Lo studio delle interazioni di Staphylococcus aureus Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare gli effetti del fenolo stafilococcico, della modlina solubile o dei PSM sui neutrofili umani. Ciò si ottiene isolando prima i neutrofili dal sangue umano per la successiva analisi in vitro. Successivamente, i neutrofili vengono caricati con colorante fluorescente e miscelati con una serie di concentrazioni di PSM con e senza inibitori, oppure vengono autorizzati a fagocitare i batteri S reus contenenti un costrutto reporter GFP del promotore alfa del PSM.

Infine, l'attivazione dei neutrofili da parte della stimolazione con PSM può essere monitorata mediante citometria a flusso e l'espressione della GFP da parte della fagocitata. I batteri possono essere analizzati mediante microscopia a fluorescenza Con questo metodo. Puoi studiare gli effetti di stafilococco, fenile, soia, moline o neutrofili.

Naturalmente, questo metodo può essere applicato a molti altri tipi di cellule, stimoli e antagonisti. Abbiamo avuto l'idea per la parte microscopica di questo metodo quando abbiamo discusso un modo per osservare gli effetti dei PSM all'interno dei neutrofili. L'utilizzo di un costrutto di espressione GFP batterica e della microscopia time-lapse ci consente di fare esattamente questo.

Dopo aver prelevato cinque provette di sangue venoso eparinizzato, versare 12 millilitri di una soluzione fiale con densità di 1,119 grammi per millilitro in una provetta da 50 millilitri, quindi sovrapporre con cura 10 millilitri di una soluzione di chiamata FI con densità di 1,077 grammi per millilitro. Successivamente, diluire il sangue con un volume uguale di PBS e stratificare accuratamente da 20 a 25 millilitri di sangue su ciascun gradiente di doppio strato. Centrifugare i gradienti per 20 minuti a 396 volte G e 22 gradi Celsius senza interruzioni.

E poi utilizzare una pompa a vuoto dotata di una punta per pipetta sterile per aspirare gli strati superiori di plasma giallo e PBMC. E poi il terzo strato bianco. Ora usa una piccola pipetta di plastica per trasferire il neutrofilo polimorfonucleato o la frazione PMN da ciascuna provetta in una nuova provetta da 50 millilitri.

Aggiungi il nostro PMI appena preparato e integrato con albumina sierica umana o R-P-M-I-H-S-A a ogni tubetto per portare il volume totale a 50 millilitri. Quindi centrifugare le cellule, aspirare il surnatante con una pompa a vuoto e agitare delicatamente l'eritrocita rosso e il pellet contenente PMN. Quindi, aggiungi nove millilitri di acqua deionizzata sterile alle cellule e avvia un timer.

Aggiungi esattamente 30 secondi. Aggiungere un millilitro di PBS 10 volte concentrato per fermare lo shock iperosmotico. Quindi lavare le cellule in un volume totale di 50 millilitri di R-P-M-I-H-S-A.

Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere un millilitro di R-P-M-I-H-S-A su ciascun palato, che ora è bianco a causa della lisi degli eritrociti. Quindi risalire, sospendere mediante pipettaggio e unire i pellet in un'unica provetta. Ora conta le cellule e regola la concentrazione a una volta per 10 al settimo cellulare per millilitro.

Ora caricare cinque volte 10 al sesto di cellule per millilitro con due micromolari di influenza oh 3:00 AM in R-P-M-I-H-S-A. E copri il tubo con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Quindi, incubare le cellule per 20 minuti a temperatura sotto agitazione.

Nel frattempo, preparare una triplice diluizione seriale dello stimolo a 10 volte la concentrazione finale. Quindi preincubare 30 microlitri di stimolo con un volume uguale di inibitore o tampone appena preparato 10 volte concentrato per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule in 10 millilitri di R-P-M-I-H-S-A e risospendere le cellule in R-P-M-I-H-S-A fresco a cinque volte 10 per sesta cellula per millilitro.

Subito prima dell'analisi del flusso, diluire le cellule a due volte da 10 a una sesta cella per millilitro in R-P-M-I-H-S-A e aggiungere 200 microlitri di cellule per tubo fax. Facendo attenzione a non attivare le cellule agitando o pipettando, caricare la prima provetta sul citometro a flusso. Attendere tre secondi e quindi avviare l'acquisizione dopo un periodo di tempo prestabilito, ad esempio otto secondi, togliere la provetta e aggiungere rapidamente 50 microlitri della diluizione più bassa dello stimolo al campione.

Ricaricare immediatamente il tubo e continuare l'acquisizione. Al termine di una serie di diluizioni, lavare l'ago del citometro a flusso con R-P-M-I-H-S-A fresco prima di misurare una nuova serie. Dopo aver eseguito l'ultimo campione, analizzare i dati con il software di analisi della citometria a flusso per analizzare l'espressione batterica della GFP.

Dopo la fagocitosi PMN, far crescere un ceppo S ous contenente il costrutto reporter di interesse durante la notte in brodo, rimuovere qualsiasi GFP espressa durante la coltura notturna diluendo le cellule a OD 6 60 0 0,01. Coltiva la cultura fino a OD 6 60 0 0.1. Diluire le cellule da una a 30, quindi monitorare la crescita fino a quando la coltura non raggiunge nuovamente un OD sei 60 di 0,1.

Quindi raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Lavare le celle una volta in DPBS e Resus. Sospendere la cultura.

Aggiungendo da uno a 10 del volume originale si ottiene un OD sei 60 di 1,0 o circa cinque volte 10 all'ottavo CFU per millilitro. Ora mescolate i batteri con il PNS appena isolato in R-P-M-I-H-S-A in un rapporto di 10 a uno. Quindi aggiungere il siero umano aggregato a un decimo volume finale totale di siero umano aggregato all'interno della soluzione cellulare.

Stimolare la fagocitosi agitando la miscela cellulare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi diluire i PMN caricati con batteri a cinque volte da 10 a 5 cellule per millilitro e trasferire 250 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di un vetrino di copertura a otto pozzetti. Infine, visualizzare le cellule su un microscopio invertito dotato di un obiettivo 40 x e racchiuse in una camera in ambiente buio e acquisire immagini in più posizioni nelle camere di scorrimento coprioggetto ogni 5-10 minuti sia nel campo chiaro che nel canale GFP per seguire la produzione batterica di GFP in tempo reale, incubando neutrofili con una serie di concentrazioni di PSM alfa tre sintetico si ottiene una rapida attivazione dose-dipendente del cellule misurate dal flusso di calcio.

La pre-incubazione del peptide alfa tre della PSM con siero umano allo 0,01%, 0,1% o 1% ha inibito significativamente la capacità dello stimolo di suscitare una risposta al calcio. Anche in questo caso in modo dose-dipendente all'1% di siero. Quasi nessuna attivazione è visibile a queste concentrazioni di PSM alfa tre.

In queste immagini, sono mostrati due neutrofili contenenti batteri fagocitosi contenenti un costrutto reporter PSM alfa GFP. I batteri iniziano a emettere fluorescenza circa un'ora dopo la fagocitosi, indicando l'espressione di GFP dal promotore PSM Alfa. I batteri al di fuori dei neutrofili non emettono fluorescenza, indicando che l'espressione di PSM alfa si attiva rapidamente solo quando i batteri vengono fagocitati.

Quando si tenta questa procedura è importante ricordare di utilizzare sempre neutrofili freschi per ottenere risultati ottimali. Dopo aver visto questo video, spero che tu abbia una buona comprensione di come misurare il flusso di calcio mediante citometria a flusso e come misurare l'espressione genica batterica all'interno delle cellule eucariotiche utilizzando la microscopia a fluorescenza.