viene lasciato incubare per una notte in una soluzione bloccante senza anticorpi primari. Il giorno successivo, lavare i vetrini coprioggetto con tampone PBS tre volte per cinque minuti ciascuno, seguiti da due lavaggi di cinque minuti ciascuno con l'1% di interpolazione 20 per rimuovere l'anticorpo primario non legato.

Quindi incubare i vetrini coprioggetto del test e del controllo con l'anticorpo secondario con tag fluorescente appropriato per 30 minuti, che si lega all'anticorpo primario per consentire la visualizzazione. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetto con PB S3 volte per cinque minuti ciascuno per rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso. Quindi, montare i vetrini coprioggetto su un vetrino pulito utilizzando un supporto di montaggio.

Quindi applicare lo smalto trasparente sul bordo del vetrino coprioggetti per fissarlo in posizione. Una volta asciutti, visualizza i neuroni e acquisisci le immagini utilizzando il software che accompagna il microscopio a fluorescenza. Questa è una rappresentazione dell'iniezione di Dai nel muscolo gastro e del trasporto retrogrado dal muscolo al DRG.

Qui sono etichettati L four e L five DRG. I neuroni afferenti sono mostrati nell'immagine in campo chiaro e questa immagine fluorescente mostra un neurone afferente muscolare etichettato con colorante. Questo istogramma mostra l'intensità fluorescente DII dei neuroni sensoriali.

Il grande picco proviene da neuroni non marcati ed è dotato di un'equazione gaussiana per determinare l'intensità media e la deviazione standard. La linea verticale tratteggiata rappresenta la soglia per l'etichettatura DAI. L'istogramma comprende i dati di 1047 neuroni, di cui 167 marcati con dai.

Ecco un neurone afferente muscolare rappresentativo con un buon controllo del voltaggio di membrana. Le correnti di sodio a meno 20, meno 10 e zero millivolt sono mostrate a sinistra e la relazione di tensione di corrente è mostrata a destra. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di sezionare rapidamente ma delicatamente i DRG e di mantenere la preparazione umida ripetutamente al codice ghiaccio hbss.

Seguendo questa procedura, altri neuroni efferenti possono essere marcati e identificati per comprendere il loro ruolo in fisiologia.