Registrazione elettrofisiologica simultanea e imaging del calcio dei neuroni del nucleo soprachiasmatico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare l'interazione tra i cambiamenti di tensione o corrente, come i cambiamenti nell'azione, la frequenza di attivazione potenziale e la concentrazione intracellulare di calcio nei neuroni del nucleo sopramatico. Ciò si ottiene preparando la fetta di cervello per la registrazione dei neuroni del nucleo della SMA utilizzando un microelettrodo riempito con la sonda sensibile al calcio. In una seconda fase, il microelettrodo viene sigillato con la membrana neuronale.

Successivamente, la membrana neuronale sigillata con il micro elettrodo viene rotta per introdurre la sonda fluorescente di calcio nei singoli neuroni e per registrare insieme all'attività elettrica della membrana si ottengono risultati che mostrano misurazioni di tensione o corrente e immagini della fluorescenza della sonda di calcio a due lunghezze d'onda L'alterazione del rapporto di fluorescenza a queste lunghezze d'onda riflette il cambiamento del calcio intracellulare all'interno del neurone. È possibile eseguire analisi successive per determinare la concentrazione di calcio della cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i cambiamenti nell'attività elettrica della membrana e nel calcio intracellulare prodotti dall'attivazione sinaptica possono essere misurati simultaneamente nei singoli neuroni del nucleo sopracosmetico.

A dimostrare questa tecnica sarà il mio collega Dr.Robert Irwin. Iniziare questa procedura posizionando il cervello di ratto su una carta da filtro circolare inumidita con soluzione di affettatura su una capsula di Petri di vetro, appoggiata sul ghiaccio, tagliare la corona cerebrale solo per rimuovere il cervelletto e il tronco encefalico e tagliare porzioni dei lati destro e sinistro della corteccia, lasciando un blocco di cervello contenente l'ipotalamo e preservando con cura il lato ventrale del cervello contenente i nervi ottici SCN e il chiasma ottico. Dopodiché, stendere un sottile strato di colla acrilica Sano, abbastanza grande da attaccare il cervello e i blocchi di aros in una camera di taglio del microtomo ghiacciata.

Trasferisci il blocco cerebrale ghiacciato con il lato co rivolto verso il basso sulla colla con il lato contenente l'SCN posizionato per primo per il taglio e i nervi ottici che formano una v rivolta verso l'alto, posiziona i blocchi aros su altri tre lati. Successivamente riempire la camera con un tampone per affettare a freddo e bollire continuamente con carbogeno. La colla acrilica Sano si solidifica con l'umidità e mantiene in posizione i blocchi cerebrali e aros.

Quindi tagliare le fette ipotalamiche coronali contenenti l'SCN a uno spessore compreso tra 220 e 250 micron. Si noti che il blocco sinistro si è staccato durante il taglio. Questo può accadere se viene applicata una colla insufficiente.

Successivamente, identificare la sezione contenente il SCN. Tipicamente, viene scelta una fetta in cui il chiasma ottico è di circa due o quattro millimetri di diametro, che appare come una banda bianca con il SCN appena dorsale che appare come due piccole rientranze nel chiasma ottico su entrambi i lati del terzo ventricolo. Trasferire una fetta nella camera di registrazione a 36 gradi Celsius montata sul tavolino di un microscopio.

La camera è riempita con una soluzione di registrazione a flusso continuo a due millilitri al minuto. Aerato con il 95% di carbogeno e preriscaldato con un riscaldatore in linea. Identificare l'SCN osservando i due nuclei traslucidi dell'SCN su entrambi i lati del terzo ventricolo, dorsali al chiasma ottico che appare come una banda nera quando illuminato dalla luce trasmessa.

Per preparare il microelettrodo per la registrazione, riempirlo con la soluzione interna contenente la sonda di calcio filtrata con un filtro a siringa da quattro millimetri tramite un tubo di microriempimento. Quindi posizionare il microelettrodo nel supporto del microelettrodo. Quindi, applicare una piccola quantità di pressione positiva continua all'elettrodo.

Abbassare il microelettrodo nella camera di registrazione con la guida dell'illuminazione a luce rossa. Quindi posizionare il microelettrodo sull'SCN utilizzando un obiettivo a bassa potenza. Successivamente, passare il microscopio a un ingrandimento ad alta potenza per selezionare una sottoregione di SCN e un singolo neurone SCN.

Continuare ad applicare una leggera pressione positiva al microelettrodo mentre avanza sulla superficie della cella. Una volta che è sulla superficie, applicare una leggera pressione negativa per formare una tenuta con una resistenza da tre a 10 giga ohm. Successivamente, regolare la tensione della membrana a meno 60 millivolt.

Quindi applicare un'ulteriore pressione negativa all'elettrodo per rompere la membrana cellulare al fine di formare il bloccaggio del cerotto dell'intera cellula. Dopo essere entrati nella modalità dell'intera cellula, il soma del neurone SCN e i dendriti verranno riempiti con la sonda fluorescente. Misurare la tensione della membrana in modalità pinza amperometrica o la corrente in modalità pinza amperometrica.

Mentre i dati dell'immagine della sonda di calcio vengono monitorati e memorizzati, le immagini acquisite possono essere visualizzate insieme a un grafico di dati di fluorescenza con rapporto di 340 nanometri e 380 nanometri. Durante l'esperimento, un mono cronometro viene utilizzato per ottenere le misurazioni quantitative del calcio esponendo rapidamente l'SCN alla luce UV. A 340 nanometri e 380 nanometri, la luce di eccitazione passa attraverso un filtro ottico UG 11 per limitare le lunghezze d'onda armoniche sopra i 400 nanometri e uno specchio dicroico DCLP da 400 nanometri riflette la luce sul tessuto.

La luce emessa passa attraverso un filtro di emissione a 510 nanometri e viene catturata dalla fotocamera. Per analizzare il risultato, selezionare una regione di interesse dall'immagine iniziale e una regione di sfondo da convertire in unità di intensità di fluorescenza relativa. I dati della regione di interesse vengono visualizzati in tempo reale durante l'esperimento.

Lo sfondo viene utilizzato in seguito nella successiva analisi dei dati. Ecco un'immagine in campo chiaro di una fetta coronale di ipotalamo contenente il SCN e il chiasma ottico. Un micro elettrodo di vetro riempito con una soluzione interna contenente BISRA two viene sigillato su un singolo neurone.

Qui sono mostrate le risposte del calcio a una serie di 50 passi di tensione registrati da un neurone SCN con tensione bloccata. Le correnti di sodio voltaggio-dipendenti sono state inibite con TTX 0,5 micromolari, e questa è un'immagine di cattura dello schermo delle regioni somatiche e dendritiche di interesse corrispondenti alle risposte del calcio. Questi sono gli esempi di risposte del calcio a un numero variabile di gradini di tensione.

Questa figura mostra la registrazione simultanea del voltaggio di membrana e del calcio intracellulare. In un neurone SCN, l'esperimento del current clamp è stato eseguito in presenza di 50 ritossina micromolare. Una piccola depolarizzazione del potenziale di membrana ha innescato diversi periodi di azione, che si attivano con un corrispondente aumento e successiva diminuzione del calcio intracellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare fette sane di cervello del nucleo supracosmetico e di eseguire esperimenti elettrofisiologici e di imaging simultanei. Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare un'adeguata protezione per gli occhi.