A Single-fly saggio per comportamento alimentare in Drosophila

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i cambiamenti comportamentali innescati dalla privazione di cibo nella mosca adulta Salala Melanogaster. Ciò si ottiene facendo morire di fame le mosche per 18-24 ore. Il secondo passo consiste nel caricare le singole mosche in camere comportamentali, ognuna delle quali contiene una fonte di odore attraente al centro.

Successivamente, un sistema informatico con una fotocamera digitale traccia la posizione di ogni mosca nel tempo e registra. Le sue coordinate per la successiva analisi dei dati. Il passaggio finale consiste nel determinare la latenza di ogni mosca per raggiungere la fonte dell'odore utilizzando un software personalizzato.

In definitiva, questo saggio del comportamento di ricerca del cibo ad alto rendimento può essere utilizzato per studiare la relazione tra la funzione del circuito neurale e le risposte comportamentali. Il vantaggio principale di questo test rispetto al metodo esistente, come i compagni di squadra, è che quantifica il comportamento chemiotattico nei singoli moscerini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande in neurobiologia, come ad esempio quali circuiti neurologici sono importanti per il comportamento chemiotattico e come questi circuiti neurologici sono moderati dallo stato fisiologico interno dell'animale.

L'obiettivo di questo metodo è ottenere grandi set di dati comportamentali in breve tempo. Sebbene questo metodo ci abbia fornito informazioni sul comportamento di foraggiamento, può anche essere utilizzato per studiare altri comportamenti come la localizzazione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

La corretta gestione delle mosche e l'esecuzione del software del computer sono entrambi essenziali per il successo di questo esperimento. In generale, le persone che si avvicinano per la prima volta a questo metodo possono avere un po' di difficoltà all'inizio perché ci vuole un po' di tempo e pazienza per imparare a maneggiare le mosche con delicatezza, dimostrando che la procedura sarà intorno all'ago. Raggiungi un tecnico per il mio laboratorio Prima della raccolta delle mosche.

Allevare le mosche sperimentali in condizioni di temperatura e umidità controllate con un ciclo di buio e luce di 12 ore. Il giorno dell'esplosione dell'EEC, anestetizzare le mosche sotto l'anidride carbonica prima di asessuarle al microscopio. Diversi criteri di base possono essere utilizzati per distinguere tra maschi e femmine.

I maschi hanno una macchia di setole nere sulle quattro zampe chiamate pettini sessuali che le femmine non hanno. Inoltre, la punta dell'addome maschile è coperta da una cuticola scura e mostra genitali che non si vedono nelle femmine, raccogli le mosche femmine e mettile insieme a quattro o cinque maschi dagli occhi bianchi in nuovi file alimentari con un massimo di 30 mosche per età della fiala. Le mosche per due o cinque giorni preparano le camere per la fame di mosche spingendo prima un singolo fazzoletto sul fondo di una fiala di plastica vuota, immergendo completamente il tessuto con acqua distillata.

Quindi utilizzare un oggetto per spingere verso il basso il fazzoletto e strizzare delicatamente l'acqua in eccesso. Capovolgere la fiala per eliminare l'acqua in eccesso. Dovrebbe esserci abbastanza acqua per mantenere le mosche idratate e la camera di fame umida, ma non abbastanza per affogare le mosche.

Circa 18-24 ore prima dell'inizio dell'esperimento, trasferire le mosche dalla fiala di cibo in una camera di fame e tappare la fiala. Conservare le fiale a temperatura e umidità controllate per una notte fino all'inizio dell'esperimento. Preparare una soluzione agro all'1% aggiungendo 100 milligrammi di aros a bassa temperatura di fusione a 10 millilitri di acqua distillata.

In un pallone di vetro. Scaldare la soluzione agro in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire, ma prima che bolle, fermare il microonde e far roteare il pallone una volta. Ripeti questo passaggio altre due volte fino a quando l'aros non si è completamente sciolto.

Mantenere la soluzione di Aros allo stato liquido mantenendo il pallone caldo su una piastra calda. Impostato a 50 gradi Celsius, aggiungere 990 microlitri della soluzione all'1% aro e 10 microlitri di aceto di sidro di mele a un tubo DF capovolto da 1,5 millilitri. Per preparare una soluzione di aceto di sidro di mele all'1%, agitare la soluzione fino a quando non si mescola prima di metterla in un'incubatrice a bagno secco impostata a 50 gradi Celsius, impostare la sala prove alle condizioni desiderate come temperatura e umidità.

Accendi il pannello LED a 660 nanometri. Sciacquare i setacci e le piastre di prova con acqua calda e scaldarli in un forno di essiccazione fino a quando tutta l'umidità non sarà evaporata. Bello. I setacci e le piastre fino alla temperatura della camera di prova.

Prima di iniziare gli esperimenti, posizionare un piatto poco profondo sopra la piastra del diffusore e riempirlo d'acqua per aumentare l'umidità locale e mascherare l'acqua nella gocciolina di aros. Infine, posizionare i setacci sopra la ciotola dell'acqua. La piastra di prova è realizzata in acrilico trasparente ed è composta da sei arene di prova.

Un cursore contiene camere di contenimento che consentono il caricamento al volo, il contenimento temporaneo e il rilascio simultaneo di sei mosche nelle rispettive camere. All'inizio dell'esperimento, i mirini incisi al centro di ogni arena nella piastra indicano che gli odori devono essere pipettati. Inserire i cursori nella piastra di prova in acrilico.

Far scorrere delicatamente l'aspiratore nella fiala oltre il tappo di cotone e lasciare che circa sei mosche entrino nell'aspiratore. È fondamentale essere il più delicati possibile nel maneggiarli. Si può sfruttare la tattica fotografica, il comportamento delle mosche per indurre le mosche, camminare verso l'aspiratore puntando l'apertura della fiala verso una fonte di luce fioca.

Se necessario, è possibile applicare un'aspirazione delicata per aspirare circa sei mosche femmine. Evita di selezionare mosche maschi dagli occhi bianchi. Inserire la punta dell'aspiratore nel primo foro della piastra di prova.

Lascia che una singola mosca passi nella cella di contenimento e fai avanzare delicatamente il cursore in avanti per caricare un'altra mosca nel foro successivo. Continuare fino a quando non vola. Occupare tutte e sei le celle di supporto della piastra.

Quindi pipettare cinque microlitri di una soluzione di agarro all'aceto di sidro di mele all'1% direttamente al centro del mirino sulla faccia interna della piastra di prova. Per centrare la piastra di prova, aprire il file denominato Strumento di posizionamento vi. Esegui il file facendo clic sulla freccia bianca nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.

Posizionare la piastra di prova sopra il sib in modo che l'apertura dell'arena sia rivolta verso il pavimento SIV e il bersaglio dell'odore sia sul soffitto della piastra. Allineare il mirino della piastra di prova con le arie trasversali sullo schermo del monitor quando l'allineamento è stato completato. Interrompi l'esecuzione facendo clic sul punto rosso situato vicino all'angolo in alto a sinistra del monitor per tracciare e registrare le coordinate del volo.

Durante ogni prova di ricerca alimentare, aprire il file del software di acquisizione. Fly tracking six vi. Esegui il file facendo clic sulla freccia bianca nell'angolo in alto a sinistra del monitor.

Assegnare un nome al file, quindi fare clic su OK. Fai avanzare i cursori nelle camere di prova per rilasciare le mosche nelle arene di prova. Fare attenzione a non spostare le camere di prova in quanto ciò comporterebbe una registrazione impropria delle coordinate.

Fare clic su Start e assicurarsi che l'unica fonte di luce nella camera di prova sia il pannello LED. Al termine della prova, rimuovere il setaccio e la camera di comportamento. Sollevare la piastra di prova dal setaccio e rimuovere le mosche immergendo la piastra nel ghiaccio.

Pulire delicatamente la piastra con acqua calda e rimuovere eventuali residui di agros. Mettere le piastre di prova in un forno di essiccazione per rimuovere l'umidità. Ventilare l'area di prova accendendo una piccola ventola per circa due minuti.

Spegnere la ventola e caricare il gruppo successivo di mosche nella piastra di prova successiva. Procedere all'esecuzione dell'analisi dei dati utilizzando un software personalizzato come descritto nel protocollo di testo. Il software di analisi dei dati e il layout vengono utilizzati per valutare le prestazioni di ogni mosca durante i suoi 10 minuti di prova secondo una serie di criteri di analisi.

Questi criteri vengono utilizzati per determinare se i dati di ciascuna mosca verranno utilizzati per l'analisi dei dati e sono progettati per eliminare quelle mosche che non sono in grado di eseguire l'attività di ricerca del cibo a causa di lesioni, malattie, stress o mancanza di motivazione, le mosche che rimangono inattive per più di 300 secondi sono considerate inattive e vengono rifiutate dal set di dati a meno che non siano già riuscite a localizzare la fonte di cibo o il reperto. Una velocità media superiore a 10 millimetri al secondo per almeno 100 secondi dopo il periodo di inattività per selezionare solo quelle mosche che mostrano velocità sane durante le prime fasi dell'odore attivo. Le mosche che si muovono entro un certo intervallo di velocità per i primi 50 secondi della prova sono accettate per l'analisi dei dati, le mosche che non si muovono attraverso tutti e quattro i quadranti nell'arena e si dirigono direttamente verso la fonte di cibo dopo l'inizio della prova vengono respinte.

Si ritiene che le mosche che si avvicinano e si allontanano dalla fonte di cibo entro un raggio di 10 millimetri per un minimo di 50 secondi abbiano trovato con successo la fonte di cibo. Il grafico che descrive la distanza della mosca dalla fonte dell'odore nel tempo può essere utilizzato per valutare questo raro caso di arene con artefatti visibili in posizione di mosca. Anche la traccia viene rifiutata.

Gli artefatti possono essere creati da qualsiasi evento in cui il software di acquisizione dati rileva un oggetto diverso dalla mosca. Spesso appaiono come lunghe linee rette che attraversano l'arena o si irradiano dal suo centro. I moscerini adulti affamati da 18 a 24 ore mostrano una maggiore sensibilità olfattiva agli odori legati al cibo rispetto alle loro controparti nutrite.

Un grafico della percentuale cumulativa di mosche che individuano con successo una fonte di odore di cibo mostra che il 30% di tutte le mosche affamate riesce entro una finestra di 10 minuti. Al contrario, solo il 7% di tutte le mosche nutrite lo fa. Le mosche affamate dovrebbero mostrare un'attrazione significativamente maggiore per l'aceto rispetto a un veicolo agricolo da solo, e questa osservazione può essere utilizzata per risolvere le condizioni di test.

Ad esempio, quando questo esperimento di ricerca alimentare che è stato eseguito a 32 gradi Celsius con un'umidità ambientale del 35% utilizzando mosche di tipo selvatico, non è stata rilevata alcuna differenza significativa tra l'attrazione delle mosche per l'aceto e il controllo dell'aros, ciò è probabilmente dovuto a una crescente attrazione per l'acqua che si trova nella gocciolina di agros a temperature di prova più calde. Aumentando l'umidità del test tra il 50 e il 60%, questo cambiamento comportamentale è stato corretto ed è stata ripristinata la differenza significativa tra l'attrazione per l'aceto e il veicolo agros. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12, compresa la prova sperimentale di 10 minuti se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare le mosche con molta delicatezza per evitare di ferirle o disturbarle. Si prega di ricordare che le piastre di prova e i setacci di prova possono essere estremamente caldi quando si trovano nel forno di essiccazione, e quindi devono essere rimossi mentre si indossano guanti da forno dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare i comportamenti chemiotattici.

Questa tecnica può anche essere adattata per studiare la capacità della mosca di localizzare altri oggetti odorosi. Ad esempio, può essere applicato allo studio del comportamento di localizzazione del compagno nei moscerini maschi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come prepararti per l'esperimento, regolare le condizioni sperimentali, eseguire l'esperimento e analizzare le prestazioni di ogni mosca, che alla fine ti fornirà un grafico cumulativo che mostra la percentuale di mosche che hanno localizzato con successo la fonte dell'odore.