Name: Utilizzando Clicca Chimica per misurare leffetto dellinfezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri come misurare l'attività trascrizionale nelle cellule infettate dal virus della febbre della Rift Valley MP-12 usando la click chemistry con uridina analogica. Questo metodo non radioattivo permette analisi qualitative e quantitative.

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Ringraziamo RB Tesh per fornire il mouse policlonale anti-RVFV antisiero e M. Griffin del UTMB Citometria a Flusso Nucleo Struttura per un aiuto con la citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da 5 U54 AI057156 attraverso l&#39;occidentale Centro Regionale di Eccellenza, NIH R01 AI08764301, e il finanziamento del Centro per lo Sviluppo Sealy Vaccino a UTMB.BK è stato sostenuto dalla James W. McLaughlin Fellowship Fund presso UTMB.OL è stato sostenuto da un Maurice R. Hilleman fase iniziale di carriera Career Investigator Award.

Analisi della trascrizione mediante microscopia a fluorescenza 1. Infettare le cellule con MP-12 e Label RNA nascenti con UE <ol><li> Luogo di 12 mm coprioggetto rotondi in 12 pozzetti coltura tissutale, un coprioggetto per pozzetto. </li></ol> Nota: se le cellule hanno difficoltà aderendo al coprioggetto, cappotto con poli-L-lisina (MW ≥ 70.000) prima di mettere in pozzi. A tale scopo, coprioggetto sommergere in una soluzione sterile 0,1 mg / ml in H 2 O di poli-L-lisina per 5 min. Risciacquare con coprioggetto sterili H 2 O e asciugare per almeno 2 ore. <ol start="2"><li> A seme 293 cellule su vetrini coprioggetto, aggiungere 5 x 10 4 cellule in 1 ml di mezzo di crescita (DMEM contenente 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina) per pozzetto. Incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2 O / N. </li><li> Infettare cellule con MP-12 in una molteplicità di infezione (moi) di 3. Includere almeno due<html> pozzi infetti: uno dei due pozzi servirà come il controllo non infetto, l&#39;altra saranno trattati con actinomicina D (ACTD) al punto 1.5 come controllo per la repressione trascrizionale. Rimuovere mezzo di crescita e diluire il magazzino virus in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto è 200 ml. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Nota: Invece di infettare le cellule, le cellule possono essere trasfettate con DNA plasmidico o sintetizzati in vitro di RNA codificante per una proteina virale specifico. A questo scopo, trasfettare cellule con un appropriato reagente di trasfezione chimica secondo le istruzioni del fabbricante e procedere al punto 1.5 a 16 ore dopo la trasfezione. Si consiglia di ottimizzare le condizioni di trasfezione e il tempo di incubazione prima dell&#39;etichettatura RNA e fissazione. <ol start="4"><li> Rimuovere inoculo e aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 15 ore. </li></ol>ove_content &quot;&gt;. Nota: Se adattare questo protocollo per l&#39;uso con un altro virus, si consiglia di eseguire un esperimento corso del tempo per determinare il punto di tempo ottimale per l&#39;etichettatura di RNA e la fissazione Impostare questa volta ovviamente in modo che i tempi di infezione sono sfalsati e tutti campioni possono essere etichettati, fissate e colorate allo stesso tempo. <ol start="5"><li> A 15 ore dopo l&#39;infezione (HPI), sostituire il terreno di coltura con terreno contenente 1 mM UE. Per uno dei pozzi infetti finti, aggiungere anche 5 mcg / ml ACTD. Questo servirà come controllo per la repressione trascrizionale, come ACTD inibisce la sintesi di RNA DNA-dipendente. Cellule Rientro in incubatrice. </li><li> Al 16 HPI, rimuovere il terreno e lavare i coprioggetti una volta con 1 ml di PBS (KCl 0,20 g / l, KH 2 PO 4 0.20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1.15 g / L, pH 7,4) per pozzetto. Fix cellule aggiungendo 1 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per pozzetto ed incubare per 30 minuti a RT. </li></ol>Nota: Per preparare la soluzione di fissaggio 4% PFA, sciogliere 10 g di paraformaldeide in 150 ml di H 2 O riscaldata a 60 ° C su un agitatore magnetico riscaldato. Aggiungere 500 ml di NaOH 1M e continuare a mescolare fino a quando la soluzione diventa chiara. Filtro soluzione PFA attraverso una carta da filtro per rimuovere le particelle e aggiungere 62,5 ml di tampone fosfato (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7.4). Aggiungere H 2 O fino ad un volume totale di 250 ml. Congelare a -20 ° C in aliquote monouso. <ol start="7"><li> Lavare una volta con 1 ml di PBS per pozzetto. Non è richiesto alcun tempo di incubazione per questa e tutte le successive fasi di lavaggio. Procedere immediatamente alla fase 2. </li></ol> Nota: è importante procedere immediatamente con la reazione scatto, come l&#39;RNA degenera se conservate a questo stadio per periodi di tempo prolungati, una perdita del segnale di fluorescenza RNA è già emersa se ​​le cellule sono conservate per 1 ora a 4 ° C . Allo stesso modo, se performando un esperimento corso di tempo, essere sicuri di etichetta, correggere e macchia tutti i campioni contemporaneamente. 2. Clicca Reazione a rilevare RNA marcate <ol><li> Permeabilize cellule aggiungendo 1 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubare per 10 min a RT. </li></ol> Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in passaggi da 2.1 a 2.3 devono essere nucleasi libero. <ol start="2"><li> Lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Togliere i coprioggetti da 12-pozzetti e trasferimento in camera umida. Coprire ogni vetrino con 50-100 soluzione colorante click microlitri (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 20 mM azide fluorescente [eccitazione / emissione massima: 590/617 nm], 100 mM di acido ascorbico) ciascuna. Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Per assemblare la camera umida, linea di fondo di una coltura cellulare o capsula di Petri con un diametro di 10 cm con una pellicola di plastica paraffina. Rivestire l&#39;interno del bordo del dish con tovaglioli di carta umidi. Posizionare il coprioggetto sulla pellicola di plastica paraffina. Nota: Fare attenzione a non lasciare che i coprioggetti asciugare nel corso di questo o di qualsiasi altro passo nel protocollo. È consigliabile aggiungere la soluzione di colorazione per ciascun coprioggetto direttamente dopo che è stato collocato nella camera umida. Nota: Preparare la soluzione colorante click fresco immediatamente prima di questo passaggio. Soluzioni stock di 1,5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO 4, e 500 mM di acido ascorbico possono essere conservati a 4 ° C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione madre di acido ascorbico che ha trasformato giallo. Nota: Assicurarsi di selezionare un fluoroforo che corrisponde ai filtri il microscopio a fluorescenza. <ol start="4"><li> Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto in un fresco 12-pozzetti e lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li></ol> Nota: se non deprotezione di proteine ​​virali è desiderato, coprioggetto può essere montato e ripreso dopo questo passaggio (passare al punto 3.3). 3. Immunofluorescenza per rilevare l&#39;espressione di proteine ​​virali <ol><li> Aggiungere 1 ml di tampone di bloccaggio (3% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) in PBS) a ciascun pozzetto ed incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Togliere i coprioggetti da 12-pozzetti, trasferimento in camera umida e coprire con 50-100 ml di anticorpo primario (anti-RVFV, un gentile dono del Dr. RB Tesh, UTMB) diluito in tampone di bloccaggio (1:500). Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Quando adattare questo protocollo per l&#39;utilizzo con un virus diverso, determinare la diluizione ottimale per il primo anticorpo primario. Nota: In alternativa, questa fase può essere realizzata O / N a 4 ° C al buio. <ol start="3"><li> Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto di nuovo in 12-pozzetti e lavaretre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Rimuovere coprioggetto da posto 12-bene, posto in camera umida e coprire con 50-100 ml di anticorpo secondario (anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente [eccitazione / emissione massima: 495/519 nm]) diluito in tampone di bloccaggio (1: 500). Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Assicurarsi di selezionare un anticorpo secondario in grado di riconoscere il vostro anticorpo primario e corrisponde ai filtri il microscopio a fluorescenza. Nota: Se si desidera, 200 ng / ml DAPI può essere aggiunto alla diluizione anticorpo secondario per visualizzarne nuclei. <ol start="5"><li> Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto di nuovo in 12-pozzetti e lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Montare coprioggetto mettendo una goccia (ca. 15 ml) di Fluoromount-G su un vetrino da microscopio. Immergere il vetrino in H 2 O, eliminare l&#39;eccesso di H 2 O toccando thlato e contro un tovagliolo di carta, e posto cellula-lato giù nella goccia di Fluoromount-G. Aria secca per 5 min. </li></ol> Nota: Se l&#39;imaging su un microscopio invertito, consentire Fluoromount-G a solidificare a 4 ° CO / N o apporre il coprioggetto al vetrino sigillando il bordo con smalto trasparente. Nota: Le diapositive possono essere ripreso immediatamente o conservati a 4 ° C al buio per un massimo di una settimana. 4. Acquisizione di dati <ol><li> Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol> Nota: Assicurarsi di selezionare fluorofori adeguati che possono essere visualizzati utilizzando il microscopio. Per riferimento, i seguenti sono i fluorofori e set di filtri utilizzati per acquisire le immagini mostrate in questa pubblicazione. DAPI: Filtro di eccitazione: BP 330-385 Specchio Dichromatic: 400 DM Filtro per le emissioni: LP 420 Filtro di eccitazione: BP 460-490 Specchio Dichromatic: 505 DM Filtro per le emissioni: LP 510 Fluoroforo con eccitazione / emissione massima di 590/617: Filtro di eccitazione: BP 545-580 Specchio Dichromatic: 600 DM Filtro per le emissioni: LP 610 Analisi della trascrizione mediante citometria di flusso 5. Infettare le cellule con MP-12 e Label RNA nascenti con UE <ol><li> Seme 293 cellule in 6 pozzetti coltura tissutale nel terreno di coltura (DMEM contenente 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina). Incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2 finché le cellule hanno raggiunto 80 - 100% di confluenza. </li><li> Infettare cellule con MP-12 ad una MOI di 3. Includere almeno due pozzi infetti: uno dei due pozzi servirà come il controllo non infetto, l&#39;altra saranno trattati con ACTD a passo5.4. Rimuovere mezzo di crescita e diluire il magazzino virus in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto è di 400 microlitri. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Rimuovere inoculo e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 12 hr. </li></ol> Nota: Se adattare questo protocollo per l&#39;uso con un altro virus, si consiglia di eseguire un esperimento corso del tempo per determinare il punto di tempo ottimale per l&#39;etichettatura e la raccolta. Impostare questo tempo corso in modo che i tempi di infezione sono sfalsati e tutti i campioni possono essere etichettati, raccolto, e colorate allo stesso tempo. <ol start="4"><li> Al 12 hpi, sostituire terreno di crescita con terreno contenente 0,5 mM UE. Per uno dei pozzi infetti finti, aggiungere anche 5 mcg / ml ACTD. Questo servirà come controllo per la repressione trascrizionale, come ACTD inibisce la sintesi di RNA DNA-dipendente. Cellule Rientro in incubatrice. </li><li> Al 13 hpi, lavare le cellule una volta with PBS e raccolto da tripsinizzazione delle cellule. Lavare le cellule raccolte tre volte con PBS contenente 1 mM EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Nota: durante questo e nei successivi passaggi, non centrifugare le cellule più veloce di 500 - 1.000 xg per evitare la rottura delle cellule. Centrifugare le cellule per 1 - 2 minuti per sedimento. Nota: Se un immunoistochimica superficie è prevista a seguito della reazione di click, raccolto utilizzando un poliziotto in gomma o un raschietto cellulare usa e getta, invece. <ol start="6"><li> Fissare le cellule da essi risospendere in 1 ml di PFA 4% e incubare per 30 minuti a RT. Fare riferimento al punto 1.6 per le istruzioni su come preparare 4% PFA. </li><li> Lavare una volta con 1 ml di PBS-EDTA per pozzetto. Procedere immediatamente alla fase 6. </li></ol> Nota: è importante procedere immediatamente con la reazione scatto, come l&#39;RNA degenera se conservate a questo stadio per periodi di tempo prolungati. Analogamente, se l&#39;esecuzione di un tempo cesperimento ourse, assicurati di etichettare, fissare e colorare tutti i campioni contemporaneamente. 6. Clicca Reazione a rilevare RNA marcate <ol><li> Permeabilize risospendendo cellule in 0,5 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubare per 10 min a RT. </li></ol> Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in passaggi 6,1-6,3 devono essere nucleasi libero. Nota: Se le cellule non sedimenti correttamente durante questa fase, aumentare il tempo di centrifugazione per 5 min. Comportamento di sedimentazione migliorerà una volta le cellule sono sospese in FACS tampone (passo 6.4). <ol start="2"><li> Lavare una volta con 1 ml di PBS. </li></ol> Nota: non utilizzare EDTA in questo passaggio come questo chelare il Cu 2 + ioni necessari per la reazione click. <ol start="3"><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri soluzione colorante click (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 200Nm azide marcato con colorante fluorescente [excitation / emissione massima: 650/665 nm], 100 mM di acido ascorbico). Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Preparare la soluzione colorante click fresco immediatamente prima di questo passaggio. Soluzioni stock di 1,5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO 4, e 500 mM di acido ascorbico possono essere conservati a 4 ° C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione madre di acido ascorbico che ha trasformato giallo. Nota: se le cellule si aggregano assieme durante questa fase, risospendere pipettando su e giù parecchie volte. Nota: Assicurarsi di selezionare un fluoroforo che può essere rilevato dal citofluorimetro. Nota: preparare anche un campione di cellule infette che non sono soggette alla procedura di colorazione click, che saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Usare sia la metà delle cellule infette o includere un ulteriore infettato ben al passo 5.2. Questi concellule trollo saranno immunomacchiate al passo 7.1. <ol start="4"><li> Lavare due volte con tampone FACS (PBS contenente 1 mM EDTA e 0,5% (w / v) BSA). </li></ol> Nota: Se non si desidera immunoistochimica di proteine ​​virali, le cellule possono essere analizzati immediatamente (passare al punto 8). 7. Immunofluorescenza per rilevare l&#39;espressione di proteine ​​virali <ol><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di anticorpo primario (anti-RVFV) diluite in FACS tampone (1:10.000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li></ol> Nota: In alternativa, questa fase può essere realizzata O / N a 4 ° C al buio. Nota: preparare anche un campione di cellule non infette, che sono stati sottoposti alla procedura di colorazione click ma non verrà immunomacchiate, questi saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Usare sia la metà delle cellule infette finti o includono una ben infetto supplementare apunto 5.2. Nota: Quando adattare questo protocollo per l&#39;utilizzo con un virus diverso, determinare la diluizione ottimale per il primo anticorpo primario. <ol start="2"><li> Lavare le cellule due volte in tampone FACS. </li><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di anticorpo secondario (anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente [eccitazione / emissione massima: 495/519 nm]) diluito in tampone FACS (1:1000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule una volta in tampone FACS. </li></ol> Nota: A questo punto, le cellule possono essere conservate O / N a 4 ° C al buio. 8. Acquisizione di dati <ol><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer FACS, trasferimento in 5 ml provette di polistirene e analizzare utilizzando un citofluorimetro. Utilizzare MP-12 cellule infette (nessuno scatto di reazione, solo colorazione anti-RVFV) e le cellule infette finte (clicca unica reazione) per calibrare lo strumento. </li></ol> None: Assicurarsi di selezionare fluorofori adeguati che possono essere rilevati dallo strumento. Per riferimento, le seguenti sono le linee laser e set di filtri usati per acquisire i dati riportati in questa pubblicazione. Fluoroforo con eccitazione / emissione spettro di 495/519: Laser: 488 nm Filtro: 530/30 Fluoroforo con eccitazione / emissione spettro di 650/665: Laser: 640 nm Filtro: 670/20

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo fornito descrive un metodo per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla trascrizione cellula ospite mediante incorporazione della uridina analogico UE in RNA nascenti. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi precedenti: è veloce, sensibile, e non si basa sull&#39;impiego di isotopi radioattivi. Inoltre, il metodo può essere adattato per produrre dati qualitativi tramite microscopia a fluorescenza o dati quantitativi tramite citometria a flusso utilizzando essenzialmente gli stess...

<html> Tradizionalmente, l&#39;attività trascrizionale è stata misurata attraverso l&#39;inserimento di una radioattivo (3 H-uridina) 1 o alogenati (BRU) 2 nucleosidi in RNA nascenti. Questi analoghi uridina vengono assorbiti dalle cellule, convertiti in uridina-trifosfato (UTP) attraverso la via di recupero nucleoside, e successivamente incorporate nella nuova sintesi dell&#39;RNA. 3 H-uridina possono essere rilevati mediante autoradiografia, che può richiedere molto tempo, o scintillazione conteggio, che richiede attrezzature specializzate. Inoltre, l&#39;uso di isotopi radioattivi non può essere pratico in una serie di impostazioni di laboratorio, compresa alto contenimento laboratori di biosicurezza. Bru può essere rilevato attraverso immunoistochimica con anticorpi anti-BRU, che possono richiedere dura permeabilizzazione per garantire l&#39;accesso degli anticorpi al nucleo o parziale denaturazione di RNA, come struttura secondaria dell&#39;RNA potrebbe essere un impedimento sterico il legame degli anticorpi. _content &quot;&gt; Il protocollo qui descritto utilizza la chimica Clicca recentemente sviluppato clicca chimica 3 per misurare l&#39;attività trascrizionale in cellule infettate con il ceppo RVFV MP-12. basa su un rame altamente selettivo ed efficace (I)-catalizzata reazione di cicloaddizione tra un alchino e una porzione azide 4,5. In questo protocollo, nascenti RNA nelle cellule infettate viene prima etichettato mediante incorporazione della uridina analogico UE. In una seconda fase, l&#39;UE incorporato viene rilevato mediante reazione con un azide fluorescente. I principali vantaggi di questo metodo sono (1) che non richiede l&#39;uso di isotopi radioattivi e (2) che non richiede aspro permeabilizzazione o denaturazione di RNA. Con un peso molecolare inferiore a 50 Da, accesso del azide fluorescente non impedito da insufficiente permeabilizzazione o RNA struttura secondaria. Inoltre, i ricercatori non sono limitati nella loro scelta di anticorpi primari quando si associa la rilevazione di RNA con una classeimmunoistochimica iCal per le proteine ​​virali. Due diversi metodi sono descritti in questo protocollo: uno per la visualizzazione di trascrizione mediante microscopia a fluorescenza (punti 1-4), e uno per quantificare la trascrizione attraverso citometria a flusso (passi 5-8). Entrambi questi metodi si combinano etichettatura di RNA nascenti con una immunocolorazione intracellulare di proteine ​​virali, che consente una correlazione tra l&#39;attività trascrizionale e l&#39;infezione virale su base cella per cella. Gli autori hanno utilizzato con successo il protocollo qui descritto per determinare l&#39;attività trascrizionale in cellule infettate con il ceppo RVFV MP-12 6 cellule infettate con differenti MP-12 mutanti 7,8, 9 e cellule infettate con virus Toscana (TOSV) 10. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per l&#39;uso con diversi virus ed ha il potenziale di essere modificato per includere immunofluorescenza di proteine ​​virali o cellulari specifici.

<table><tbody><tr><td>5-etinil-uridina</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>si dissolve in DMSO per 100 mM di stock</td></tr><tr><td>12 mm di coprioggetti rotondi Fisherbrand</td><td></td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Provette di polistirene da 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>si dissolve in DMSO per 10 mM di stock</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>si dissolve in H2O per 100 mM di stock</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>si dissolve in H2O per 5 mg/ml di</td></tr><tr><td>stock DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>azide fluorescente (Alexa Fluor 594-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>acido L-ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>dissolvere in H2O per 500 mM </td></tr><tr><td>filtro di carta</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina (MW &#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>sciogliere in H2O per stock da 1,5 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td> a<td>fluorescenza</td><td>es. Citometro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> a flusso Olympus IX71<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td></tr></tbody></table>

utilizzando clicca chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite rna sintesi

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Molti virus a RNA sono evoluti la capacità di inibire la trascrizione cellula ospite come mezzo per aggirare difese cellulari. Per lo studio di questi virus, è quindi importante avere un modo rapido e affidabile di misurazione dell&#39;attività trascrizionale nelle cellule infette. Tradizionalmente, la trascrizione è stata misurata mediante incorporazione di nucleotidi radioattivi come 3 H-uridina seguita da rilevamento mediante autoradiografia o conteggio a scintillazione, o incorporazione di uridina analoghi alogenati come il 5-bromouridine (BRU), seguita da rilevamento mediante immunoistochimica. L&#39;uso di isotopi radioattivi, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e non è praticabile in una serie di impostazioni di laboratorio, mentre il rilevamento di Bru può essere ingombrante e può soffrire di bassa sensibilità. La chimica click recentemente sviluppato, che comporta una formazione triazolo rame-catalizzata da una azide e un alchino, fornisce ora una rapida e highly alternativa sensibili a questi due metodi. Clicca chimica è un processo in due fasi, in cui l&#39;RNA nascente è prima etichettato per incorporazione di uridina analogico 5 ethynyluridine (UE), seguita dalla rilevazione del marchio con una azide fluorescente. Questi azidi sono disponibili come diversi fluorofori differenti, permettendo una vasta gamma di opzioni per la visualizzazione. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la soppressione trascrizionale in cellule infettate con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12 utilizzando clic chimica. Contemporaneamente, espressione di proteine ​​virali in queste cellule è determinata dalla classica immunocolorazione intracellulare. Passaggi da 1 a 4 dettaglio un metodo per visualizzare la soppressione trascrizionale tramite microscopia a fluorescenza, mentre i passaggi da 5 a 8 dettaglio un metodo per quantificare la soppressione trascrizionale tramite citometria a flusso. Questo protocollo è facilmente adattabile per l&#39;uso con altri virus.

La proteina di NSS RVFV (famiglia Bunyaviridae, genere Phlebovirus) 11 inibisce la cellula ospite trascrizione generale attraverso due meccanismi distinti: (i) sequestrando la subunità p44 del fattore di trascrizione basale TFIIH 11 e (ii), promuovendo la degradazione proteasoma della p62 subunità di TFIIH 6. Il RVFV MP-12 vaccino ceppo 13 è stato utilizzato per gli esperimenti descritti in questo protocollo da MP-12 ceppo può essere gestita in un livello 2 l...

Questo metodo descrive l&#39;uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l&#39;infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l&#39;uso con altri virus.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare l'attività trascrizionale in cellule infette da virus. Innanzitutto, infettare le cellule 293 con il virus della febbre del Rift Valley, ceppo MP-12. Successivamente, marcare le cellule con l'analogo dell'uridina 5-etinil-uridina, che viene incorporato nell'RNA nascente. Poi, accoppiare il 5-etinil-uridina incorporato a un azide fluorescente al fine di visualizzare l'RNA appena sintetizzato. I risultati ottenuti permettono di valutare le differenze nella quantità di RNA appena sintetizzato tra cellule infette e non infette, basandosi sull'analisi al microscopio fluorescente o sulla citometria a flusso.A differenza della marcatura con uridina triziata o 5-bromo uridina, questo approccio basato sulla chimica click non richiede l'uso di isotopi radioattivi. È inoltre più rapido e sensibile rispetto all'immunomarcatura anti-bromo uridina. L'idea alla base di questo metodo deriva dalla nostra necessità di un modo rapido e affidabile per misurare la soppressione della trascrizione in cellule infettate da diversi ceppi del virus della febbre del Rift Valley, MP-12. Posizionare coprivetrini rotondi da 12 millimetri in ogni pozzetto di una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti. Successivamente, seminare le cellule 293 in un millilitro di mezzo DMEM completo. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tutta la notte. In base al disegno sperimentale, diluire il ceppo virale in modo che l'infezione delle cellule con MP-12 avvenga a una multiplicità di infezione di tre in un volume totale di 200 microlitri per pozzetto. Assegnare un pozzetto come controllo non infetto e un altro come controllo per la soppressione della trascrizione. Rimuovere ora il mezzo di crescita. Aggiungere l'inoculo virale e incubare per un'ora nell'incubatore umidificato. Aspirare l'inoculo. Aggiungere un millilitro di mezzo di crescita fresco per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius. A 15 ore post-infezione, sostituire il mezzo di crescita con mezzo contenente un millimolare dell'analogo dell'uridina, 5-etinil-uridina. In uno dei pozzetti infettati in modo fittizio, aggiungere anche cinque microgrammi per millilitro dell'inibitore della sintesi dell'RNA dipendente dal DNA, actinomicina-D. Reintrodurre le cellule nell'incubatore. A 16 ore post-infezione, rimuovere il mezzo e lavare i coprivetrini una volta con un millilitro di PBS per pozzetto. Fissare le cellule con un millilitro di paraformaldeide al 4% per pozzetto. Risciacquare una volta con un millilitro di PBS per pozzetto.Per assemblare la camera umidificata, foderare il fondo di una piastra per colture cellulari o di una piastra di Petri con diametro di 10 centimetri con pellicola di paraffina plastica. Foderare l'interno del bordo della piastra con tovaglioli di carta inumiditi. Per permeabilizzare le cellule, aggiungere un millilitro di Triton X-100 0,2% in PBS. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi con PBS, trasferire i coverslip nella camera umidificata. Per la reazione "click" finalizzata al rilevamento dell'RNA marcato, coprire ciascun coverslip con 50-100 microlitri di soluzione di marcatura "click" appena preparata. Incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio.Aggiungere un millilitro di PBS nei pozzetti di una nuova piastra a 12 pozzetti e trasferire i coverslip nei pozzetti. Lavare altre due volte con un millilitro di PBS per pozzetto. Per montare le cellule per la microscopia a fluorescenza, posizionare una goccia di fluoromount-G su un vetrino. Immergere il coverslip in acqua, rimuovere l'acqua in eccesso. Posizionare il coverslip con il lato cellulare verso il basso nella goccia di fluoromount G e lasciare asciugare all'aria per cinque minuti.In base al disegno sperimentale, infettare le cellule 293 con MP 12 a un MOI di tre. Rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere il ceppo virale diluito, quindi incubare per un'ora in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Sostituire l'inoculo con due millilitri di mezzo di crescita fresco per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per il tempo ottimale di marcatura e raccolta del virus. Successivamente, sostituire il mezzo di crescita con un mezzo contenente 0,5 millimolare di 5-etinil-uridina in uno dei pozzetti di controllo non infettato. Aggiungere anche cinque microgrammi per millilitro di actinomicina-D. Reintrodurre le cellule nell'incubatore per un'ora. Dopo un lavaggio con PBS, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione. Lavare le cellule raccolte tre volte con PBS contenente un millimolare di EDTA. Per fissare le cellule, risospendere il pellet in un millilitro di PFA al 4% e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare una volta con un millilitro di PBS-EDTA per tubo. Successivamente, permeabilizzare le cellule in 0,5 millilitri di Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare una volta con un millilitro di PBS privo di nucleasi. Per la reazione di tipo "click", risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di soluzione di marcatura "click" contenente il colorante fluorescente. Se le cellule si aggregano, risospendere mediante pipettaggio. Incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio. Lavare due volte con tampone FACS.In questo esperimento, le cellule 293 sono state infettate con MP-12 e con un virus mutante privo di una regione deleta, incapace di sopprimere la trascrizione delle cellule ospiti. Nelle cellule infettate in modo fittizio (mock infected), i nuclei appaiono di un rosso brillante a causa della trascrizione in corso. Poiché le cellule sono state marcate con EU per soltanto un'ora, seguita da fissazione immediata, la maggior parte degli RNA rimane nel nucleo. Al contrario, quando le cellule sono state trattate con Actinomicina-D per inibire farmacologicamente la trascrizione, la fluorescenza rossa dei nuclei è notevolmente ridotta. Questa fluorescenza è ridotta in modo simile quando le cellule sono infettate con MP-12, ma non con il mutante deletato, che non sopprime la trascrizione dell'ospite. In questo caso, le cellule sono state trasfettate con mRNA sintetizzato in vitro anziché infettate con il virus vivo. Il segnale fluorescente rosso nei nuclei indica che, rispetto alle cellule non trasfettate, le cellule trasfettate con mRNA che codifica per la proteina verde fluorescente non hanno modificato l'attività trascrizionale. Solo la trasfezione con mRNA che codifica per il fattore di virulenza NSs del virus della febbre del Rift Valley determina una riduzione della fluorescenza rossa. Quando quantificati, i dati di citometria a flusso ottenuti possono essere rappresentati come grafici a dispersione, in cui il segnale fluorescente per l'incorporazione di EU nell'RNA nascente è riportato sull'asse Y e quello per la colorazione anti-virus della febbre del Rift Valley sull'asse X. Le porte dei quadranti sono state impostate in modo che la maggioranza delle cellule mock infected si trovasse nel quadrante in alto a sinistra. La maggioranza delle cellule trattate con actinomicina-D si trovava nel quadrante in basso a sinistra e la maggioranza delle cellule infette si trovava nella metà destra del grafico. Quando le cellule sono state infettate con MP-12, l'81,5% del totale delle cellule, ovvero il 93% delle cellule positive all'anticorpo anti-virus della febbre del Rift Valley, ha mostrato un'attività trascrizionale ridotta. Al contrario, quando le cellule sono state infettate con MP-12, clone 13-tipo, l'81,6% del totale delle cellule, ovvero il 97% delle cellule positive all'anti-virus della febbre del Rift Valley, ha mostrato un'attività trascrizionale paragonabile a quella delle cellule mock infected. Questi dati possono anche essere rappresentati sotto forma di un istogramma relativo all'etichettatura fluorescente dell'RNA mediante incorporazione di EU. Successivamente, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunomarcatura intracellulare, al fine di visualizzare l'espressione delle proteine virali in queste cellule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la chimica click per visualizzare l'attività trascrizionale nelle cellule infettate da virus, sia mediante microscopia fluorescente che mediante citometria a flusso.Non dimenticare che lavorare con virus infettivi può essere estremamente pericoloso; pertanto, adotta precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati ed evitare l'inalazione di aerosol.

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