Name: Biofilm microbici elettroattivi derivati dalle acque reflue: crescita, mantenimento e caratterizzazione di base (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Scopri la crescita di biofilm microbici elettroattivi anodici da acque reflue in reattore fed-batch controllato da potenziostato. Caratterizza il trasferimento elettronico extracellulari mediante voltammetria ciclica per applicazioni bioelettrochimiche.

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F.H. riconosce il sostegno del BMBF (Premio di ricerca "Processi biotecnologici di nuova generazione - Biotecnologia 2020+") e dell'Associazione Helmholtz (Young Investigators Group).

Poiché la procedura di selezione nel reattore bioelettrochimico alimentato è molto specifica a causa della scelta del substrato e delle condizioni anossiche, lavorare in condizioni sterili non è necessario per l'esempio dimostrato.
1. Preparazione del terreno di crescita
<ol>
	<li>Preparare una quantità adeguata di terreno di coltura utilizzando un tampone fosfato secondo Kim et al.13 (cfr. tabella 1). Qui, l'acetato di sodio (10 mM) funge da substrato. Il terreno di coltura utilizzato in questo articolo è solo un esempio e, a seconda dello scopo sperimentale, può variare nei suoi componenti.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di acque reflue primarie per 20 ml di terreno di coltura come inoculo. Il campione di acque reflue viene prelevato da un impianto di trattamento delle acque reflue municipali dopo la filtrazione meccanica (vedi ad esempio Figura 2) e può essere conservato fino a tre mesi fino all'uso in un contenitore chiuso a 4 °C. 
	(Nota: a seconda dell'obiettivo dell'esperimento, l'esatto conteggio iniziale delle cellule può essere importante e quindi dovrebbe essere determinato. Nell'esempio dimostrato, la conta cellulare iniziale non è importante, poiché il biofilm raggiunge condizioni di stato stazionario.)</li>
	<li>Sciacquare il terreno, compreso l'inoculo, con azoto per almeno 30 minuti per disaerarlo, inserendo un ago nel terreno e accendere il flusso di azoto. Il flusso dovrebbe essere abbastanza forte da poter osservare una miscelazione completa del mezzo. 
	(Nota: a seconda del volume del fluido, si dovrebbe anche considerare di prolungare il tempo di disaerazione. Durante l'impostazione della disaerazione del reattore a batch alimentato (passaggi 2.1-2.2))</li>
</ol>
2. Configurazione del reattore Fed-batch
<ol>
	<li>Prendi un recipiente del reattore adatto: qui viene utilizzato un pallone a fondo tondo modificato a 4 colli da 250 ml. 
	(Nota: in generale la nave dovrebbe avere almeno quattro insenature. Questi sono necessari per i tre elettrodi e per il campionamento/scambio di fluidi. I volumi di gas prodotti possono essere trascurati quando il reattore viene aperto regolarmente a causa del campionamento o del cambio del fluido, in alternativa è necessario installare un contabolle. Al fine di evitare una crescita fototropica indesiderata, i reattori devono essere schermati dall'esposizione diretta alla luce.)</li>
	<li>Per la configurazione a tre elettrodi (vedere la Figura 3 e la sezione 3 per i dettagli), posizionare l'elettrodo di riferimento (RE) (qui Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V vs. SHE), l'elettrodo di lavoro (WE) e il controelettrodo (CE) nel pallone attraverso ingressi individuali tramite tappi in silicone – sigillare ermeticamente. 
	(Nota: come WE e CE vengono utilizzate barre di grafite. Il filo degli elettrodi viene tirato attraverso il tappo in silicone e fissato esternamente. L'elettrodo di riferimento viene fatto passare attraverso il tappo in silicone attraverso un foro praticato. Per evitare cortocircuiti, assicurarsi che non vi sia contatto fisico degli elettrodi, anche durante l'agitazione o il ricircolo del fluido. Posizionare gli elettrodi che sono completamente coperti con una soluzione media. Per la sigillatura, avvolgere il tappo in silicone di ogni ingresso con Parafilm.)</li>
	<li>Versare il terreno di coltura, compreso l'inoculo (qui 250 ml) attraverso la porta di campionamento nel reattore, mentre si risciacqua con l'azoto.</li>
	<li>Chiudere l'ultimo ingresso con un tappo in silicone e sigillarlo ermeticamente. Nota: le tracce di ossigeno non danneggiano i biofilm delle specie miste. Sono in grado di resistere e persino consumare bassi livelli di ossigeno, il che a sua volta può ridurre l'EC.</li>
</ol>
3. Crescita cronoamperometrica del biofilm
<ol>
	<li>Collegare gli elettrodi ai rispettivi cavi del potenziostato. Posizionare il recipiente in una camera a temperatura controllata, qui si utilizzano 35 °C31, in modo da garantire condizioni ambientali costanti.</li>
	<li>Apri il software per controllare il potenziostato e scegli la tecnica: Cronoamperometria. Impostare i parametri ad esempio come segue: Un potenziale costante EWE di 0,2 V (rispetto ad Ag/AgCl) per una durata t di 500 ore (≈ 20 giorni). La corrente viene registrata in passi di tempo dti ogni minuto. 
	Nota: La scelta del potenziale applicato dipende dal sistema/microrganismo studiato. Generalmente i processi anodici sono studiati a potenziale positivo e i processi catodici a potenziali negativi. Si può anche dedurre un potenziale adatto dai potenziali standard del donatore/accettore di elettroni e dal potenziale formale del sito di trasferimento di elettroni microbico atteso, qui come punto di partenza, si prega di fare riferimento alla letteratura recente.</li>
	<li>Avviare la cronoamperometria. Il software traccia un grafico della corrente misurata nel tempo, la corrente massima osservata (imax) è un importante parametro online, come discusso nelle sezioni 4 e 5. </li>
</ol>
4. Manutenzione del biofilm
<ol>
	<li>A seconda delle condizioni ambientali, ad esempio della temperatura, una corrente ossidativa inizia a fluire e raggiunge un plateau (vedi Figura 4). Dopo aver raggiunto nuovamente la corrente zero, mettere in pausa la misurazione cronoamperometrica e reintegrare la soluzione del fluido. Per una crescita più rapida del biofilm, sostituire il fluido subito dopo aver raggiunto il plateau della corrente massima. Aprire la porta di campionamento e con cautela, senza distruggere il biofilm sottile, scaricare il fluido. Durante il riempimento del fluido, sciacquare nuovamente con azoto. Chiudere la porta di campionamento e sigillare ermeticamente.</li>
	<li>Ripetere la procedura del punto 4.1. fino a quando la corrente ossidativa massima raggiunge uno stato stazionario (vedi Figura 4). 
	(Nota: si ritiene che una costante imax indichi una formazione stabile di biofilm allo stato stazionario.)</li>
	<li>Prelevare campioni da 1 ml della soluzione fresca e del terreno di scambio per l'analisi del substrato, ad esempio mediante HPLC. La concentrazione iniziale del substrato (acetato) (c 0) e la concentrazione della soluzione rimanente del substrato (c1) sono successivamente necessarie per i calcoli dell'efficienza (vedere la sezione Analisi dei dati). 
	Nota: Per ottenere risultati inalterati, ad esempio a causa di un ulteriore consumo di substrato, analizzare immediatamente i campioni di substrato. Se ciò non è possibile, conservare i campioni in un congelatore a una temperatura minima di -18 °C per non più di un mese.)</li>
</ol>
5. Applicazione della voltammetria ciclica per studiare l'EET
<ol>
	<li>Eseguire la voltammetria ciclica ai massimi e ai minimi del flusso di corrente come indicato (Figura 4). A seconda della domanda di interesse, il CV di solito viene eseguito quando il sistema ha raggiunto lo stato stazionario per ottenere risultati comparabili. (Nota: la generazione di corrente è definita condizioni di turnover ed è correlata all'ossidazione microbica del substrato e al successivo trasferimento di elettroni: bioelettrocatalisi microbica; mentre i CV senza turnover vengono eseguiti a un flusso di corrente (quasi) nullo nel CA.)</li>
	<li>Scegliere nel software di controllo del potenziostato la tecnica: Voltammetria ciclica, e impostare i parametri appropriati, qui ad esempio: Un potenziale iniziale da EWE a Ei di -0,5 V vs. RE con una velocità di scansione v=dE/dt di 1 mV/sec a un potenziale di vertice E1 di 0,3 V vs. RE e di nuovo al potenziale di partenza E2 = Ei di -0,5 V. 
Nota: Quando si utilizza la voltammetria ciclica, la tensione applicata al WE viene modificata linearmente con il tempo dal potenziostato (vedi Figura 5) - La casella 2 fornisce le regole di principio per la scelta dei parametri dell'esperimento e la risoluzione dei problemi).</li>
	<li>Avviare la voltammetria ciclica e registrare tutti i cicli necessari per eseguire un CV riproducibile. Di solito, sono necessari almeno 3 cicli. Il grafico risultante è chiamato voltammografia ciclica (vedere anche la Figura 7). Nota: A seconda delle condizioni di misurazione, è possibile ottenere informazioni diverse, come dimostrato nella sezione successiva.</li>
</ol>
6. Tracciamento dei dati
Qui viene discusso solo il tracciamento dei dati. Un trattato più dettagliato segue nella sezione successiva. 
<ol>
	<li>Utilizzare un software di analisi dei dati appropriato, qui tutti i dati vengono esportati come testo e importati come file ASCII.</li>
	<li>Calcola e usa preferenzialmente le densità di corrente (j) e non le correnti assolute (i). 
	(Nota: Tuttavia, poiché esistono diversi protocolli per il calcolo di j, chiarire quale è stato utilizzato. Qui la densità di corrente per geometrico, cioè proiettata, viene utilizzata la superficie dell'elettrodo.)</li>
	<li>Cronoamperometria: Traccia la densità di corrente misurata in funzione del tempo.</li>
	<li>Voltammetria ciclica: Traccia la densità di corrente misurata in funzione del potenziale del WE Ewe.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo presentato mostra un modo semplice e diretto per far crescere biofilm microbici elettroattivi da acque reflue inoculate utilizzando una configurazione a tre elettrodi in un reattore a lotti alimentati. La cronoamperometria consente la crescita e la selezione di biofilm microbici elettroattivi da diversi inoculi, nonché la caratterizzazione fondamentale dei biofilm in termini di massima densità di corrente ed efficienza coulombica. La voltammetria ciclica, essendo una tecnica non invasiva, consente di eseguire studi fondamentali sulla termodinamica EET del biofilm microbico e quindi di identificare possibili ed effettivi siti di trasferimento EET. Insieme, questi parametri consentono i) di caratterizzare e confrontare diversi biofilm microbici per condizioni identiche e ii) di studiare l'impatto di diverse condizioni operative su biofilm microbici elettroattivi identici. Tuttavia, questi esperimenti possono essere solo un punto di partenza. Da un lato, il campo multiforme della bioelettrochimica microbica richiede un ulteriore e approfondito sfruttamento di metodi e protocolli elettrochimici. Ciò include, ad esempio, modelli per l'estrazione di dati cinetici e meccanicistici, nonché altri metodi come la spettroscopia di impedenza elettrochimica34,35. D'altra parte, i metodi elettrochimici non possono fornire informazioni sulla natura molecolare, la composizione microbica, l'organizzazione microbica spaziale, ecc. Qui sono necessarie ulteriori tecniche non invasive e accoppiate all'elettrochimica o invasive4. Il riquadro 2 fornisce una breve discussione sui passaggi critici durante l'esecuzione degli esperimenti e sulla risoluzione iniziale dei problemi.

Dal punto di vista ingegneristico si deve tenere in considerazione che l'anodo di biofilm elettroattivo è solo un componente degli attuali sistemi bioelettrochimici microbici e una moltitudine di altri fattori deve essere analizzata per i sistemi completi36. Tuttavia, speriamo che questo video-articolo aiuti a comprendere e adattare in futuro gli elementi fondamentali del BES, ovvero gli elettrodi microbici.

La delucidazione dei fondamenti del trasferimento di elettroni extracellulari microbici (EET) e del suo sfruttamento nei sistemi ingegnerizzati è un campo vitale e in rapida crescita di ricerca e sviluppo1-3. Lo studio di questi microrganismi elettroattivi (o bioelettrocatalitici o elettrochimicamente attivi), compresi i ceppi puri così come le co-colture definite e i consorzi complessi, richiede un complesso arsenale di tecniche, metodi e protocolli4. Questi metodi derivano da diverse discipline scientifiche, ad esempio l'elettrochimica, la scienza dei materiali, la microbiologia, e forniscono informazioni su diversi livelli gerarchici, ad es. dall'intero biofilm microbico alle singole molecole. In questo modo, l'elettrochimica e i metodi elettrochimici rappresentano il fondamento di tutte le attività.
Tradizionalmente, le configurazioni del tipo a celle a combustibile venivano spesso utilizzate per la crescita e il mantenimento di colture microbiche elettroattive nell'archetipo di questi sistemi ingegnerizzati: celle a combustibile microbiche (MFC)5. Sfortunatamente, questi tipi di MFC spesso non consentivano il monitoraggio o il controllo del potenziale di un singolo elettrodo e quindi erano possibili solo informazioni limitate sui processi degli elettrodi: veniva riportata solo la tensione della cella. Ora è sempre più riconosciuto che il monitoraggio e il controllo individuale dei potenziali dei singoli elettrodi negli MFC rappresentano un chiaro vantaggio, non solo per la ricerca di base ma anche per l'ingegneria. Inoltre, con la diversificazione delle applicazioni delle tecnologie elettrochimiche microbiche che ora includono, ad esempio, la bonifica, la desalinizzazione, le sintesi e persino il biocomputing, nei cosiddetti sistemi bioelettrochimici microbici (BES)2,6,7, un controllo esterno dei singoli potenziali elettrodici è spesso sostanziale. Questo controllo si ottiene solitamente utilizzando fonti di alimentazione esterne o potenziostati. In questo modo, l'uso di potenziostati consente, a differenza di altri tipi di configurazioni, una regolazione esatta del potenziale del singolo elettrodo. Questo è di grande importanza in quanto l'elettrodo rappresenta l'accettore di elettroni microbico terminale (per gli anodi) o il donatore di elettroni (per i catodi) del trasferimento di elettroni extracellulare. La Figura 1 illustra lo stato attuale delle conoscenze sull'EET microbico agli anodi, vedere per i dettagli, ad esempio 2,4,6,8,9 L'EET al catodo è ancora per lo più non sfruttato10.
Quindi il controllo del potenziale dell'elettrodo consente non solo l'uso di condizioni di coltura microbica riproducibili, ma anche la sua personalizzazione in termini di termodinamica EET11. All'interno di questo articolo viene dimostrato come i parametri caratteristici dei biofilm microbici elettroattivi possano essere estratti da esperimenti di reattori alimentati utilizzando la cronoamperometria (CA) e la voltammetria ciclica (CV). Ciò include i parametri di prestazione, la densità di corrente massima (jmax) e l'efficienza coulombica (CE), nonché le caratteristiche EET. Qui l'identificazione dei potenziali formali (Ef) dei possibili ed effettivi siti di trasferimento di elettroni sarà focalizzata. L'estrazione di questi parametri è mostrata sull'esempio dei biofilm di coltura mista derivati dalle acque reflue che sono dominati da Geobacter spec. 12 Questi biofilm derivati dalle acque reflue vengono ottenuti mediante una semplice procedura di selezione elettrochimica, come dimostrato da numerosi gruppi di ricerca in tutto il mondo13-16.
Tecniche elettrochimiche dinamiche per studiare il trasferimento di elettroni extracellulari microbici
Per una caratterizzazione termodinamica dell'EET di colture microbiche elettroattive sono necessarie tecniche elettrochimiche dinamiche. In generale queste tecniche includono il potenziale controllato, cioè voltammetrico, e il controllo della corrente, cioè Galvanodinamica, tecniche17. Pertanto, le tecniche potenzialmente controllate sono più diffuse e includono, ad esempio, la voltammetria a onda quadra e la voltammetria a scansione lineare18. La più popolare, tuttavia, è la voltammetria ciclica (CV)19,20. La CV è ben nota e diffusa in diversi campi dell'elettrochimica che vanno dalla ricerca sulle batterie alla scienza dei materiali fino alla bioelettrochimica enzimatica21. La sua applicazione alle cellule microbiche viventi può essere fatta risalire solo a più di un decennio22 e aumenta significativamente negli ultimi anni23,24. In particolare, la combinazione di CV e metodi spettroscopici ha fornito intuizioni senza precedenti sui meccanismi dell'EET e sulla sua natura molecolare, ad esempio.25,26 Parallelamente, il quadro teorico per l'estrazione delle caratteristiche termodinamiche e teoriche dell'EET microbico è stato ampliato e approfondito27-30. Al contrario, tuttavia, una cattiva gestione sperimentale o un'analisi inadeguata dei dati spesso ostacolano l'applicazione appropriata della CV nel campo della bioelettrochimica microbica. Pertanto, oltre ai workshop (ad esempio all'EU-ISMET 2012) e ai tutorial19, questo video-articolo fornirà una guida di base per la conduzione di esperimenti voltammetrici ciclici su batteri elettroattivi. In tal modo si sta concentrando sulle fasi sperimentali di base e sull'analisi fondamentale dei dati e non intende fornire i più recenti protocolli di analisi cinetica. I termini più importanti per la discussione che segue sono riassunti nel riquadro 1 (adattato da Harnisch e Freguia19 e modificato).

<table><tbody><tr><td>Acque reflue primarie</td> Impianto <td></td><td>di trattamento delle acque reflue</td><td>Prelevato dopo la filtrazione meccanica</td></tr><tr><td>250 ml Palloni a fondo tondo con tre ingressi aggiuntivi</td><td>Th.Geyer Berlin GmbH, Germania</td><td>9.011 845</td><td>Ingressi aggiuntivi sono stati fissati dal nostro</td></tr><tr><td>elettrodo di riferimento Ag/AgCl per soffiatore di vetro interno (KCl sat., 0,195 V vs. SHE) con membrana in ceramica</td><td>Sensortechnik Meinsberg, Germania</td><td>SE 11</td><td></td></tr><tr><td>Barre di grafite (&Oslash;=1 cm, l=3 e 5 cm)</td><td>CP-Handels-GmbH, Wachtberg, Germania</td><td></td><td>Utilizzato come materiale dell'elettrodo</td></tr><tr><td>Acciaio inossidabile, n. 1.4301, filo Fe/Cr18/Ni10</td><td>Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germania</td><td>155-923-05</td><td></td></tr><tr><td>Tappi in silicone</td><td>Th.Geyer Berlin GmbH, Germania</td><td>9.230 512 e</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>neoLab, Heidelberg, Germania</td><td>3-1011</td><td>Per la sigillatura per mantenere le condizioni anaerobiche</td></tr><tr><td>Potenziostato/ Galvanostato Modello MPG2</td><td>BioLogic Science Instruments, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EC-Lab</td><td>BioLogic Science Instruments, Francia</td><td></td><td>Software per l'esecuzione di misure elettrochimiche</td></tr><tr><td>Origin 8.6</td><td>Software di analisi dei dati</td> <td>OriginLab</td><td></td></tr></tbody></table>

biofilm microbici elettroattivi derivati dalle acque reflue: crescita, mantenimento e caratterizzazione di base

Waste Water Derived Electroactive Microbial Biofilms: Growth, Maintenance, and Basic Characterization

La crescita di biofilm microbici elettroattivi anodici da inoculi di acque reflue in un reattore a batch alimentato è dimostrata utilizzando una configurazione a tre elettrodi controllata da un potenziostato. In questo modo, l'uso di potenziostati consente una regolazione esatta del potenziale dell'elettrodo e garantisce condizioni di coltura microbica riproducibili. Durante la crescita, la produzione attuale viene monitorata mediante cronoamperometria (CA). Sulla base di questi dati, la massima densità di corrente (jmax) e l'efficienza coulombica (CE) sono discusse come misure per la caratterizzazione delle prestazioni bioelettrocatalitiche. La voltammetria ciclica (CV), un metodo non distruttivo, cioè metodo non invasivo, viene utilizzato per studiare il trasferimento di elettroni extracellulare (EET) di batteri elettroattivi. Le misure CV vengono eseguite su elettrodi di biofilm anodico in presenza del substrato microbico, es. condizioni di rotazione, e in assenza del substrato, cioè condizioni di non rotazione, utilizzando diverse velocità di scansione. Successivamente, viene esemplificata l'analisi dei dati e vengono derivati e spiegati i parametri termodinamici fondamentali dell'EET microbico: potenziale di picco (Ep), densità di corrente di picco (jp), potenziale formale (Ef) e separazione di picco (ΔEp). Inoltre, vengono affrontati i limiti del metodo e lo stato dell'arte dell'analisi dei dati. In questo modo questo video-articolo fornirà una guida per le fasi sperimentali di base e l'analisi fondamentale dei dati.

Viene dimostrata la crescita cronoamperometrica di biofilm microbici elettroattivi anodici in un reattore a batch alimentato utilizzando una configurazione a tre elettrodi, controllata da un potenziostato. Il trasferimento extracellulare di elettroni è caratterizzato mediante voltammetria ciclica in presenza del donatore di elettroni e in assenza del donatore di elettroni. Viene dimostrata l'analisi fondamentale dei dati.

Biofilm microbici elettroattivi derivati dalle acque reflue: crescita, mantenimento e caratterizzazione di base

The growth of anodic electroactive microbial biofilms from waste water inocula in a fed-batch reactor is demonstrated using a three-electrode setup ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere un biofilm microbico elettroattivo anodico dall'inoculo delle acque reflue e di caratterizzare le sue proprietà bioelettrocatalitiche. Ciò si ottiene impostando, inoculando e avviando un potenziale reattore batch alimentato elettrochimicamente bio controllato staticamente. Il secondo passo consiste nel monitorare la produzione attuale utilizzando la pirometria Krono.Successivamente, il mezzo viene sostituito regolarmente dopo l'esaurimento del substrato fino a raggiungere una densità di corrente massima riproducibile, che rappresenta una formazione di biofilm allo stato stazionario. Il passo finale consiste nello studiare il trasferimento elettronico extracellulare di batteri elettroattivi utilizzando la telemetria vol ciclica durante la presenza e l'assenza del substrato. In definitiva, l'analisi dei dati fornisce informazioni fondamentali sulla termodinamica del trasferimento di elettroni microbici e consente di determinare il potenziale formale dei possibili ed effettivi siti di trasferimento di elettroni extracellulari.Il vantaggio principale di questa tecnica è che si possono ottenere informazioni dirette sul trasferimento di elettroni tra microrganismi ed elettrodi solidi, e quindi ricavare informazioni fondamentali sul trasferimento di elettroni extracellulari microbici. In generale, le persone che non conoscono il metodo avranno difficoltà con la scelta dei parametri corretti e l'interpretazione corretta del grafico derivato. Durante l'acquisizione e l'analisi dei dati, possono essere commessi gravi errori.Prima di iniziare questa procedura, preparare una quantità adeguata di terreno di coltura utilizzando un tampone fosfato, includendo ulteriori nutrienti secondo il seguente riferimento. Utilizzare 10 millimolari di acetato di sodio come substrato. Aggiungere un millilitro di acque reflue primarie per 20 millilitri di crescita, mezzo come inoculo.Quindi inserire un ago nel terreno e sciacquarlo con azoto per almeno mezz'ora. Per disaerarlo durante il lavaggio con azoto, misurare la dimensione dell'elettrodo per la configurazione a tre elettrodi. Inserire l'elettrodo di lavoro, il controelettrodo e l'elettrodo di riferimento in un pallone a fondo tondo modificato a quattro colli da 250 millilitri tramite tappi in silicone.Avvolgere i tappi in silicone con paraform per sigillare il sistema durante il lavaggio con azoto. Versare 250 millilitri del terreno di coltura e della miscela di inoculo attraverso la porta di campionamento nel reattore. Chiudere la porta di campionamento con un tappo in silicone e sigillarla ermeticamente con perfil.Posizionare il recipiente in una camera a temperatura controllata di 35 gradi Celsius per garantire condizioni ambientali costanti. Quindi, collegare gli elettrodi ai rispettivi cavi dello statista di potenziale. Apri il software per controllare la statistica potenziale e scegli la tecnica.Cronopirometria. Impostare l'elettrodo di lavoro su un potenziale costante di 0,2 volt per una durata di 500 ore registrando ogni 600 secondi successivi, avviare la cronopirometria e osservare il grafico della corrente misurata nel tempo. Dopo aver calcolato le densità di corrente preferenziali, tracciare la densità di corrente misurata in funzione del tempo.Dopo che la corrente ossidativa ha raggiunto un plateau e ritorna alla corrente zero, mettere in pausa la misurazione metrica dell'ampere crono per uno scambio medio. Pertanto, trasferire il recipiente in una scatola a flusso laminare e lavare il sistema con azoto. Scaricare con cautela il terreno e rabboccare con terreno fresco disaerato dopo il rabbocco del terreno.Chiudere la porta di campionamento e sigillarla con paraforma. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando la corrente ossidativa massima raggiunge uno stato stazionario Dopo ogni ciclo di crescita, prelevare un campione da un millilitro delle soluzioni fresche e del terreno di scambio per l'analisi del substrato mediante HPLC. Per studiare il trasferimento di elettroni extracellulari, selezionare la tecnica di telemetria a volume ciclico nel software di controllo dei potenziali stat.Quindi impostare il potenziale iniziale EI dell'elettrodo di lavoro a 0,5 volt negativi rispetto all'elettrodo di riferimento, il potenziale di vertice E da uno a 0,3 volt e il potenziale finale E da due a 0,5 volt negativi. Utilizzare una velocità di scansione di un millivolt al secondo. Avviare l'esperimento e registrare almeno tre cicli per ottenere un cv riproducibile.Dopo aver calcolato le densità di corrente preferenziali, tracciare la densità di corrente misurata in funzione del potenziale dell'elettrodo di lavoro. Dalle misurazioni cronometriche, è possibile misurare la densità di corrente massima e l'efficienza di Kula. Qui è mostrata una tipica curva cronometrica di crescita del biofilm di diversi cicli di crescita utilizzando un reattore batch alimentato.Dopo la fase iniziale di ritardo, inizia un primo massimo di densità di corrente, quindi la corrente diminuisce fino a quasi zero flusso di corrente a causa dell'esaurimento del substrato. Successivo al rifornimento del substrato. La densità di corrente aumenta di nuovo con una densità di corrente massima più elevata.Dopo diversi cicli di crescita, la densità di corrente massima è costante, il che indica una formazione di biofilm allo stato stazionario. Come massimo dello stato stazionario. Il valore della densità di corrente dipende da diversi parametri.È spesso considerato una caratteristica dei sistemi di elettrodi elettrodinamici a biofilm microbico. La seconda caratteristica operativa è l'efficienza omica, che è il numero di elettroni registrati come flusso di corrente elettrica per ciclo batch alimentato in relazione al numero massimo teorico di elettroni. Vedere il protocollo di testo per i dettagli su come calcolare l'efficienza della chiamata, il flusso di corrente elettrica e il numero massimo teorico di elettroni mostrato.Ecco un tipico CV per le condizioni di non turnover. A una velocità di scansione elevata, viene raffigurato il CV di un biofilm per velocità di scansione elevate in cui è possibile identificare solo una coppia di picchi e quindi un potenziale EF formale. Qui. In generale, il potenziale formale di una coppia redox può essere calcolato dal potenziale di picco del picco di ossidazione EPA e dal picco di riduzione della rispettiva specie EPC.Formando la media aritmetica, vedere il protocollo di testo per i dettagli su come calcolare il potenziale formale. Quando si applica una velocità di scansione sufficientemente bassa allo stesso biofilm, è possibile identificare fino a quattro coppie di ossidoriduzione. Tuttavia, il CV di non turnover mostra solo tutti i composti attivi redox sull'elettrodo, e quindi l'EF dei possibili siti di trasferimento elettronico extracellulare.Solo l'analisi del CV di fatturato fornisce l'EF dei siti EET effettivi quando si analizzano ulteriormente i CV non fatturati. È possibile analizzare altri parametri caratteristici come la separazione dei picchi, la corrente di picco massima e la densità di corrente di picco minima. Questi parametri, soprattutto se registrati per diverse velocità di scansione, possono essere utilizzati per analisi meccanicistiche e cinetiche dei processi di trasferimento di elettroni sugli elettrodi.Tuttavia, questa analisi cinetica, ben consolidata per i sistemi chimici, non è semplice per i biofilm microbici elettroattivi. Quando si esegue la misurazione CV in presenza di substrato, si ottiene un CV di turnover. Dopo aver tracciato i dati, si osserva la tipica curva bioelettroelettrocatalitica a forma di S.Analizzando ulteriormente i dati, il massimo della derivata prima o il punto di flesso della curva fornisce l'EF potenziale formale dei siti EET effettivi. Nel caso di un biofilm dominato da un sottile rapporto geobatterico, si possono osservare due punti di flesso. Successivamente, la derivata mostra due massimi corrispondenti al potenziale formale dei siti EET attivi bio elettrocatalitici, che sono denominati rispettivamente come EF due e EF tre.Questa scoperta mostra anche che i processi redox associati ai potenziali formali EF uno e EF quattro non sono correlati alla bioelettrolisi. Man mano che il biofilm cresce e diventa più spesso, il CV mostra un solo punto di flesso. Questo potenziale formale EEF negativo 0,32 volt rispetto all'argento, cloruro d'argento è approssimativamente uguale alla media aritmetica dei due potenziali formali assegnati all'EET del biofilm sottile.Questo risultato mostra che l'analisi CV fondamentale fornisce informazioni sulla termodinamica EET in modo rapido e non invasivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere facilmente adattata a diversi sistemi di interesse e, a seconda dei dati, consente una diversa profondità di analisi dei dati se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura e apprendendo le basi della geometria del biofilm microbico, si possono facilmente apprendere altri metodi come la telemetria a onda quadra o la spettroscopia di impedenza elettrochimica, nonché un'analisi approfondita dei dati.

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