Name: MicroRNA In situ Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ per microRNA in sezioni renali fissate in formalina. Questo metodo consente di localizzare e quantificare l'espressione di microRNA nei tessuti renali con rilevazione colorimetrica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da US National Institutes of Health concede HL082798 e HL111580.

1. Renali tessuto Sezioni <ol><li> Fissato in formalina (10%) sezioni di rene in paraffina sono tagliati su vetrini da microscopio a 5 mm di spessore con un Microm HM 355 S. Le slide possono essere conservati per diversi mesi prima analisi. </li></ol> 2. Soluzione Preparazione <ol><li> Preparare 1 L di 1x PBS in DDH 2 O in una bottiglia con tappo a vite autoclavabile. Riempire un&#39;altra bottiglia con 1 L di DDH 2 O. Aggiungere 1 ml di DEPC per ogni bottiglia, coperchio e agitare vigorosamente. Lasciate le soluzioni siedono notte a temperatura ambiente per distruggere RNasi e poi in autoclave. Aggiungere 400 ml di Tween-20-1 L di 1x PBS per rendere PBS-T. </li><li> Preparare proteinasi K tampone (50 mMTris-HCl, pH 8,0 e 1 mM CaCl 2 in DEPC acqua trattata). </li><li> Preparare una soluzione di 0,2% glicina in PBS-T. </li></ol> 3. Tissue Preparazione <ol><li> Preparare un grande volume di tampone di ibridazione (50-100 ml) composta dal 50% formammide, 5x SSC, 0,1% Tween, 9.2acido citrico mM per aggiustamento del pH a 6, 50 ug / ml di eparina, e 500 mg / ml di RNA di lievito in DEPC trattati DDH 2 O. Dividere in 1 ml aliquote e conservare a -80 ° C. </li><li> Rimuovere la paraffina dal tessuto mediante lavaggio 3x in xilene fresco per 5 minuti ciascuna. </li><li> Reidratare le sezioni di tessuto per 5 min incubazioni in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 75%, 50% e 25%) in DDH 2 O. </li><li> Trattare i vetrini con DEPC sufficiente a coprire completamente le sezioni di tessuto (circa 0,4-0,5 ml) per 1 min. Rendere sicuri i tessuti non si asciugano. </li><li> Sciacquare i vetrini in DEPC trattati PBS-T due volte per 5 min, la raccolta dei rifiuti DEPC contenente per il corretto smaltimento. Tutti i reagenti devono essere DEPC trattati per eliminare RNasi da questo punto in poi. </li><li> Preriscaldare proteinasi K tampone e inserirlo proteinasi K a una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire sezioni di tessuto con una soluzione di proteinasi K e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Rimuovere rapidamente i proteinassoluzione e K e aggiungere 0,2% glicina in PBS-T per 30 sec. </li><li> Sciacquare i vetrini in DEPC trattati PBS-T due volte per 30 secondi ciascuna. </li><li> Fissare sezioni appena fatto paraformaldeide 4% per 10 min. </li></ol> 4. Ibridazione <ol><li> Aggiungere 50 ml di tampone di ibridazione (formammide 50%, 5x SSC, 0,1% Tween, acido citrico 9,2 mm per l&#39;aggiustamento a pH 6, 50 mg / ml di eparina, 500 mg / ml di RNA di lievito) per sezione di tessuto e coprire con RNAsi HybriSlips gratis tagliare appena più grandi delle sezioni di tessuto. </li><li> Sezioni Prehybridize a umidità controllata ibridazione forno per 2 ore a temperatura di ibridazione determinato per la 3 &#39;della sonda marcata con digossigenina (solitamente Tm DNA della sonda -21 ° C (cioè 54 ° C per miR-382, sonda di DNA Tm = 75 ° C ), utilizzando salviette di laboratorio tessuti imbevuti nel 50% formamide/50% 5x SSC per mantenere la camera umidificata. </li><li> Diluire la sonda di miRNA, controllo positivo (U6, piccolo RNA nucleare) e il controllo negativo (strapazzatesequenza) a 40 nM in tampone di ibridazione (75 microlitri di tampone è necessaria per sezione). </li><li> Riscaldare la sonda nel tampone di ibridazione a 65 ° C per 5 min. </li><li> Togliere i vetrini dalla ibridazione forno e rimuovere coprioggetto e tampone di ibridazione in eccesso da prehybridization. </li><li> Aggiungere 75 ml di sonda contenente tampone per sezione di tessuto, direttamente al tessuto. Coprire con tessuto HybriSlips appena sufficiente a coprire le sezioni di tessuto. </li><li> Mantenere il livello di supporto di diapositive, tornare a ibridazione forno per notte di incubazione a temperatura dal punto 4.2 (circa 16 ore). </li></ol> 5. Stringenza Wash <ol><li> Aggiungere 200 microlitri 2x SSC, riscaldato alla temperatura di ibridazione, poco meno di un bordo del coprioggetto per favorire il rilascio coprioggetto dal tessuto. Rimuovere il vetrino inclinando il vetrino. </li><li> Lavare i vetrini in 200 ml di 50% formammide, 50% 2x SSC a ibridazione 3x temperatura per 30 minuti ciascuno. </li><li> Sciacquarei vetrini 5x in PBS-T a temperatura ambiente per 5 min ciascuno su agitatore orbitale a bassa velocità. </li></ol> 6. Rivelazione <ol><li> Incubare il vetrino in tampone di bloccaggio (2% capra o siero di cavallo, 2 mg / ml di BSA in PBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente su agitatore orbitale a bassa velocità camera. </li><li> Diluire frammenti anti-DIG-AP Fab in tampone di bloccaggio a 1:100. Aggiungere 100 microlitri per ogni sezione di tessuto e coprire con HybriSlips tagliato appena sufficiente a coprire la sezione. </li><li> Incubare anticorpo in una camera umidificata a 4 ° C per una notte (circa 16 ore). </li><li> Lavare i vetrini in PBS-T 7x, per 5 min ciascuno su agitatore orbitale a bassa velocità. </li><li> Lavare i vetrini in tampone AP (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, per 5 minuti ciascuno. </li><li> Aggiungere la soluzione NBT / BCIP al buffer di AP (200 μl/10 tampone ml) </li><li> Aggiungere 400-500 ml di soluzione diluita di NBT / BCIP per ogni diapositiva a coprire completamente tutte le sezioni di tessuto. Sviluppare in un buio, livello, HumidifCamera IED per 4-5 ore. </li></ol> 7. Slides di montaggio <ol><li> Disidratare sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo (25%, 50%, 75%, 100%) per 5 min ciascuno. </li><li> Incubare a 5x xilene per chiarire sezioni. </li><li> Monte scorre in mezzo di montaggio Permount e pernottamento a secco. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un protocollo per miRNA ibridazione in situ che funziona bene nei tessuti renali fissati in formalina. Mentre si lavora su questo protocollo sono stati identificati alcuni importanti fonti di artefatti di colorazione. Una grande attenzione a questi punti può aiutare a evitare di macchiare artefatto e aumentare la probabilità di una corsa ISH successo. Una delle cause più evitabili di artefatti di colorazione può verificarsi q...

MicroRNA sono piccoli (lunghi circa 22 nucleotidi) RNA non codificanti che vengono prodotti in modo endogeno. In genere funzionano per sopprimere l&#39;espressione della proteina attraverso la repressione traslazionale o degradazione mRNA. miRNA si legano agli obiettivi mRNA con la complementarità incompleta, rendendo possibile per un singolo miRNA per sopprimere bersagli multipli. Capire quali tipi e strutture cellulari esprimono miRNA è una parte importante di comprendere i meccanismi attraverso i quali alterazioni di espressione miRNA influenza delle cellule e dei tessuti fenotipi. Mentre i metodi quali miRNA sequenziamento, qPCR e Northern blotting possono essere usate per il rilevamento dei miRNA nei tessuti interi, questo approccio non permette di determinare il tipo specifico di cellule venivano dall&#39;interno di un dato tessuto. Dissezione di componenti cellulari e strutturali prima dell&#39;analisi con questi metodi può essere molto difficile e le condizioni necessarie per raggiungere isolamenti adeguati può portare ad alterations nell&#39;espressione genica o la degradazione di RNA. microRNA ibridazione in situ è un metodo utilizzato per visualizzare la posizione microRNA e livelli di espressione nei tessuti. Questa tecnica è particolarmente utile in tessuti composti di strutture eterogenee, come il rene. I microRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo di regolamentazione in 2,3 sviluppo del rene e la fisiologia 4. alterazioni di espressione microRNA hanno anche dimostrato di essere coinvolti con patologie renali come la fibrosi 5-10, nefropatia diabetica 7, carcinoma renale 11,12, e danno renale acuto 13. Nella nostra ricerca, abbiamo scoperto che l&#39;ottimizzazione microRNA ibridazione in situ per i tessuti renali è stata preziosa per determinare le esatte posizioni strutturali di espressione miRNA sia in salute e malattia 14. Determinazione dell&#39;espressione tubolare e cellulare di diversi microRNA è importante perché la loro regolazione di targets possono dipendere funzioni cellulari. Negli stati malati è importante anche per determinare in che modo le alterazioni dell&#39;espressione dei miRNA possono essere funzione incidono. L&#39;obiettivo del metodo qui descritto è stato quello di sviluppare metodologie ISH esistenti predisposti da Kloosterman et al. 15, altri ricercatori 16,17, e quelle suggerite dalla Exiqon 1 e ottimizzare il metodo di formalina tessuti renali fissi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per identificare le diverse differenze regionali nella renale espressione di microRNA miR-382 con unilaterale ostruzione ureterale 18. Questo approccio può essere utilizzato con altri tessuti e, con ulteriore ottimizzazione.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietil</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xileni</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Ultra Puro</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Tecnologie</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie di vita</td><td>dell'RNA del lievito</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- sonda miRNA</td><td>Exiqon</td><td>miR dipendente-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Sonda miR criptata</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG-U6 miR</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>Adatto alle dimensioni dei</td><td></td>tessuti</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione estraibile</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr> Gruppo <tr><td>vassoio in alluminio</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Inserto rack in acciaio inox</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In questo articolo descriviamo un metodo di rilevazione colorimetrico del miRNA nel rene mediante ibridazione in situ con sonde digossigenina taggato microRNA. Questo protocollo, sviluppato originariamente da Kloosterman e colleghi per un uso ampio con sonde Exiqon miRNA 1, è stato modificato per superare le sfide insite nell&#39;analisi miRNA nei tessuti renali. Si tratta di problemi quali l&#39;identificazione struttura e difficile da rimuovere la sonda residuo e anticorpi. L&#39;uso di relativamente sottile, spessore 5 mm, sezioni di tessuto consentiti per una chiara visualizzazione delle strutture renali, mentre un forte segnale della sonda è stato trattenuto nelle cellule. Inoltre, le condizioni di concentrazione sonda e di incubazione sono stati ottimizzati per facilitare la visualizzazione di espressione microRNA con basso background e segnale aspecifico. Qui, il protocollo ottimizzato è descritto, di captazione tessuto iniziale e preparazione attraverso il montaggio di diapositive alla fine della procedura. La compone di basenti di questo protocollo possono essere modificati per applicazione ad altri tessuti e modelli di coltura cellulare.

Le aree di una sezione di tessuto che diventano asciugato durante le ibridazioni, incubazioni o lavare gradini generalmente finiscono colorazione più scura durante lo sviluppo NBT / BCIP. Figura 1 mostra una porzione di una sezione in cui il rene HybriSlip scivolato del bordo il tessuto, consentendole di diventare parzialmente disidratato. Nonostante reidratazione e la copertura nei passaggi rimanenti, il segnale nella porzione disidratata è artificialmente elevato. L&#39;im...

Questo articolo viene descritto un protocollo in situ ottimizzato per il rilevamento colorimetrico di espressione microRNA nelle sezioni di rene fisse formalina.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è localizzare e quantificare l'espressione di microRNA nei tessuti renali. Questo viene ottenuto innanzitutto ibridando una sonda marcativa con digossigenina a un determinato microRNA presente nel tessuto renale. Come secondo passaggio, un anticorpo diretto contro la digossigenina, coniugato con fosfatasi alcalina, viene incubato con il tessuto.Successivamente, un substrato N-B-T-B-C-I-P viene aggiunto al tessuto al fine di visualizzare la localizzazione del micro RNA mediante lo sviluppo di un prodotto colorato in blu nei siti di ibridazione delle sonde per micro RNA. I risultati ottenuti mostrano dove i microRNA sono espressi nelle regioni del rene e nei segmenti del nefrone, in base all'ibridazione di sonde complementari per micro RNA. Questa procedura utilizza sezioni di rene fissate in formalina e incluse in paraffina, montate su vetrini a uno spessore di cinque micron. Per preparare le sezioni di rene all'analisi, rimuovere innanzitutto la paraffina dal tessuto mediante tre lavaggi in xilene fresco per cinque minuti ciascuno.Riidratare ciascun taglio istologico mediante incubazioni di cinque minuti in concentrazioni decrescenti di etanolo in acqua bidistillata. Successivamente, trattare i vetrini con quantità sufficiente di dathyl, percarbonato o desy da coprire completamente i tagli per un minuto. Accertarsi che i tessuti non si secchino.Rimuovere il desy e lavare i vetrini con PBST due volte per cinque minuti. Assicurarsi che il desy contenente i rifiuti venga raccolto per lo smaltimento appropriato.Da questo punto in avanti, tutti i reagenti devono essere trattati per eliminare le RNasi; aggiungere proteinasi K al tampone pre-riscaldato per la proteinasi K fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Coprire le sezioni di tessuto con la soluzione di proteinasi K e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere rapidamente la soluzione di proteinasi K e aggiungere 0,2% di glicina in PBST per 30 secondi.Lavare le vetture in PBST trattato con Desy due volte per 30 secondi ciascuna. Infine, fissare le sezioni di tessuto in paraformaldeide al 4% appena preparata per 10 minuti.Per iniziare questa procedura, aggiungere 50 microlitri di buffer di ibridazione per ogni sezione di tessuto e coprire con coprioggetti privi di RNAsi leggermente più grandi delle sezioni di tessuto. Posizionare i vetrini all'interno di una camera umidificata, nella quale sono stati posti tamponi da laboratorio inzuppati in una soluzione di 50% formammide e 50% SSC 5X. Pre-ibridizzare le sezioni di tessuto collocando la camera umidificata per due ore in un forno alla temperatura di ibridazione determinata per la sonda marcatrice con digossigenina al tre prime. La temperatura di ibridazione per la sonda è solitamente pari alla temperatura di fusione del DNA, o TM della sonda, meno 21 gradi Celsius.Ad esempio, la temperatura di ibridazione per la sonda 3 82 è di 54 gradi Celsius perché il suo TM è di 75 gradi Celsius. Preparare la sonda micro RNA e i controlli positivo e negativo diluendo ciascuno a 40 nano molar in tampone di ibridazione. Il controllo positivo è l'RNA nucleare piccolo U six e il controllo negativo è una sequenza casuale.Riscaldare la sonda e i controlli a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere i vetrini dall'incubatore per ibridazione. Rimuovere le coprioggetti e il tampone di ibridazione in eccesso dall'allestimento di pre-ibridazione.Aggiungere 75 microlitri di sonda contenente tampone direttamente su ciascun taglio di tessuto. Coprire con coprioggetti igridizzati che, ancora una volta, siano appena sufficienti a coprire i tagli di tessuto. Mantenere la portapreparati in posizione orizzontale.Riposizionare i vetrini nel forno di ibridazione alla temperatura appropriata. Incubare tutta la notte per circa 16 ore. Al termine dell'ibridazione, rimuovere i vetrini dal forno di ibridazione.Aggiungere 200 microlitri di due XSSC riscaldati alla temperatura di ibridazione appena al di sotto di un bordo del coprioggetto per favorire il distacco del coprioggetto dal tessuto. Rimuovere il coprioggetto inclinando il vetrino. Dopo aver rimosso i coprioggetti, lavare i vetrini in 200 microlitri di 50 percento di formammide al 50% due XSSC alla temperatura di ibridazione determinata, tre volte per 30 minuti ciascuna.Lavare i vetrini cinque volte in PBST a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuno su un agitatore orbitale a bassa velocità. Iniziare questa procedura incubando i vetrini in buffer bloccante per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a bassa velocità. Dopo un'ora, aggiungere 100 microlitri di frammenti FAB anti dig AP a ciascuna sezione di tessuto, coprendo con coprioggetti.Tagliare una dimensione leggermente più grande rispetto alla sezione. Incubare i vetrini in una camera umidificata a quattro gradi Celsius per tutta la notte o per circa 16 ore fino al giorno successivo. Lavare i vetrini sette volte in PBST a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuna volta su un agitatore orbitale impostato a bassa velocità.Successivamente, lavare i vetrini nel buffer AP tre volte per cinque minuti ciascuna. Preparare la soluzione di sviluppo N-B-T-B-C-I-P aggiungendo 200 microlitri di soluzione N-B-T-B-C-I-P a 10 millilitri di buffer AP. Aggiungere da 400 a 500 microlitri della soluzione N-B-T-B-C-I-P diluita su ogni vetrino in modo da coprire completamente tutte le sezioni di tessuto.Sviluppare in una camera buia e umidificata a temperatura ambiente per quattro-cinque ore, al termine della rilevazione colometrica. Disidratare i preparati in concentrazioni crescenti di etanolo per cinque minuti ciascuna, quindi chiarirli mediante cinque incubazioni in xilolo per cinque minuti ogni volta. Infine, montare i vetrini in un mezzo di montaggio tipo Permount e lasciarli asciugare tutta la notte.È fondamentale assicurarsi che la sezione di tessuto non si secchi per il successo di questo protocollo di ibridazione in situ. La parte sinistra di questa figura mostra una porzione di una sezione renale in cui lo slip di ibridazione si è staccato dal bordo del tessuto, permettendo così un parziale disseccamento. Nonostante la riidratazione e la copertura nei passaggi successivi, il segnale nella porzione disseccata è artificialmente più alto rispetto alla porzione che è rimasta coperta dallo slip di ibridazione.La barra di calibrazione rappresenta 100 micron in questa immagine. L'importanza dell'ottimizzazione della durata dello sviluppo di N-B-T-B-C-I-P è dimostrata nelle figure seguenti. Il pannello A mostra che periodi di sviluppo superiori a quattro-cinque ore provocano uno sviluppo del colore pronunciato e non specifico e tessuti controllati per micro RNA confusi in tutto il rene.Il pannello B mostra che incubazioni più lunghe di quattro-cinque ore non determinano un miglioramento ulteriore del segnale quando i reni vengono analizzati per bersagli ad alta abbondanza, come il controllo dell'RNA nucleare piccolo U six. Queste figure, adattate da uno studio precedente, confermano l'applicabilità di questo metodo di ibridazione in situ alla rilevazione di micro RNA nel tessuto renale. Il pannello A mostra immagini rappresentative dell'espressione di mere 3 82 ottenute mediante ibridazione in situ in sezioni renali di topi con o senza ostruzione ureterale unilaterale (UUO) e trattati con anti-ME 3 82 o antis. Scrambled. L'UUO ha indotto un aumento dell'espressione di mere 3 82, come dimostrato dalla colorazione più scura nel tessuto UUO più antis. Scrambled rispetto al tessuto sham più antis. Scrambled.Questo aumento &egrave; stato bloccato dal trattamento con anti-ME 3 82. I grafici nel pannello B mostrano l'espressione di mere 3 82 nei topi trattati con sham pi&ugrave; antis scrambled come percentuale della densit&agrave; ottica integrata media. Misurando l'intensit&agrave; dei pixel osservata, l'UUO induce un aumento significativo dell'espressione di mere 3 82 nella midollare esterna e interna e l'anti-ME 3 82 blocca tale aumento.Questo aumento, che può essere interamente visualizzato e misurato mediante ibridazione in situ per microRNA. Questi risultati sono inoltre coerenti con quelli ottenuti tramite Q PCR R, non mostrati qui, indicando che l'uso dell'ibridazione INI due per rilevare l'espressione di mere 3 82 in rene fissato in formalina è sufficientemente sensibile da fornire risultati quantificabili che rispecchiano l'analisi dell'espressione basata su qPCR R. Inoltre, l'ibridazione in C due consente la misurazione di differenze regionali distinte nell'espressione dei microRNA all'interno del rene.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Qui, descriviamo un throughput efficiente...

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Qui descriviamo un protocollo semplificato per l'analisi dell'espressione di microRNA (miRNA) in tessuti clinici archiviati Fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o in tessuti clinici freschi congelati per il cancro alla prostata (PCa) che impiegano la PCR quantitativa in tempo reale (RT-PCR) e l'ibridazione in situ (ISH).

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

Qui presentiamo un protocollo per rilevare l'espressione di miRNA in campioni di pazienti con cancro al seno utilizzando l'ibridazione in situ di miRNA.

Analisi clinicopatologica di miRNA espressione in Breast Cancer tessuti mediante l&#39;utilizzo di miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; ibridazione

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

Descriviamo un protocollo per la microdisezione laser di sottosezioni del rene umano, tra cui il glomerulus, il tubulo prossimale, l'arto ascendente spesso, il condotto di raccolta e l'interstizio. L'RNA viene quindi isolato dai compartimenti ottenuti e il sequenziamento dell'RNA viene effettuato per determinare i cambiamenti nella firma trascrittamica all'interno di ogni sottoseme.

Applicazione della microdisezione laser per scoprire la trascritomica regionale nel tessuto renale umano

Questo articolo presenta un protocollo per rilevare l'espressione di microRNA nei reni di un modello murino di insufficienza renale acuta utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa in tempo reale. Questo protocollo enfatizza un modello murino di danno renale ischemico e l'attenta estrazione di campioni di microRNA.

Un metodo di rilevamento quantitativo per i microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico

Descriviamo un metodo per valutare l'espressione del microRNA nei reni dei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) mediante reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa. Questo protocollo è adatto per studiare i profili di espressione del microRNA renale nei topi con UUO e nel contesto di altre condizioni patologiche.

Valutazione PCR in tempo reale quantitativa delle espressioni di microRNA nel rene del topo con ostruzione ureterale unilaterale

I microRNA sono coinvolti nella patogenesi della nefropatia da IgA. Abbiamo sviluppato un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione di microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Questo nuovo metodo faciliterà il coinvolgimento dei miRNA nella nefropatia da IgA.

Rilevazione dell'espressione di microRNA nei reni di topi nefropatici con immunoglobuline A

Qui, forniamo miRNA esogeni sintetizzati artificialmente al rene tramite iniezione di vena della coda di un vettore non virale e nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali. Ciò ha portato a una significativa sovraespressione del miRNA bersaglio nel rene, con conseguente progressione inibita della malattia renale in diversi modelli murini.

Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Scopri l'ibridazione in situ per microRNA in sezioni renali fissate in formalina. Questo metodo consente di localizzare e quantificare l'espressione di microRNA nei tessuti renali con rilevazione colorimetrica.

MicroRNA

Esplora altri video