Coltura e manutenzione
14 settembre 2013
Clostridium difficile è un batterio patogeno che è un rigoroso anaerobio e provoca diarrea associata agli antibiotici (AAD). Qui, metodi per isolare, coltivare e mantenere C. cellule vegetative difficile e spore vengono descritti. Queste tecniche richiedono una camera anaerobico, che richiede una manutenzione regolare per assicurare adeguate condizioni di ottimale C. la coltivazione difficile.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare C. difficile da campioni fecali, coltivare C. difficile per la preparazione di stock glicerolo da conservare a lungo termine e preparare nonché enumerare stock di spore per diverse applicazioni successive. Questo viene realizzato isolando innanzitutto C. difficile da campioni di feci mediante semina su terreno selettivo. Il secondo passaggio consiste nel far crescere C. difficile in terreno liquido e mantenere stock a lungo termine di C. difficile in glicerolo.
Successivamente, C difficile viene recuperato da stock congelati in glicerolo e seminato su piastre di agar. Nell'ultimo passaggio, vengono preparati e infine enumerati gli stock di spore di C difficile seguendo questi protocolli. C difficile può essere coltivato su diversi tipi di terreni per verificarne e confermarne l'identità, ed essere coltivato e mantenuto con successo.
Questi ceppi in glicerolo e le colture possono essere ulteriormente utilizzati in numerose applicazioni successive, incluse studi su animali e ulteriori studi di biologia molecolare. Il principale vantaggio nell'utilizzo di una camera anaerobica in vinile per coltivare C difficile rispetto ad altri metodi, come l'uso di barattoli a candela, è che può essere mantenuto un ambiente anaerobico rigoroso, consentendo una crescita costante e affidabile di C difficile. In generale, le persone nuove a queste tecniche potrebbero incontrare difficoltà a causa della mancanza di destrezza all'interno della camera dovuta ai guanti, e anche a causa della necessità fondamentale di pianificare gli esperimenti in anticipo.
Le procedure saranno dimostrate da un tecnico del mio laboratorio, Jose Suarez all'inizio. Questa procedura può essere eseguita in condizioni aerobiche. Per prima cosa, pesare il campione di feci.
Questo è necessario per enumerare C. difficile dalle feci. Successivamente, risospendere il campione fecale in 1x PBS ed eseguire un vortex per assicurare che il campione sia completamente risospeso. In seguito, effettuare delle diluizioni seriali del campione fecale risospeso in 1x PBS per l'isolamento o l'enumerazione appropriata delle unità formanti colonie o CFU per grammo di feci da questo punto in avanti.
Eseguire la procedura in condizioni anaerobiche per garantire che le cellule vegetative di C difficile non siano esposte a ossigeno. La camera anaerobica utilizzata in questo esperimento è mantenuta a 37 gradi Celsius. Utilizzando una tecnica asettica.
Applicare 100 microlitri di ciascuna diluizione seriale su piastre di agar ossitano Toro, ciclo Seine, agar fruttosio o T-C-C-F-A. Queste piastre sono state pre-ridotte per almeno una o due ore nella camera anaerobica per garantire la rimozione dell'ossigeno residuo. Per isolare le colonie al fine di un'accurata enumerazione o per altre applicazioni successive.
Utilizzare un’ansa inoculante sterile per distribuire uniformemente la coltura applicata sulla superficie della piastra T-C-C-F-A. Incubare le piastre in condizioni anaerobiche per 48 ore a 37 gradi Celsius. Identificare le colonie di c difficile in base all'aspetto piatto e irregolare simile a vetro smerigliato, per assicurarsi che le forme vegetative di c difficile non vengano uccise dall'esposizione all'ossigeno.
Le piastre destinate all'isolamento di colonie per applicazioni successive devono essere mantenute all'interno della camera anaerobica in ogni momento. Per la conta delle colonie, le piastre possono essere portate all'esterno della camera anaerobica. Si noti che, una volta portata all'esterno della camera, la forma vegetativa di C. difficile sarà esposta all'ossigeno e morirà.
Queste colonie di C difficile non possono essere recuperate anche se la piastra viene riportata nella camera. Contare le colonie di C difficile di ciascuna diluizione e calcolare il numero di UFC per grammo di campione di feci da coltivare e da cui preparare stocchi in glicerolo di C difficile. Utilizzare un’ansa inoculante sterile per prelevare una singola colonia e seminare su un terreno di infusione cerebrale e cardiaca preridotto.
Aggiungere estratto di lievito o piastra di agar BHIS, aggiungendo 0,03% di cisteina, e seminare singole colonie e quadranti utilizzando un nuovo anello di inoculazione sterile per ogni quadrante. Incubare le piastre in condizioni anaerobiche a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Una volta comparse colonie isolate sulle piastre di agar BHIS, selezionare una singola colonia isolata e risospendere la colonia in 10 millilitri di mezzo liquido BHIS pre-ridotto, integrato con 0,03% L-cisteina, e incubare durante la notte.
In modo anaerobico a 37 gradi Celsius o fino a quando la coltura diventa torbida. Il giorno successivo, aggiungere 333 microlitri di glicerolo al 50% e 666 microlitri della coltura di C. difficile in un tubo criogenico da 1,8 millilitro. Per ottenere una riserva di glicerolo al 15% della ceppa isolata, chiudere ermeticamente il tubo criogenico e mescolare.
Prelevare immediatamente la scorta dalla camera anaerobica e collocarla in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Per iniziare questa procedura, rimuovere la scorta glicerolata congelata di C. difficile dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Per evitare il disgelo.
Posizionare immediatamente la coltura glicerolata congelata in un portaprovette refrigerato che è stato precedentemente conservato a meno 80 gradi Celsius. Portare la coltura glicerolata congelata nel portaprovette all'interno della camera anaerobica utilizzando una tecnica asettica e un’ansa di inoculo sterile. Depositare una piccola quantità della coltura sulla piastra e tracciare una striscia su un quadrante della piastra.
Ruotare la piastra di 90 gradi e, utilizzando un nuovo ansa sterile, effettuare il semina nel secondo quadrante. Ripetere per il terzo e il quarto quadrante per garantire l'isolamento di colonie singole. Rimuovere immediatamente la provetta glicerolo congelata dalla camera anaerobica e riporla nel congelatore a -80 gradi Celsius.
Incubare la piastra anaerobicamente durante la notte a 37 gradi Celsius per purificare le spore dalla coltura di C. difficile. Seminare i ceppi dallo stock congelato in glicerolo su piastre BHIS pre-ridotte. Seguire la procedura dimostrata nel segmento precedente.
Incubare in condizioni anaerobiche durante la notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Ricolture singole colonie in diverse piastre 70 30 precedentemente ridotte. Incubare in condizioni anaerobiche a 37 gradi Celsius per 24-48 ore.
Una volta formati gli spori, rimuovere le piastre dalla camera anaerobica. Raschiare le piastre utilizzando un'ansa inoculante sterile e risospendere le cellule in 10 millilitri di PBS sterile 1x. Scartare le piastre e centrifugare le cellule a 3000 G per 15 minuti.
Rimuovere il soprannatante, aggiungere un millilitro di PBS 1X, risospendere e riguadagnare il pellet in questo modo. Lavare le cellule due volte in PBS e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte per favorire la lisi delle cellule vegetative e delle cellule madri al giorno successivo; quindi incubare a 70 gradi Celsius per 20 minuti per eliminare eventuali cellule vegetative residue. Per determinare le UFC per millilitro, effettuare diluizioni seriali di ogni preparato di spore in PBS 1X e seminare su BHIS pre-ridotto più 0,1% di collato di sodio; incubare le piastre a 37 gradi Celsius per almeno 24 ore prima di contare le colonie.
Le spore possono essere conservate in un XPBS a temperatura ambiente per la conservazione a breve termine o a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. A. Un esempio di C difficile coltivato su BHIS e agar sangue anaerobico Columbia può essere visto qui.
C. difficile forma colonie irregolari, piatte e con aspetto simile a vetro smerigliato, evidente su entrambi i terreni. Il pannello A mostra un isolato clinico sensibile all'eritromicina, C. difficile 630 E, coltivato su agar BHIS, un terreno arricchito non selettivo, per 24 ore. A 37 gradi Celsius, le colonie su agar Columbia anaerobico con sangue di pecora mostrate nel pannello B appaiono simili a quelle cresciute su BHIS in luce bianca.
Tuttavia, l'uso di questo mezzo consente anche la rilevazione della fluorescenza verdognola o citrina esibita da C difficile sotto luce ultravioletta a onda lunga, mostrata nel pannello C a seguito di questa procedura. Altri metodi, come le curve di crescita in mezzo liquido, l'isolamento di colonie, l'analisi di DNA e RNA, la PCR e altre tecniche di biologia molecolare, nonché manipolazioni adatte a C difficile, così come l'utilizzo di spore di C difficile per studi su animali, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori quesiti di biologia molecolare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare, coltivare e mantenere cellule vegetative e spore di C difficile in un ambiente anaerobico.
Non dimenticare che C. difficile è un patogeno umano e animale che può causare malattie gastrointestinali. Gli esperimenti con C. difficile devono essere eseguiti in condizioni di biosicurezza di livello due appropriate.
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Panoramica
In questo articolo vengono descritti i metodi per l'isolamento, la coltivazione e il mantenimento di Clostridium difficile, un batterio patogeno responsabile della diarrea associata all'uso di antibiotici. Le tecniche illustrate richiedono una camera anaerobica per garantire condizioni di crescita ottimali sia per le cellule vegetative che per le spore.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Coltivazione di patogeni
- Resistenza agli antibiotici
Sfondo
- Clostridium difficile è un anaerobio obbligato.
- È una causa importante di diarrea associata agli antibiotici (AAD).
- Tecniche adeguate di isolamento e mantenimento sono fondamentali per applicazioni di ricerca e cliniche.
- Il mantenimento di condizioni anaerobiche è essenziale per una coltivazione riuscita.
Scopo dello studio
- Isolare C. difficile da campioni fecali.
- Coltivare C. difficile per la preparazione di stock glicerolati.
- Preparare ed enumerare stock di spore per diverse applicazioni.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di C. difficile da campioni di feci mediante l'uso di terreni selettivi.
- Crescita di C. difficile in terreno liquido.
- Conservazione a lungo termine di C. difficile in stock glicerolati.
- Preparazione e numerazione degli stock di spore.
Risultati principali
- C. difficile può essere isolato e coltivato con successo.
- Le scorte in glicerolo permettono la conservazione a lungo termine del batterio.
- È possibile preparare scorte di spore e determinarne il numero per applicazioni successive.
- Diversi tipi di terreni possono essere utilizzati per verificare e confermare l'identità di C. difficile.
Conclusioni
- I metodi descritti sono efficaci per l'isolamento e il mantenimento di C. difficile.
- Queste tecniche sono essenziali per la ricerca sulla resistenza agli antibiotici e sulla patogenicità.
- Condizioni anaerobiche adeguate sono fondamentali per una coltivazione riuscita.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Coltivare e mantenere Clostridium difficile in condizioni strettamente anaerobiche è essenziale per una modellizzazione preclinica affidabile della diarrea associata ad antibiotici e per studi sulla patogenicità. La capacità di isolare, conservare e quantificare cellule vegetative e spore permette una validazione costante dei bersagli e lo sviluppo di saggi nella ricerca antimicrobica. Questo flusso di lavoro supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo un sistema rilevante per la malattia, utile per valutare interventi terapeutici prima dei test in vivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'isolamento di C. difficile da matrici complesse per confermare la presenza del patogeno e supportare la verifica di ipotesi negli studi sui meccanismi di virulenza.
- Valore operativo: Fornisce un metodo standardizzato per ottenere colture pure, riducendo la variabilità nei saggi successivi di interazione con il bersaglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera stock quantificati di spore e cellule vegetative da utilizzare in saggi di suscettibilità antimicrobica e di produzione di tossine.
- Valore operativo: Garantisce la preparazione riproducibile dell'inoculo, fondamentale per lo screening ad alto rendimento di librerie di composti contro patogeni anaerobi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce ceppi di spore caratterizzati per studi di infezione in modelli animali, consentendo la valutazione dell'efficacia terapeutica e delle interazioni ospite-patogeno.
- Valore operativo: Permette la conservazione a lungo termine dei ceppi, garantendo continuità tra le fasi di transizione dalla sperimentazione preclinica a quella clinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la conferma del bersaglio attraverso l'isolamento e la coltivazione, e permettendo l'identificazione di composti promettenti mediante screening antimicrobico che utilizza colture e spore preparate.
- Biologia della scoperta: Conferma la presenza e la purezza degli isolati di C. difficile, riducendo i falsi negativi nei flussi di lavoro di validazione degli obiettivi.
- Screening: Fornisce inocoli standardizzati e quantificabili per saggi di efficacia degli antibiotici e di germinazione delle spore.
- Analisi: Fornisce risultati in termini di UFC/mL e conteggio delle spore per la modellizzazione dose-risposta e la valutazione della potenza.
- Ricerca traslazionale: Collega la coltura in vitro alla rilevanza in vivo attraverso preparazioni di spore utilizzate in modelli animali di sfida.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di coltivazione anaerobica riutilizzabile per molteplici ceppi di C. difficile in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva mantenendo la rilevanza fisiologica delle colture di patogeni anaerobi.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso rigorosi protocolli di manipolazione anaerobica e conservazione delle scorte.
- Valore strategico: Riduce il rischio di fallimento nei programmi antimicrobici consentendo una riduzione precoce dei rischi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta le decisioni di proseguimento o interruzione basate su un comportamento costante dei patogeni nei modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze in microbiologia anaerobica e tecnica asettica all'interno di camere dotate di guanti.
- Accesso a camere anaerobiche mantenute a 37 °C con monitoraggio regolare dell'ossigeno.
- Protocolli standardizzati per il trasferimento dei campioni all'interno e all'esterno delle zone anaerobiche per prevenire l'esposizione all'ossigeno.
- Considerazioni sull'adattamento a diversi ceppi di C. difficile e formulazioni di terreni di coltura.
- Le limitazioni includono le restrizioni relative alla destrezza manuale nei guanti della camera e la necessità di una pianificazione sperimentale anticipata.
