Name: Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Impara a misurare il calcio totale in neuroni coltivati mediante microanalisi a sonda elettronica (EPMA). Questa tecnica di criomicroscopia elettronica consente analisi quantitative a risoluzione subcellulare per studiare la segnalazione del calcio.

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Vorremmo ringraziare la signora Christine A. Winters per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Programma Neuroscienze di base del Intramurale Programma di Ricerca NINDS, NIH (Z01 NS002610).

L&#39;approccio qui descritto è stato sviluppato utilizzando strumenti specifici, strumenti e software. Dato che i laboratori non utilizzano lo stesso setup sperimentale l&#39;approccio è generalizzata, ove possibile. 1. Congelamento rapido Il metodo analitico descritto è assolutamente dipendente approcci criogenici per: 1) il &quot;cryofixation&quot; di cellule o tessuti in modo da preservare quantitativamente la distribuzione dei componenti del tessuto diffusibili e degli elementi chimici come erano in cellule vive nell&#39;istante di congelamento e 2) la preparazione degli ultraleggeri criosezioni adatto per l&#39;imaging e analisi in un TEM. Queste tecniche sono brevemente descritti, ma i dettagli necessari a riprodurre tali procedure in altri laboratori sono oltre la portata di questo articolo. I lettori interessati sono indicati eccellenti articoli recenti 9,14. Attenzione: Questa sezione descrive l&#39;uso di sapone liquidetano efied, che è altamente infiammabile ed esplosiva, devono essere prese le opportune precauzioni. L&#39;operatore deve anche avere familiarità con azoto liquido (LN 2) precauzioni di sicurezza, tra cui protezione da laboratorio camice, occhiali e guanti cryoresistant. Nota: Qui e in tutto, tutti gli strumenti (pinze, ecc) utilizzati per gestire i campioni congelati devono essere pre-raffreddata in LN 2 prima dell&#39;uso per evitare lo scongelamento accidentale. Cellule coltivate su vetrini <ol><li> Preparare un dispositivo congelamento tuffo condensando etano gassoso a -160 ° C in LN 2-raffreddato pozzetto centrale. Riempire fino al segno e coprire il pozzo con il coperchio di alluminio basculante quando non in uso. </li><li> Utilizzando cunei di carta da filtro, macchia lamelle di plastica di cellule coltivate in sperimentalmente condizioni adeguate per un film acquoso sottile. Tamponare dal bordo in modo da non toccare il tessuto, la pellicola residua ideale, determinato per tentativi ed errori, è il più sottile possibile, ma non così thcome evaporare e permettere l&#39;essiccazione della superficie del tessuto. </li><li> Tenendo il vetrino per il bordo con una pinza di serraggio, immergere subito in etano liquido, manualmente o utilizzando lo stantuffo-gravità alimentati. </li><li> Posizionare il vetrino congelato in una ciotola polistirolo nelle vicinanze di LN 2, grande abbastanza per manipolare il numero desiderato di vetrini in contenitori di stoccaggio a lungo termine. Barattoli con tappo a vite di alluminio che non colgono sotto LN 2 sono raccomandati. </li></ol> Congelamento rapido di fette di cervello in coltura <ol start="5"><li> Sotto un microscopio da dissezione, vista e orientare una fetta dell&#39;ippocampo organotipica, indisturbato e ancora attaccato alla membrana inserto cultura. Posizionare punti di riferimento sulla membrana vicino al bordo della fetta con una penna Sharpie tipo nero e fotografia. </li><li> Sempre sotto il microscopio, tagliare ca. 5 x 5 millimetri quadrati di membrana con le singole sezioni incentrate sulle piazze. Evitare di toccare la fetta o piegare il membrane. </li><li> Montare una fetta membrana sostenuta, ammortizzato da un ¼ in rilievo diametro agar, su un disco in alluminio progettata su misura per adattarsi a una cryoultramicrotome (descritto di seguito). Rapidamente congelare la fetta da pneumaticamente propulsione contro un blocco di zaffiro LN 2-raffreddato per mezzo di un dispositivo personalizzato &quot;sbattere di congelamento&quot;. </li><li> Sposta in memoria come descritto per cellule in coltura. </li></ol> 2. Criosezionamento CAVEAT: produrre con successo nastri secco taglio di sezioni ultrasottili, mentre la semplice e logica, richiede una formazione, pazienza e una notevole pratica. <ol><li> Cuocere un cryoultramicrotome dotato di cryoattachment e raffreddare a -135 ° C. </li><li> Tagliare coprioggetto congelati in ca. 3 x 3 millimetri quadrati con un forte, bisturi preraffreddato. Incorporare pezzi con culture rivolta verso l&#39;alto in un liquido viscoso &quot;cryoglue&quot; (a 1:06 miscela di etanolo e 2-propanolo 11), sullo standard 3mm perni in alluminio di diametro progettato per adattarsi mandrino provino microtomo. Evitare perdite cryoglue sulla superficie cultura. Solidificare cryoglue abbassando la temperatura cryobox a ≤ -160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Per sezioni di cervello congelati, fissare saldamente dischi direttamente ad un esemplare mandrino su misura per mezzo di una ghiera filettata. </li></ul></li><li> Trim aree selezionate dei campioni congelati - ad esempio, spazi ricchi di cellule di pezzi coprioggetto o aree individuate di fette - un ca. Blocco 250 x 250 micron viso e ~ 100 micron di profondità utilizzando un utensile diamantato taglio. </li><li> Nastri secco taglio di sezioni sottili a ca. -160 ° C utilizzando un diamante cryoknife 35 °, essenzialmente come descritto nel referencs 4, 9. Velocità di taglio e coltello angolo di spoglia sono determinati empiricamente, un buon punto di partenza è 0,4-0,6 mm / sec a 9 °. Lo spessore nominale, cioè esemplare anticipo, di sezioni idratati is tipicamente 80 nm, sebbene sezioni sono in realtà 1.5-2.0x spessa, principalmente a causa della compressione. Per sezionamento soddisfacenti, un dispositivo antistatico è essenziale. Posizionare la punta ionizzante dei dispositivi di 0,5-1 cm dal bordo coltello e regolare la potenza di uscita fino a quando si producono nastri soddisfacenti sezioni. </li><li> Preparare le sonde ciglia per incollaggio (con resina epossidica) ciglia legno stick applicatori. Utilizzando tale sonda, pick up e trasferimento sezioni dal retro del coltello Onto, film di sostegno pioloform carbonio rivestite glow-scarica espressi oltre 100 maglie griglie di rame piegatura e di riposo su un indio busta mezzo foglio ripiegato su una mensola di lavoro alle spalle il coltello. Ripiegare la metà superiore della griglia e busta, stampa con uno strumento di spremitura a freddo. </li><li> Trasferimento griglie avvolto ad una casella della griglia comoda e conservare in un alluminio possono come descritto al punto 1.4. </li></ol> 3. Cryotransfer dei campioni al microscopio elettronico Lo strumento di base per EPMAin questo laboratorio è un microscopio elettronico analitica operati a 120 kV e attrezzato per cryomicroscopy, cioè, progettato con un aspirapolvere, campione-zona anticontaminator, una fotocamera digitale 2k x 2k alta sensibilità e titolare cryotransfer campione. Controllare in anticipo l&#39;allineamento microscopio e condizioni di funzionamento in entrambe le modalità a basso e ad alto ingrandimento e confermare una colonna sotto vuoto soddisfacente, idealmente ≤ 10 -7 Torr. Tune up, se necessario. <ol><li> Verificare che l&#39;isolamento sotto vuoto del componente Dewar del cryoholder è soddisfacente. Pompa, se necessario. </li><li> Raffreddare il cryoholder alla sua temperatura minima, almeno -160 ° C, mentre sotto alto vuoto all&#39;interno del portaoggetti, scollegare il cavo di collegamento al detentore di sua scatola di controllo. Inclinare il goniometro di 45 ° in senso orario prima di rimuovere il supporto per ridurre al minimo LN 2 spargimento sulle superfici dell&#39;operatore e del microscopio. </li><li> Preparare la cryoworkstation banco raffreddando il insulate integraled coppa a ≤ 160 ° C. </li><li> Transfer (quickly!) il cryoholder raffreddato da microscopio per crio workstation. Ritrarre scudo gelo del titolare. </li><li> Recupera sotto LN 2, un panino griglia di stoccaggio e posto sul tavolo di lavoro del cryoworkstation. Un anello di arresto per pozzetto del titolare è anche posto sul tavolo. </li><li> Aprire la busta indio e spostare la griglia pieghevole allegato al pozzo esemplare di cryoholder. Fissare la griglia con anello di sicurezza utilizzando lo strumento chiave in dotazione e chiudere lo scudo gelo. </li><li> Rimuovere rapidamente il cryoholder dal cryoworkstation e inserire nella camera d&#39;equilibrio del microscopio e passare attraverso la sequenza di pompaggio più rapidamente possibile. Sull&#39;inserimento, ci dovrebbe essere il minimo disturbo del vuoto colonna. </li><li> Goniometro Ritorna a 0 ° di inclinazione. Riconnettersi e ricaricarsi la scatola di controllo e verificare che la temperatura del campione è ≤ 150 ° C. </li><li> Riempire il Dewar deldel campione titolare e permettono vuoto e temperatura a recuperare pienamente. </li></ol> 4. Indagine visiva delle sezioni <ol><li> Ritrarre lo scudo gelo del titolare di esporre campioni e accendere il fascio di elettroni. </li><li> Visivamente valutare il campione a basso ingrandimento, tipicamente 250X, e scarsa illuminazione. Come illustrato nella Figura 1, sezioni devono essere sottile e liscia, non piegata o sovrapposte, piana e ben attaccato alla pellicola di supporto, e generalmente non oscurata da sbarre di griglia. </li><li> Facoltativamente fotografare sezioni selezionate. (NOTA: Ridurre al minimo l&#39;esposizione del fascio, in quanto sezioni congelate-idrato sono molto sensibili ai danni fascio-indotta.) Utilizzare il palco goniometro digitale automatizzati atti a memorizzare le coordinate delle sezioni selezionate. </li></ol> 5. Liofilizzazione delle sezioni <ol><li> Liofilizzare sezioni aumentando la temperatura detentore di ca. -100 ° C per ~ 30 min. </li><li> Recool detentore di -160 ° C o al di sotto. </li><li&gt; Prima di imaging, spegnere centralina cryoholder e cavo del controller fisicamente disconnessione per evitare la deriva immagine a causa di cicli termici e / o pick-up vibrazione. </li></ol> 6. Imaging di cellule e gli organelli Immagini strutturali delle sezioni liofilizzati sono ottenuti a ca. -160 ° C a basso dosaggio, immagini di zero-perdita registrata digitalmente utilizzando una camera CCD slow-scan 2k x 2k controllato dal software appropriato. <ol><li> Attivare la EM in modalità hi-mag. </li><li> Scegli e immagini a ~ 2.000 X (come TIFF, vedi figura 2) celle selezionate e le aree subcellulare di interesse nelle sezioni di alta qualità, le cui riprese sono stati precedentemente registrato e memorizzato. (NOTA: Le sezioni secche sono ora sostanzialmente meno fragile e meno suscettibile ai danni di elettroni fascio. </li><li> Valutare le immagini al fine di selezionare le regioni di interesse (ROI) per l&#39;analisi a raggi X. Questo passaggio può facoltativamente essere effettuata fuori linea, nel qual caso l&#39;EM può essere attivataoff e il campione lasciata riscaldare a temperatura ambiente. </li></ol> 7. Acquisizione di raggi X Spectra Spettri a raggi X può essere registrato utilizzando uno dei vari commerciali o progettati su misura a raggi X sistemi di analisi minimamente costituiti da un raggi X (EDX) rilevatore di energia dispersiva, associate elettronica pulse-processore e l&#39;acquisizione e la visualizzazione software compatibile. (Il sistema utilizzato in questo laboratorio è descritto nella Tabella 1.) <ol><li> Configurare EM per l&#39;acquisizione radiografica inserendo il rilevatore EDX nella colonna (se necessario), ritirando l&#39;apertura dell&#39;obiettivo, e l&#39;inserimento di centraggio e le aperture radiazione diffusa. Regolare il cryoholder alla temperatura più bassa alla quale si evita la contaminazione gelo del campione, ma almeno sotto -100 ° C. </li><li> Inclinare il supporto 20 ° verso il rivelatore. </li><li> In condizioni di imaging a grande campo, e supponendo si intende analizzare la matrice di un individual mitocondri, scegliere un mitocondrio per l&#39;analisi, si sposta al centro del campo e concentrarsi. </li><li> Passare alla modalità spot (su alcuni microscopi appena convergere il fascio utilizzando secondo fuoco condensatore) e aumentare la corrente di fascio di ca. 3 nA (come misurato con una tazza Faraday o simili) in un punto 100 nm. </li><li> Avviare il software di acquisizione dello spettro e iniziare a 100 acquisizioni sec, che possono essere visualizzati volta in diretta sul monitor. Salvare spettro registrato (Figura 2). Il formato EMSA standard del settore è preferito. </li><li> Arrestare il EM e trasferire il file di più spettri (s) a una (offline) workstation analisi. </li></ol> 8. Analisi di raggi X Spectra Analisi qualitativa Uno spettro EDX (Figura 2, nel riquadro) è essenzialmente un grafico xy dell&#39;intensità dei raggi X vs energia. Spectra contengono informazioni qualitative e quantitative sulla composizione elementare di tanalizzava il volume, in quanto l&#39;energia &quot;caratteristica&quot; di un picco identifica l&#39;elemento generatore che picco mentre l&#39;intensità riflette la quantità di tale elemento. I picchi caratteristici corsa su di uno sfondo lentamente variabile, &quot;continuo&quot;. (La legenda alla Figura 2 illustra ulteriori dettagli salienti di spettri EDX.) L&#39;energia dei collettori di picco per l&#39;intera tabella periodica sono definiti dalla nota struttura elettronica di elementi, quindi tutti i collegamenti software EDX a un database che identifica automaticamente i componenti di un analita. In un contesto fisiologico, elementi di interesse generale che ben si adattano ad analisi EDX includono Na (K α a 1.04 keV), P (2.01 keV), K (3.31 keV) e Ca (3,69 keV). <ol><li> Approfittate del database del software disponibile e le routine di picco corrispondente a individuare i principali elementi spettri. In un campione biologico si aspetterebbe di trovare i picchi di Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca. (ATTENZIONE:Gli ultimi due elementi si sovrappongono!) </li></ol> Analisi quantitativa L&#39;analisi quantitativa degli spettri EDX consiste nell&#39;estrarre l&#39;area integrata di picchi identificati e convertire questo valore per una concentrazione. Per l&#39;analisi biologica, l&#39;approccio determinato rappresenta il metodo picco / continuo Sala 4,7,10, che sfrutta il fatto che l&#39;intensità del continuum (sopra definito e in Figura 2) è proporzionale alla massa secca del volume analizzato . Così, il rapporto di picco zona zona / continuo, rispetto allo stesso rapporto in spettri di standard di composizione nota, specifica la concentrazione nel compartimento cellulare mirato. Si noti che questo approccio fornisce concentrazioni in moli per unità di peso, tipicamente espressi come mmol / kg di peso secco. Questa unità è inusuale e di interpretazione può richiedere ulteriore conversione, ad esempio, mmol / L peso umido o mmol / mg di proteina, come descritto ELsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Estrarre aree dei picchi (e le stime di errore) di elementi biologici tra Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), cioè Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca, utilizzando una delle routine di montaggio integrato nel software di analisi (vedi Tabella 1, in particolare nota 4). Questo laboratorio utilizza Simplex o multiple-minimi quadrati. Si noti che questo raccordo richiede particolare attenzione per risolvere la sovrapposizione tra K e Ca picchi (vedi figura 2). </li><li> Integrare il continuum tra 1,45-1,61 keV. Regioni libere da interferenze alternativi possono essere utilizzati. </li><li> Calcola rapporti picco / continui e poi concentrazioni rispetto agli standard. Propagare errori durante l&#39;analisi. </li><li> Utilizzare il software statistico standard e le formule per stimare le medie che riflettono la variabilità biologica. </li></ol>

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</ol>

Gli autori riportano conflitti di interesse.

La base microscopio-analitiche elettrone qui presentato permette l&#39;individuazione, l&#39;identificazione e la quantificazione di diversi elementi di interesse biologico, compresi Na, K, P, e soprattutto Ca. Queste analisi possono essere effettuate a subcellulare, cioè, intra-organello, risoluzione a causa della capacità di localizzare e identificare le strutture di interesse in immagini di alta qualità di criosezioni preparati da campioni congelati rapidamente. Si noti che nessuna colorazione è tenuto a reg...

Gli ioni calcio sono senza dubbio l&#39;entità segnalazione cellulare più importante e versatile in biologia, gioca un ruolo fondamentale nei processi normali diversi come trasmissione sinaptica e l&#39;espressione genica. D&#39;altra parte, il calcio è ugualmente importante nella morte cellulare. In particolare, la deregolamentazione calcio è un fattore chiave nel danno neuronale in ictus, Parkinson, Alzheimer e altre malattie neurodegenerative 3,5. Pertanto, è estremamente importante capire quantitativamente come calcio è distribuito all&#39;interno delle cellule, e come questo cambia seguente stimoli fisiologici o patofisiologici. Questo obiettivo è complicato dal fatto che il calcio è distribuita dinamicamente tra due stati fisici - liberi in soluzione o legato ad un substrato - e che le concentrazioni di calcio cellulare commutati diversi ordini di grandezza a seguito di stimolazione. Mentre ci sono diverse metodologie avanzate disponibili per l&#39;analisi di free calcio intracellulare, la determinazione delle concentrazioni di calcio totale in compartimenti intracellulari definiti è realisticamente limitata ad un approccio, cioè, elettrone sonda microanalisi (EPMA). EPMA è una tecnica che le coppie uno spettrometro a raggi X di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). La pistola TEM elettronico si concentra una sonda elettronica submicronico fermo su una regione subcellulare di interesse e raggi X specifici degli elementi emessi a seguito del bombardamento di elettroni sono raccolti e analizzati (vedi riferimenti 7, 4 per dettagliate recensioni tecnici). I vantaggi di EPMA sono sola risoluzione a livello di organelli e sensibilità submillimolar. In pratica, tuttavia, richiede EPMA cryotechniques specializzati e strumentazione per la preparazione dei campioni e analisi. Qui sono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure di calcio intracellulare mediante EPMA. Calcio intramitocondriale è di i particolarinterest sul conto del ruolo fondamentale che gioca mitocondriali sovraccarico di calcio nelle malattie neurodegenerative.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS/MATERIALS</td></tr><tr><td>Thermoanox plastic coverslips</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>Inserti di coltura</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Per piastre a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>Cryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td>Applicatori in legno scanalato</td></tr><tr><td></td><td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>Griglie EM pieghevoli</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>100 mesh</td></tr><tr><td>Foglio di indio</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0,25 mm di spessore</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dispositivo di congelamento a tuffo</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di congelamento a tuffo</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Cryoattachment per microtomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di criotrim in diamante</td><td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>Cryoknife in diamante</td><td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo antistatico</td><td>Diatome</td><td>Hauf Static Line</td><td></td></tr><tr><td>Cryo microscopio elettronico</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>Portacampioni criogenico EM</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD a scansione lenta, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td>Sharpeye</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione delle immagini</td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM suite</td><td></td></tr><tr><td>ED rivelatore di raggi X Oxford</td><td>Instruments</td><td>Linksystem Pentafet</td><td></td></tr><tr><td>Processore di impulsi</td> Oxford <td>Instruments</td> Backplane <td>PCI XP-3</td><td></td></tr><tr><td> scheda</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>Computer desktop</td><td>Apple</td><td>Qualsiasi modello</td><td></td>compatibile con OS9</tr> Software di <tr><td>analisi a raggi X</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>Il CF100 non è più venduto in commercio, sebbene la macchina sia disponibile in molte strutture accademiche, e macchine complete o parti possono essere trovate on-line.</li> <li>Un video tutorial per il supporto per criotrasferimento CT3500 è disponibile all'indirizzo <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>Il SEII è obsoleto; l'Universal Spectral Engine È un prodotto successivo, compatibile con PC con funzionalità comparabili. 4pi ha cessato la produzione e la vendita, ma continua a fornire assistenza tecnica ai clienti. I sistemi usati si trovano spesso online.</li> <li>Il DTSA originale è ormai obsoleto. Il NIST offre nel pubblico dominio un successore aggiornato, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

misurazione del calcio totale in neuroni da electron probe microanalisi a raggi x

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

In questo articolo vengono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure quantitative di contenuti elementale intracellulare utilizzando la tecnica conosciuta come sonda di elettroni microanalisi (EPMA). Calcio intramitocondriale è una particolare attenzione per il ruolo fondamentale che il sovraccarico di calcio mitocondriale svolge nelle malattie neurodegenerative. Il metodo si basa sull&#39;analisi dei raggi X generato in un microscopio elettronico (EM) per interazione di un fascio di elettroni con il campione. Al fine di mantenere la distribuzione nativo di elementi diffusibili in campioni di microscopia elettronica, EPMA richiede &quot;cryofixation&quot; del tessuto seguita dalla preparazione di criosezioni ultrasottili. Rapido congelamento delle cellule in coltura o colture fetta organotipica viene effettuata da tuffo congelamento in etano liquido o sbattere congelamento contro un blocco metallico freddo, rispettivamente. Criosezioni nominalmente spessore 80 nm sono tagliati a secco con un coltello di diamante a ca. -16076, C, montato su carbonio / griglie di rame pioloform rivestite, e cryotransferred in un Cryo-EM utilizzando un supporto cryospecimen specializzato. Dopo l&#39;indagine visiva e mappatura posizione a ≤ -160 ° C e bassa dose di elettroni, criosezioni congelati-idrato sono liofilizzati a -100 ° C per ~ 30 min. Immagini a livello organello di criosezioni secchi sono registrati, anche a basse dosi, per mezzo di una telecamera CCD a lenta scansione e regioni subcellulari di interesse selezionato per l&#39;analisi. Raggi X emessi da ROI da una, concentrata, sonda di elettroni ad alta intensità stazionaria vengono raccolti da un raggi X a dispersione di energia (EDX) spettrometro, elaborato da elettronica associata, e presentata come spettro ai raggi X, cioè un appezzamento di intensità dei raggi X vs energia. Software aggiuntivo facilita: 1) l&#39;identificazione di componenti elementari dai loro &quot;caratteristici&quot; energie di picco e di impronte digitali, e 2) analisi quantitativa per estrazione delle aree dei picchi / sfondo. Questo documento si conclude con due esempi che illustrano tipiciApplicazioni EPMA, uno in cui l&#39;analisi di calcio mitocondriale disponibile una visione critica dei meccanismi di danno excitotoxic e un altro che rivelavano la base della resistenza ischemia.

Le cellule cerebrali tipicamente lesioni alle eccitotossico a seguito del rilascio di neurotrasmettitore patologica che si verifica in condizioni ischemiche. EPMA è stato fondamentale per scoprire come la capacità dei mitocondri neuronali di sequestrare enormi quantità di calcio è alla base del meccanismo di lesione. Il microscopio elettronico in Figura 3 illustra l'aspetto di mitocondri in criosezioni liofilizzati di neuroni ippocampali rapidamente congelati dopo 30 minuti di esposizione ad uno stimolo...

Questo documento descrive l&#39;applicazione della microscopia elettronica cryoanalytical per la misurazione quantitativa del contenuto di calcio totale e la distribuzione a risoluzione subcellulare in campioni biologici fisiologicamente definiti.

Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la microscopia elettronica analitica per misurare quantitativamente la concentrazione di elementi biologicamente importanti come il calcio a risoluzione subcellulare nei neuroni in coltura. Ciò si ottiene congelando rapidamente colture cellulari vive e preparando sezioni criogeniche ultra sottili. Il secondo passo consiste nel trasferire le sezioni criogeniche in un microscopio elettronico analitico e liofilizzarle.Le immagini successive e gli spettri dei raggi X sono necessari da regioni subcellulari selezionate, compresi i mitocondri neuronali. Il passaggio finale consiste nell'analizzare quantitativamente gli spettri dei raggi X per determinare le concentrazioni elementari localizzate. In definitiva, questo approccio noto come EPMA viene utilizzato per rivelare i cambiamenti nelle concentrazioni e nella distribuzione del calcio che sono alla base della segnalazione intracellulare del calcio.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi correlati come la fluorescenza, la microscopia, l'assorbimento di radioisotopi o la fotometria a fiamma, è la risoluzione a livello di singolo organello e la sensibilità submillimolare. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Natalia pva, scienziata senior del nostro laboratorio. Per iniziare, preparare un bagno di congelamento condensando l'etano gassoso a una temperatura negativa di 160 gradi Celsius nel pozzo centrale di un sistema raffreddato ad azoto liquido.Quindi tamponare il bordo di un vetrino coprioggetto contenente cellule aderenti per rimuovere tutto tranne una sottile pellicola di liquido. Fare attenzione a non seccare il campione. Quindi, tenere il vetrino coprioggetto per il bordo e immergere rapidamente il campione nell'etano liquido.Dopo due o tre secondi, rimuovere il vetrino coprioggetto dall'etano e metterlo in una ciotola di polistirolo di azoto liquido Transfer. Il coperchio congelato scivola in un microtomo criogenico pre-raffreddato a meno 135 gradi Celsius. Tagliare i vetrini coprioggetto congelati in quadrati di tre millimetri per tre millimetri usando un bisturi affilato pre-freddo.Quindi incorporali rivolti verso l'alto su un perno di alluminio di tre millimetri di diametro in una miscela di colla criogenica composta da una parte di etanolo e sei parti. Isopropanolo. Solidificare la colla criogenica abbassando la temperatura della scatola criogenica a meno 160 gradi Celsius. Quindi, tagliare le aree ricche di celle del pezzo di vetrino coprioggetto a una superficie di blocco di circa 250 x 250 micron e una profondità di 100 micron.Utilizzando uno strumento di rifilatura diamantato, tagliare a secco i nastri di sezioni sottili a una temperatura negativa di 160 gradi Celsius utilizzando un coltello criogenico diamantato a 35 gradi come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi trasferire le sezioni su una peola rivestita di carbonio scaricata a bagliore. Le pellicole di supporto sono fuse su 100 griglie di rame pieghevoli a rete in una busta aperta all'indio.La rete è chiusa. Quindi l'involucro e il sandwich sono stati pressati con uno strumento di pressatura raffreddato prima del criotrasferimento dei campioni al microscopio elettronico. Raffreddare il supporto criogenico alla sua temperatura minima di almeno 160 gradi Celsius mentre è sotto vuoto alto all'interno del microscopio stage.Quindi inclinare il goniometro di 45 gradi in senso orario e rimuovere il supporto. Trasferire rapidamente il supporto criogenico raffreddato dal microscopio alla workstation criogenica raffreddata e ritrarre lo scudo antigelo del supporto. Quindi trasferire il campione nel supporto criogenico.Fissare la griglia con l'anello di ritegno utilizzando la chiave in dotazione e chiudere il parabrina. Quindi, rimuovere rapidamente il supporto criogenico dalla workstation criogenica e inserirlo nella camera d'equilibrio del microscopio. Eseguire la sequenza di pompaggio il più rapidamente possibile con il supporto criogenico del campione in posizione.Riportare il goniometro a un'inclinazione di zero gradi. Ricollegare e riaccendere la scatola di controllo e verificare che la temperatura del campione sia inferiore o uguale a meno 150 gradi Celsius. Infine, riempire l'esecutore del portacampioni e lasciare che il vuoto e la temperatura si riprendano completamente.Innanzitutto, valutare visivamente il campione con un ingrandimento di 250 volte e una bassa illuminazione. Le sezioni selezionate devono essere sottili e lisce, non piegate o sovrapposte. Dovrebbero anche essere piatti, ben attaccati alla pellicola di supporto e generalmente non oscurati da barre della griglia.Utilizzare il tavolino goniometrico digitale per memorizzare le coordinate delle sezioni selezionate. Quindi, aumentare la temperatura del supporto a -100 gradi Celsius per 30 minuti per liofilizzare le sezioni per stabilizzarle e migliorare il contrasto. Quindi riavvolgere i campioni fino a -160 gradi Celsius o meno.Prima dell'imaging ad alta risoluzione. Spegnere l'unità di controllo del supporto criogenico e scollegare fisicamente il cavo del controller per evitare la deriva dell'immagine dovuta ai cicli termici e/o al rilevamento delle vibrazioni. Quindi attivare il microscopio elettronico in modalità ad alto ingrandimento.Esamina le regioni subcellulari a circa 2000 volte l'ingrandimento che si trovano all'interno di sezioni selezionate le cui posizioni sono state precedentemente memorizzate. Registra e archivia immagini TIFF di aree promettenti. Quindi valutare le immagini per selezionare e annotare le regioni di interesse per l'analisi a raggi X.Una volta selezionate le regioni di interesse, configurare il microscopio elettronico per l'acquisizione dei raggi X inserendo il rivelatore EDX nella colonna, ritirando l'apertura dell'obiettivo e inserendo e centrando eventuali aperture di radiazione vagante. Inclinare il supporto di 20 gradi verso il rilevatore in modalità spot. Aumentare la corrente del fascio a circa tre nano ampere, misurata in uno spot di 100 nanometri.Quindi aumentare la temperatura del supporto criogenico a meno di 100 gradi Celsius o inferiore per evitare la contaminazione da gelo in condizioni di imaging ad ampio campo. Scegliere un mitocondrio per l'analisi. Torna alla modalità spot.Avvia il software di acquisizione dello spettro e inizia la 102a acquisizione. Salvare gli spettri registrati nel formato di file EMSA standard. Campionare un numero sufficiente di mitocondri in cellule diverse per garantire un set di dati statisticamente significativo.Al fine di analizzare qualitativamente uno spettro EDX, utilizzare un database software disponibile e una routine di corrispondenza dei picchi come DTSA per identificare gli elementi principali negli spettri. Identifica gli elementi in base alle posizioni energetiche caratteristiche dei loro picchi. I campioni biologici di solito contengono sodio, cassio, fosforo, zolfo, cloro, potassio e calcio.Presta particolare attenzione ai picchi di calcio e potassio poiché si sovrappongono per l'analisi quantitativa. Inizia estraendo l'area integrata dei picchi identificati utilizzando uno dei diversi algoritmi di adattamento standard, come il metodo simplex integrato in DTSA, stima quindi la massa secca integrando il continuum tra 1,45 e 1,61 kilo elettronvolt. In regioni alternative prive di interferenze, ad esempio da 4,0 a 5,0 kilo elettronvolt, è possibile utilizzare per evitare segnali non biologici estranei nella regione del continuum primario.Infine, calcola i rapporti di picco su quello continuo e converti in concentrazioni rispetto agli standard. Questo approccio è noto come metodo del picco di Hall su continuum. Qui è mostrata una micrografia di un neurone ippocampale in coltura, rapidamente congelato in seguito all'esposizione a uno stimolo citotossico, che porta all'apertura dei canali ionici e del calcio in flusso.La maggior parte dei mitocondri mostrati qui appaiono strutturalmente danneggiati in quanto sono molto gonfi e contengono piccole inclusioni scure. La microanalisi è stata quindi utilizzata per eseguire analisi elementari all'interno ed esclusivamente delle inclusioni mitocondriali. Lo studio ha rivelato che le inclusioni sono in gran parte composte da quantità estremamente elevate di calcio e fosforo.Questo spiega la loro straordinaria capacità tampone del calcio e perché il superamento di questo meccanismo tampone porta alla morte cellulare innescata dal sovraccarico di calcio. L'ippocampo, un'area del cervello fondamentale per l'apprendimento e la memoria, è uno dei principali siti di lesione dopo l'ischemia. La regione funzionalmente distinta denominata CA tre è molto meno vulnerabile al danno ischemico rispetto alla sonda elettronica della regione ca 1 adiacentemente connessa sinapticamente la microanalisi a seguito di stimoli tossici di queste fette ha mostrato aumenti di calcio molto maggiori nei neuroni CA 1 vulnerabili rispetto ai neuroni CA 3 resistenti.Di conseguenza, i mitocondri CA 1 mostrano lesioni e disfunzioni estese, indicando che la disfunzione mitocondriale indotta da sovraccarico di calcio è un fattore determinante nella vulnerabilità selettiva dei neuroni CA 1. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la concentrazione di calcio totale nei singoli mitocondri dei neuroni culturali utilizzando la microanalisi con sonda di raccolta.

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Attività spontanea di sviluppare le reti neuronali può essere misurato con AM-estere forme di calcio-sensibili coloranti indicatore. Variazioni di calcio intracellulare, indicando l'attivazione neuronale, vengono rilevati come variazioni transitorie della fluorescenza indicatore con uno o due fotoni di imaging. Questo protocollo può essere adattato per una serie di reti neuronali...

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In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

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Registrazione elettrofisiologica simultanea e imaging del calcio dei neuroni del nucleo soprachiasmatico

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Il protocollo proposto prevede un approccio globale per valutare la formazione ossea nel contesto della rigenerazione ossea utilizzando analisi multimodali. Ha lo scopo di fornire informazioni qualitative e quantitative sulla formazione di nuovo osso, migliorando il rigore e la validità delle indagini di base e precliniche.

Caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale in un modello ex vivo

Impara a misurare il calcio totale in neuroni coltivati mediante microanalisi a sonda elettronica (EPMA). Questa tecnica di criomicroscopia elettronica consente analisi quantitative a risoluzione subcellulare per studiare la segnalazione del calcio.

Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X

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