Name: Lo studio delle interazioni di Staphylococcus aureus Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri come studiare l'attivazione dei neutrofili umani in risposta ai PSM di Staphylococcus aureus mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza. Questo metodo permette di analizzare le interazioni batteriche in vitro.

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<p class="jove_content"&gt; Marina militare è stato parzialmente finanziato da una Marie Curie europei contributi di reinserimento (ERG), dal Settimo programma quadro della Comunità europea, il numero di progetto 268.324.</p&gt;

1. Isolamento dei PMN dal sangue umano da densità centrifugazione <ol><li> Disegnare 5 9 ml provette di sangue venoso eparina. </li><li> Preparare doppio strato gradienti Ficoll (4 gradienti per 5 provette sangue) come segue: Versare 12 ml di una densità di 1.119 g / ml soluzione Ficoll in un tubo da 50 ml e strato accuratamente 10 ml di una densità di 1,077 g / ml soluzione Ficoll in cima. </li><li> Diluire il sangue con un volume uguale di PBS. </li><li> Strato il sangue diluito con cura sullo strato doppio gradiente Ficoll; 20-25 ml per gradiente. </li><li> Centrifugare 20 min a 396 xg in un rotore oscillante, 22 ° C senza freni. </li><li> Preparare freddo RPMI contenente 0,05% di albumina sierica umana (RPMI-HSA). Anche preparare 9 ml sterile deionizzata H 2 O. Pre-raffreddare sia il RPMI e H 2 O in ghiaccio. </li><li> Aspirare lo strato superiore contenente Ficoll plasma (colore giallo) e PBMC, e il secondo strato di Ficoll (colore bianco) con l&#39;uso di una pompa a vuoto (mettere un puntale sterile sullala pipetta). </li><li> Raccogliere i PMN in provette da 50 ml utilizzando una piccola pipetta di plastica (1 tubo per le frazioni di PMN ogni 2 sfumature), e disporli sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere a freddo RPMI-HSA ad un volume totale di 50 ml e centrifugare per 10 min a 249 xg a 4 ° C. </li><li> Togliere il surnatante con l&#39;uso di una pompa a vuoto e agitare delicatamente il pellet (eritrociti e PMN). </li><li> Aggiungere 9 ml sterile deionizzata H 2 O e avviare il timer. Fermare l&#39;iper shock osmotico dopo 30 sec esattamente, con l&#39;aggiunta di 1 ml di 10 volte PBS concentrato. Nota: il 30 sec sono molto critici. </li><li> Aggiungere a freddo RPMI-HSA ad un volume totale di 50 ml e centrifugare per 10 min a 249 xg a 4 ° C. </li><li> Togliere il surnatante con l&#39;uso di una pompa a vuoto e raccogliere il PMN pellet in 1 tubo con un volume definito (1-2 ml) RPMI-HSA. </li><li> Determinare la quantità di cellule e regolare la concentrazione di 1.10 7 cellule / ml. A seconda del donatore, la resa dei PMN isolati sarà between 5 x 10 6 e 3 x 10 7 PMN da 9 ml ciascuna provetta di sangue </li></ol> 2. Flusso Assay Cytometric per la Valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani <ol><li> Celle di carico (5 x 10 6 cellule / ml) con 2 mM Fluo-3-AM in RPMI-HSA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente a dondolo lentamente, utilizzando per esempio un dondolo piattaforma shaker, al riparo dalla luce. </li><li> Nel frattempo preparare una diluizione seriale (es. 3 volte) dello stimolo a 10x la concentrazione finale. PSMα3 viene utilizzata in questo protocollo, ma qualsiasi stimolo GPCR che agisce sui neutrofili è adatto. </li><li> Preparare concentrato 10x inibitore del recettore in RPMI-HSA. Quando l&#39;inibitore agisce sullo stimolo (ad es HDL on PSMα3) pre-incubare 25 microlitri stimolo con un volume uguale di inibitore per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di RPMI-HSA e centrifugare per 249 xg a temperatura ambiente. Risospendere le cellule a 5 x10 6 cellule / ml. </li><li> Appena prima dell&#39;esperimento, diluire le cellule a 2x10 6 cellule / ml in RPMI-HSA e aggiungere 200 microlitri cellule per provetta FACS. PMN diluito sono molto fragili. Tenerli troppo a lungo a questa concentrazione porterà ad auto-attivazione; lo stesso vale per l&#39;agitazione vigorosa o pipettaggio. </li><li> Collegare il tubo al citofluorimetro, attendere 3 secondi e iniziare l&#39;acquisizione. Dopo un determinato periodo di tempo (ad esempio, 8 sec), togliere il tubo e in rapida aggiungere 50 microlitri di stimolo al campione. Subito ricollegare il tubo sul supporto del campione e continuare l&#39;acquisto. </li><li> Iniziare con il più basso e terminare con la più alta concentrazione di stimolo. Lavare l&#39;ago citofluorimetro regolarmente dopo ogni esecuzione con RPMI-HSA. </li><li> Analizzare i dati con il software di analisi di citometria a flusso. Confrontare il segnale di fluorescenza media prima dell&#39;aggiunta del stimolo che dopo aggiunta dello stimolo e utilizzare gli opportuni controlli positivi e negativi per calcolare l&#39;acforza tivazione per ogni diluizione misurato. </li></ol> Alternativamente quando l&#39;inibitore agisce sui recettori pre-incubare le cellule con l&#39;inibitore. 3. Microscopia a fluorescenza Analisi di batteri espressione GFP dopo fagocitosi da parte dei PMN <ol><li> Grow S. aureus contenenti un costrutto giornalista di interesse per tutta la notte in brodo (con antibiotici quando necessario per mantenere il plasmide reporter). In questo caso MW2 ceppo contenente una PSMα costrutto reporter di GFP è usato 10, cresciuto in un tubo di plastica da 50 ml con 5 ml di coltura LB medium. </li><li> Per rimuovere tutte le GFP da espressione O / N, diluire le culture di OD 660 0,01 e crescere per OD 660 0.1. Redilute questa cultura 1:30, e monitorare la crescita fino a quando la cultura raggiunge un diametro esterno di 660 0.1. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione e lavare una volta in DPBS. Risospendere in 1:10 del volume originale per ottenere un OD 660 di 1,0 o rviti e dei dadi 5.10 8 UFC / ml. </li><li> Mescolare i batteri (1,10 7 / ml) con PMN appena isolate (1.10 6 / ml) in RPMI-HSA (rapporto 10:1) in una provetta 1,5 ml e aggiungere siero umano riunito a una concentrazione finale del 10%. Agitare su una piattaforma di agitazione per 10 min a 37 ° C per stimolare la fagocitosi. Diluire i PMN carichi di batteri a 5.10 5 PMN / ml e pipetta 250 microlitri in un pozzo di un vetrino ben camerata 8. </li><li> Immagine dei PMN con batteri su un microscopio. Un microscopio invertito dotato di un obiettivo NA 40X/0.85 funziona bene e deve essere racchiuso in una camera ad ambiente scuro per mantenere l&#39;ambiente stabilmente a 37 ° C. Acquisire immagini per un certo numero di posizioni preimpostate utilizzando la telecamera ogni 5-10 min sia nel campo chiaro e il canale GFP per seguire la produzione GFP nel tempo. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
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<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Nei metodi descritti qui alcuni passaggi sono molto critico. Ci metterà in evidenza questi qui. Per l&#39;isolamento dei neutrofili centrifugazione in gradiente di densità è importante non disturbare gli strati durante o dopo le fasi di centrifugazione. Quando aspirazione dei neutrofili utilizzando una pipetta di plastica, fare attenzione a non schiacciare il pallone, mentre nello strato di cellule, come liquido di espulsione disturberà gli strati. Inoltre, controllare visivamente il pellet ...

Neutrofili (PMN) sono fagociti professionali che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata contro Staphylococcus aureus 1. La costante battaglia tra ospite e microbo ha portato a una corsa agli armamenti di entrambi. Recentemente, comunità-associati (CA) ceppi meticillino resistente S. aureus (MRSA) sono emerse, che sembra essere molto efficiente in elusione delle neutrofili uccisione 2,3. Fenolo solubile modulin (PSM), eccessiva produzione di CA-MRSA è stato associato con una maggiore virulenza 4,5. Neutrofili umani possono riconoscere questi PSMs via FPR2 che portano all&#39;attivazione di tale G-proteina recettore accoppiato 6. Uno dei primi eventi è la mobilitazione dei depositi intracellulari di calcio (Ca 2 +). Ca 2 + agisce come un messaggero secondario per una varietà di funzioni effettrici dei PMN compreso degranulazione e fagocitosi 7. Pertanto Ca 2 + è un indicatore molto sensibile dellacapacità funzionale del PSM per attivare PMN. Per studiare gli effetti di PSM su neutrofili, neutrofili freschi sono isolati e caricati con un colorante che reagisce su di mobilizzazione del calcio. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata. Usando questo metodo, è possibile studiare gli effetti diretti di componenti tossici e di altro neutrofili, e determinare la concentrazione minima a cui essi sono attivi. Per noi, si tratta di uno strumento molto utile per studiare l&#39;effetto di molte proteine ​​prodotte da S. aureus coinvolta in evasione immune, quali FPR2 proteina inibitoria (FLIPR) 8, FLIPR-come 7, e chemiotassi proteina inibitoria di Staphylococcus aureus (chips) 9. Tutte queste proteine ​​hanno dimostrato di inibire la mobilizzazione del calcio in neutrofili legandosi al recettore che riconosce l&#39;agonista. Recentemente, il nostro gruppo ha descritto che PSM sono funzionalmente inibiti dalle lipoproteine ​​sieriche 10 &lt;/ Sup&gt;. Queste lipoproteine ​​sono abbondantemente presenti nel sangue e tessuti umani, indicando che PSMs esercitano la loro funzione principalmente nell&#39;ambiente intracellulare. La disponibilità del saggio mobilizzazione del calcio permesso di misurare con precisione l&#39;effetto di lipoproteine ​​sieriche sull&#39;attivazione dei neutrofili dai PSMs, indicata dalla notevole inibizione da concentrazioni molto basse di siero. Poiché le PSMs sono funzionalmente inibiti dal siero, abbiamo ipotizzato che ci sia una funzione importante per PSMs come tossine intracellulari. Abbiamo quindi cercato di determinare il ruolo di PSM dopo la fagocitosi. Per studiare l&#39;espressione dei PSMs nello spazio intercellulare, abbiamo costruito fusioni giornalista del promotore dell&#39;operone psmα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono stati fagocitati dai neutrofili, l&#39;induzione dell&#39;espressione era osservabile mediante microscopia a fluorescenza 10. Ovviamente, questa technique consente di studiare l&#39;espressione di un gran numero di geni in S. aureus o altri patogeni dopo fagocitosi. Poiché per S. aureus sopravvivendo nella nicchia intercellulare è molto importante per superare il sistema immune innato 11 10 12, studiando il ruolo dei geni attivati ​​in questa nicchia è molto importante per comprendere la sua virulenza.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Molecular Probes / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>densità 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>densità 1,119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>contiene 25 mM HEPES e L-glutammina</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 microscopio</td><td>Leica Microsystems, Paesi Bassi</td><td>TCS SP5</td><td>obiettivo: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Molto importante che il tubo possa essere rimosso e sostituito durante il processo di misurazione</td></tr></tbody></table>

lo studio delle interazioni di<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; con neutrofili mediante citometria a flusso e time lapse microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Vi presentiamo i metodi per studiare l&#39;effetto di modulins solubili fenolo (PSM) e altre tossine prodotte e secrete da Staphylococcus aureus sui neutrofili. Per studiare gli effetti delle PSMs sui neutrofili isoliamo neutrofili freschi utilizzando densità centrifugazione in gradiente. Questi neutrofili sono caricati con un colorante fluorescente che su di mobilizzazione del calcio. L&#39;attivazione dei neutrofili da PSMs avvia un aumento rapido e transitorio nella concentrazione di calcio intracellulare libero. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata monitorando la fluorescenza di un colorante pre-caricato che reagisce alla maggiore concentrazione del Ca 2 +. Usando questo metodo è possibile determinare la concentrazione di PSM necessario attivare la neutrofili, e misurare gli effetti degli inibitori specifici e generali di attivazione dei neutrofili. Per studiare l&#39;espressione dei PSMs nello spazio intracellulare, we hanno costruito fusioni giornalista del promotore dell&#39;operone PSMα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono fagocitati dai neutrofili, l&#39;induzione di espressione può essere osservato mediante microscopia a fluorescenza.

Flusso saggio citometria per la valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani Incubando neutrofili con una serie di concentrazione PSMα3 sintetici conseguente attivazione rapida come misurato da flusso di calcio, che è indicata da un aumento nel segnale in FL-1. Pre-incubazione di sintetico PSMα3 con 0,01%, siero umano 0,1% o 1% inibito significativamente la capacità di suscitare flussi di calcio (Figura 1). Analisi di espressione GFP nei batte...

Presenteremo i metodi per studiare l&#39;effetto di PSMs e altre tossine secrete da<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Sui neutrofili mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza.

Lo studio delle interazioni di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare gli effetti del fenolo stafilococcico, del modulina solubile o dei PSM sui neutrofili umani. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto i neutrofili dal sangue umano per un successivo esame in vitro. Successivamente, i neutrofili vengono o caricati con un colorante fluorescente e mescolati a una serie di concentrazioni di PSM in presenza e assenza di inibitori, oppure vengono lasciati fagocitare batteri S. aureus contenenti un costrutto reporter GFP sotto il controllo del promotore alpha di PSM.Alla fine, l'attivazione dei neutrofili mediante stimolazione con PSM può essere monitorata mediante citometria a flusso e l'espressione di GFP da parte dei batteri fagocitati può essere analizzata mediante microscopia a fluorescenza con questo metodo. È possibile studiare gli effetti di stafilococchi, fenile, soia, molini o neutrofili.Ovviamente, questo metodo può essere applicato a molti altri tipi cellulari, stimoli e antagonisti. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea relativa alla parte di microscopia di questo metodo discutendo un modo per osservare gli effetti delle PSM all'interno dei neutrofili. L'uso di un costrutto batterico per l'espressione di GFP e la microscopia a intervalli temporali ci permette di fare esattamente ciò.Dopo aver prelevato cinque provette di sangue venoso eparinizzato, versare 12 millilitri di una soluzione di fial con densità di 1,119 grammi per millilitro in una provetta da 50 millilitri, quindi sovrapporre con attenzione 10 millilitri di una soluzione di FI call con densità di 1,077 grammi per millilitro. Successivamente, diluire il sangue con un volume uguale di PBS e stratificare da 20 a 25 millilitri di sangue con attenzione su ciascun gradiente duale di fi call. Centrifugare i gradienti per 20 minuti a 396 volte G e a 22 gradi Celsius senza interruzione.Quindi utilizzare una pompa a vuoto dotata di una punta sterile per pipetta per aspirare gli strati superiore giallo (plasma) e dei PBMC. Quindi il terzo strato bianco. Ora utilizzare una piccola pipetta di plastica per trasferire la frazione di neutrofili polimorfonucleati o PMN da ogni tubo in un nuovo tubo da 50 millilitri.Aggiungere in ogni provetta 50 millilitri di PMI appena preparato e pre-raffreddato, integrato con albumina sierica umana o R-P-M-I-H-S-A. Successivamente, centrifugare le cellule, aspirare il soprannatante con una pompa a vuoto e vortexare delicatamente il pellet contenente eritrociti rossi e PMN. Poi, aggiungere nove millilitri di acqua deionizzata sterile alle cellule e avviare un cronometro.Aggiungere esattamente 30 secondi. Aggiungere un millilitro di PBS concentrato 10 volte per arrestare lo shock iperosmotico. Quindi lavare le cellule in un volume totale di 50 millilitri di R-P-M-I-H-S-A freddo.Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere un millilitro di R-P-M-I-H-S-A a ciascun campione, che ora appare bianco a causa della lisi degli eritrociti. Quindi risospendere mediante pipettaggio e unire i pellet in un unico tubo. A questo punto contare le cellule e regolare la concentrazione a un milione di cellule per millilitro.Ora caricate cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro con due micromolar flu oh 3:00 AM in R-P-M-I-H-S-A. Coprite il tubo con della carta d'alluminio per proteggerlo dalla luce. Successivamente, incubate le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione.Nel frattempo, preparare una diluizione seriale triplicata dello stimolo a 10 volte la concentrazione finale. Quindi preincubare 30 microlitri dello stimolo con un volume uguale di inibitore appena preparato 10 volte concentrato o tampone per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule in 10 millilitri di R-P-M-I-H-S-A e risospendere le cellule in R-P-M-I-H-S-A fresco a una concentrazione di cinque per 10 alla sesta cellule per millilitro.Subito prima dell'analisi in flusso, diluire le cellule a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro in R-P-M-I-H-S-A e aggiungere 200 microlitri di cellule per provetta da fax. Avendo cura di non attivare le cellule agitando o pipettando, caricare la prima provetta sul citometro a flusso. Attendere tre secondi, quindi avviare l'acquisizione; dopo un periodo di tempo fisso, ad esempio otto secondi, rimuovere la provetta e aggiungere rapidamente 50 microlitri della diluizione più bassa dello stimolo al campione.Ricaricare immediatamente il tubo e proseguire l'acquisizione. Al termine di una serie di diluizioni, lavare l'ago del citometro a flusso con R-P-M-I-H-S-A fresco prima di misurare una nuova serie. Dopo aver analizzato l'ultimo campione, analizzare i dati con un software di analisi della citometria a flusso per valutare l'espressione batterica di GFP.Dopo la fagocitosi da parte dei PMN, coltivare un ceppo S. ous contenente la costruzione reporter di interesse durante la notte in brodo, quindi rimuovere qualsiasi GFP espressa durante la coltura notturna diluendo le cellule a un OD 660 di 0,01. Far crescere la coltura fino a un OD 660 di 0,1. Diluire le cellule di uno a 30, quindi monitorare la crescita finché la coltura non raggiunge nuovamente un OD 660 di 0,1.Quindi raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Lavare le cellule una volta in DPBS e Resus. Sospendere la coltura.Aggiungere da uno a 10 volte il volume originale per ottenere un OD600 di 1,0 o circa cinque volte 10 alla ottava UFC per millilitro. Mescolare ora i batteri con il PNS appena isolato in R-P-M-I-H-S-A in un rapporto di 10 a 1. Quindi aggiungere siero umano poolizzato fino a un volume finale pari a un decimo del totale di siero umano poolizzato all'interno della soluzione cellulare.Stimolare la fagocitosi agitando la miscela cellulare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, diluire i neutrofili carichi di batteri fino a cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro e trasferire 250 microlitri delle cellule in ciascun pozzetto di una piastra con coprivetrino a otto camere. Infine, acquisire immagini delle cellule mediante un microscopio invertito dotato di un obiettivo 40x e racchiuso in una camera oscura, registrando immagini in più posizioni all'interno delle camere del coprivetrino ogni cinque-dieci minuti sia in campo chiaro che nel canale GFP, per seguire in tempo reale la produzione batterica di GFP. L'incubazione dei neutrofili con una serie di concentrazioni di PSM alpha tre sintetico determina un'attivazione rapida delle cellule in modo dose-dipendente, misurata mediante flusso di calcio.La preincubazione del peptide PSM alfa tre con siero umano allo 0,01%, 0,1% o 1% ha inibito significativamente la capacità dello stimolo di indurre una risposta calcica. Ancora una volta, in modo dose-dipendente allo 1% di siero. A queste concentrazioni di PSM alfa tre, è visibile quasi nessuna attivazione.In queste immagini sono mostrati due neutrofili che contengono batteri fagocitati, i quali portano un costrutto reporter PSM alpha GFP. I batteri iniziano a fluorescere circa un'ora dopo la fagocitosi, indicando l'espressione di GFP da parte del promotore PSM alpha. I batteri al di fuori dei neutrofili non fluorescono, indicando che l'espressione di PSM alpha viene attivata rapidamente solo quando i batteri vengono fagocitati.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare sempre neutrofili freschi per ottenere risultati ottimali. Dopo aver visto questo video, si spera che tu abbia acquisito una buona comprensione di come misurare il flusso di calcio mediante citometria a flusso e di come misurare l'espressione genica batterica all'interno di cellule eucariotiche utilizzando la microscopia a fluorescenza.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Questo video mostra un test in vitro per studiare l'interazione neutrofilo-biofilm. I batteri patogeni incorporati nel biofilm e i neutrofili isolati sono stati marcati utilizzando etichette fluorescenti e la risposta immunitaria dei neutrofili e l'evasione della risposta immunitaria da parte dei batteri sono state valutate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Un test in vitro per studiare l'interazione tra neutrofili e biofilm

Il video dimostra un metodo per studiare l'impatto delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti. In un modello di camera a flusso a piastre parallele, le citochine pro-infiammatorie inducono l'espressione di recettori di adesione da parte delle cellule endoteliali, facilitando il reclutamento e la migrazione dei neutrofili. Il cross-talk tra le cellule stromali e le cellule endoteliali diminuisce il reclutamento dei neutrofili nelle cellule endoteliali.

Un'indagine sul flusso in vitro dell'effetto delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell'aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.

Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante

Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L'imaging time-lapse consente l'osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Il presente protocollo descrive lo studio delle interazioni neutrofili-biofilm. I biofilm di Staphylococcus aureus sono stabiliti in vitro e incubati con neutrofili umani derivati dal sangue periferico. La risposta di scoppio ossidativo dei neutrofili viene quantificata e la localizzazione dei neutrofili all'interno del biofilm viene determinata al microscopio.

Saggi standardizzati in vitro per visualizzare e quantificare le interazioni tra neutrofili umani e biofilm di Staphylococcus aureus

Questo protocollo descrive un approccio quantitativo per misurare l'autoaggregazione microbica utilizzando la citometria a flusso di imaging.

Citometria a flusso per lo studio dell'autoaggregazione microbica

In questo manoscritto, forniamo un protocollo completo per valutare la sopravvivenza agli antibiotici per Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, trasformando i plasmidi in P. aeruginosa e S. aureus per creare ceppi reporter e visualizzare varianti fenotipiche, come i persistenti, mediante microscopia a epifluorescenza time-lapse.

Imaging al microscopio a epifluorescenza time-lapse di fenotipi eterogenei di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

Scopri come studiare l'attivazione dei neutrofili umani in risposta ai PSM di Staphylococcus aureus mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza. Questo metodo permette di analizzare le interazioni batteriche in vitro.

Lo studio delle interazioni di

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