Biofilm microbici elettroattivi derivati dalle acque reflue: crescita, mantenimento e caratterizzazione di base

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere un biofilm microbico elettroattivo anodico dall'inoculo delle acque reflue e di caratterizzare le sue proprietà bioelettrocatalitiche. Ciò si ottiene impostando, inoculando e avviando un potenziale reattore batch alimentato elettrochimicamente bio controllato staticamente. Il secondo passo consiste nel monitorare la produzione attuale utilizzando la pirometria Krono.

Successivamente, il mezzo viene sostituito regolarmente dopo l'esaurimento del substrato fino a raggiungere una densità di corrente massima riproducibile, che rappresenta una formazione di biofilm allo stato stazionario. Il passo finale consiste nello studiare il trasferimento elettronico extracellulare di batteri elettroattivi utilizzando la telemetria vol ciclica durante la presenza e l'assenza del substrato. In definitiva, l'analisi dei dati fornisce informazioni fondamentali sulla termodinamica del trasferimento di elettroni microbici e consente di determinare il potenziale formale dei possibili ed effettivi siti di trasferimento di elettroni extracellulari.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si possono ottenere informazioni dirette sul trasferimento di elettroni tra microrganismi ed elettrodi solidi, e quindi ricavare informazioni fondamentali sul trasferimento di elettroni extracellulari microbici. In generale, le persone che non conoscono il metodo avranno difficoltà con la scelta dei parametri corretti e l'interpretazione corretta del grafico derivato. Durante l'acquisizione e l'analisi dei dati, possono essere commessi gravi errori.

Prima di iniziare questa procedura, preparare una quantità adeguata di terreno di coltura utilizzando un tampone fosfato, includendo ulteriori nutrienti secondo il seguente riferimento. Utilizzare 10 millimolari di acetato di sodio come substrato. Aggiungere un millilitro di acque reflue primarie per 20 millilitri di crescita, mezzo come inoculo.

Quindi inserire un ago nel terreno e sciacquarlo con azoto per almeno mezz'ora. Per disaerarlo durante il lavaggio con azoto, misurare la dimensione dell'elettrodo per la configurazione a tre elettrodi. Inserire l'elettrodo di lavoro, il controelettrodo e l'elettrodo di riferimento in un pallone a fondo tondo modificato a quattro colli da 250 millilitri tramite tappi in silicone.

Avvolgere i tappi in silicone con paraform per sigillare il sistema durante il lavaggio con azoto. Versare 250 millilitri del terreno di coltura e della miscela di inoculo attraverso la porta di campionamento nel reattore. Chiudere la porta di campionamento con un tappo in silicone e sigillarla ermeticamente con perfil.

Posizionare il recipiente in una camera a temperatura controllata di 35 gradi Celsius per garantire condizioni ambientali costanti. Quindi, collegare gli elettrodi ai rispettivi cavi dello statista di potenziale. Apri il software per controllare la statistica potenziale e scegli la tecnica.

Cronopirometria. Impostare l'elettrodo di lavoro su un potenziale costante di 0,2 volt per una durata di 500 ore registrando ogni 600 secondi successivi, avviare la cronopirometria e osservare il grafico della corrente misurata nel tempo. Dopo aver calcolato le densità di corrente preferenziali, tracciare la densità di corrente misurata in funzione del tempo.

Dopo che la corrente ossidativa ha raggiunto un plateau e ritorna alla corrente zero, mettere in pausa la misurazione metrica dell'ampere crono per uno scambio medio. Pertanto, trasferire il recipiente in una scatola a flusso laminare e lavare il sistema con azoto. Scaricare con cautela il terreno e rabboccare con terreno fresco disaerato dopo il rabbocco del terreno.

Chiudere la porta di campionamento e sigillarla con paraforma. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando la corrente ossidativa massima raggiunge uno stato stazionario Dopo ogni ciclo di crescita, prelevare un campione da un millilitro delle soluzioni fresche e del terreno di scambio per l'analisi del substrato mediante HPLC. Per studiare il trasferimento di elettroni extracellulari, selezionare la tecnica di telemetria a volume ciclico nel software di controllo dei potenziali stat.

Quindi impostare il potenziale iniziale EI dell'elettrodo di lavoro a 0,5 volt negativi rispetto all'elettrodo di riferimento, il potenziale di vertice E da uno a 0,3 volt e il potenziale finale E da due a 0,5 volt negativi. Utilizzare una velocità di scansione di un millivolt al secondo. Avviare l'esperimento e registrare almeno tre cicli per ottenere un cv riproducibile.

Dopo aver calcolato le densità di corrente preferenziali, tracciare la densità di corrente misurata in funzione del potenziale dell'elettrodo di lavoro. Dalle misurazioni cronometriche, è possibile misurare la densità di corrente massima e l'efficienza di Kula. Qui è mostrata una tipica curva cronometrica di crescita del biofilm di diversi cicli di crescita utilizzando un reattore batch alimentato.

Dopo la fase iniziale di ritardo, inizia un primo massimo di densità di corrente, quindi la corrente diminuisce fino a quasi zero flusso di corrente a causa dell'esaurimento del substrato. Successivo al rifornimento del substrato. La densità di corrente aumenta di nuovo con una densità di corrente massima più elevata.

Dopo diversi cicli di crescita, la densità di corrente massima è costante, il che indica una formazione di biofilm allo stato stazionario. Come massimo dello stato stazionario. Il valore della densità di corrente dipende da diversi parametri.

È spesso considerato una caratteristica dei sistemi di elettrodi elettrodinamici a biofilm microbico. La seconda caratteristica operativa è l'efficienza omica, che è il numero di elettroni registrati come flusso di corrente elettrica per ciclo batch alimentato in relazione al numero massimo teorico di elettroni. Vedere il protocollo di testo per i dettagli su come calcolare l'efficienza della chiamata, il flusso di corrente elettrica e il numero massimo teorico di elettroni mostrato.

Ecco un tipico CV per le condizioni di non turnover. A una velocità di scansione elevata, viene raffigurato il CV di un biofilm per velocità di scansione elevate in cui è possibile identificare solo una coppia di picchi e quindi un potenziale EF formale. Qui. In generale, il potenziale formale di una coppia redox può essere calcolato dal potenziale di picco del picco di ossidazione EPA e dal picco di riduzione della rispettiva specie EPC.

Formando la media aritmetica, vedere il protocollo di testo per i dettagli su come calcolare il potenziale formale. Quando si applica una velocità di scansione sufficientemente bassa allo stesso biofilm, è possibile identificare fino a quattro coppie di ossidoriduzione. Tuttavia, il CV di non turnover mostra solo tutti i composti attivi redox sull'elettrodo, e quindi l'EF dei possibili siti di trasferimento elettronico extracellulare.

Solo l'analisi del CV di fatturato fornisce l'EF dei siti EET effettivi quando si analizzano ulteriormente i CV non fatturati. È possibile analizzare altri parametri caratteristici come la separazione dei picchi, la corrente di picco massima e la densità di corrente di picco minima. Questi parametri, soprattutto se registrati per diverse velocità di scansione, possono essere utilizzati per analisi meccanicistiche e cinetiche dei processi di trasferimento di elettroni sugli elettrodi.

Tuttavia, questa analisi cinetica, ben consolidata per i sistemi chimici, non è semplice per i biofilm microbici elettroattivi. Quando si esegue la misurazione CV in presenza di substrato, si ottiene un CV di turnover. Dopo aver tracciato i dati, si osserva la tipica curva bioelettroelettrocatalitica a forma di S.

Analizzando ulteriormente i dati, il massimo della derivata prima o il punto di flesso della curva fornisce l'EF potenziale formale dei siti EET effettivi. Nel caso di un biofilm dominato da un sottile rapporto geobatterico, si possono osservare due punti di flesso. Successivamente, la derivata mostra due massimi corrispondenti al potenziale formale dei siti EET attivi bio elettrocatalitici, che sono denominati rispettivamente come EF due e EF tre.

Questa scoperta mostra anche che i processi redox associati ai potenziali formali EF uno e EF quattro non sono correlati alla bioelettrolisi. Man mano che il biofilm cresce e diventa più spesso, il CV mostra un solo punto di flesso. Questo potenziale formale EEF negativo 0,32 volt rispetto all'argento, cloruro d'argento è approssimativamente uguale alla media aritmetica dei due potenziali formali assegnati all'EET del biofilm sottile.

Questo risultato mostra che l'analisi CV fondamentale fornisce informazioni sulla termodinamica EET in modo rapido e non invasivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere facilmente adattata a diversi sistemi di interesse e, a seconda dei dati, consente una diversa profondità di analisi dei dati se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura e apprendendo le basi della geometria del biofilm microbico, si possono facilmente apprendere altri metodi come la telemetria a onda quadra o la spettroscopia di impedenza elettrochimica, nonché un'analisi approfondita dei dati.