Introduzione a Saccharomyces cerevisiae

An Introduction to <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

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10:48 min
April 30, 2023

Overview

Saccharomyces cerevisiae (comunemente noto come lievito di birra) è un eucariota unicellulare che viene frequentemente utilizzato nella ricerca scientifica. S. cerevisiae è un organismo modello attraente per il fatto che il suo genoma è stato sequenziato, la sua genetica è facilmente manipolabile ed è molto facile da mantenere in laboratorio. Poiché molte proteine del lievito sono simili in sequenza e funzione a quelle che si trovano in altri organismi, gli studi condotti sul lievito possono aiutarci a determinare come funziona un particolare gene o proteina negli eucarioti superiori (compresi gli esseri umani).

Questo video fornisce un’introduzione alla biologia di questo organismo modello, come è stato scoperto e perché i laboratori di tutto il mondo lo hanno selezionato come modello di scelta. Vengono anche discussi studi precedenti condotti in S. cerevisiae che hanno contribuito alla nostra comprensione di importanti processi cellulari come il ciclo cellulare, l’invecchiamento e la morte cellulare. Infine, il video descrive alcuni dei molti modi in cui le cellule di lievito vengono messe al lavoro nella moderna ricerca scientifica, tra cui la purificazione delle proteine e lo studio dei meccanismi di riparazione del DNA e di altri processi cellulari legati alle malattie di Alzheimer e Parkinson.

Procedure

Saccharomyces cerevisiae,altrimenti noto come lievito di birra, è uno dei tanti organismi modello studiati nei laboratori di tutto il mondo. Poiché il suo genoma è stato sequenziato, la sua genetica è facilmente manipolabile ed è facile da mantenere in laboratorio, questa specie di lievito è stata una risorsa inestimabile nella comprensione dei processi cellulari fondamentali come la divisione cellulare e la morte cellulare. Questo video ti darà una panoramica di questo organismo modello e della sua vasta gamma di applicazioni nella ricerca biologica e biomedica.

Il lievito appartiene al dominio Eukaryota, che è composto da organismi con nuclei legati alla membrana, indicati come eucarioti. Insieme a funghi e muffe, S. cerevisiae appartiene al Regno Funghi per la presenza di una parete cellulare fatta di chitina, un polimero polisaccaride che si trova non solo nei funghi, ma anche negli esoscheletri di insetti e crostacei.

È interessante notare che molte proteine presenti nel lievito condividono sequenze simili con le proteine dei loro compagni eucarioti. Queste proteine sono spesso omologhe e le loro sequenze simili indicano che gli organismi condividono un antenato comune. Studiando la funzione di una determinata proteina nel lievito, i ricercatori ottengono informazioni sulla funzione della proteina negli eucarioti superiori, come noi, gli esseri umani.

In natura, S. cerevisiae si trova in ambienti caldi e umidi, con una fonte di zucchero a portata di mano. Uno dei suoi luoghi di ritrovo preferiti è il vigneto, dove si sofferma sulla buccia dell’uva.

S. cerevisiae ha una forma ovoidale da rotonda a ellissoidale ed è tipicamente di 5-10 micrometri di diametro se visualizzato utilizzando un microscopio a campo luminoso.

Quando la maggior parte delle cellule eucariotiche si divide attraverso la mitosi e la citochinesi, c’è un’uguale segregazione del materiale genetico e del citoplasma nelle cellule figlie. D’altra parte, S. cerevisiae subisce la divisione cellulare attraverso un processo chiamato germogliamento.

Questa forma di riproduzione asessuata comporta la formazione di una gemma appena sintetizzata dalla cellula madre, che cresce di dimensioni durante tutto il ciclo cellulare fino alla citochinesi. A differenza della tipica divisione cellulare eucariotica, le due cellule non sono di dimensioni uguali dopo la mitosi.

Ora che abbiamo imparato un po ‘di S. cerevisiae come organismo, discutiamo di ciò che lo rende un ottimo sistema modello per la ricerca.

In primo luogo, le cellule di lievito crescono rapidamente e si dividono approssimativamente ogni 90 minuti. In secondo luogo, sono facili da coltivare e richiedono solo una semplice tecnica e strumentazione per la propagazione. In terzo luogo, essendo il primo organismo eucariotico ad avere il suo intero genoma sequenziato, S. cerevisiae ha tutte le sue sequenze geniche pubblicamente disponibili tramite il database del genoma del lievito.

Anche la manipolazione genetica del lievito è estremamente pratica. La maggior parte dei vettori di S. cerevisiae, portatori di una sequenza di DNA di interesse, sono vettori navetta. I vettori shuttle sono solitamente plasmidi che possono propagarsi in due specie diverse, come E. coli e S. cerevisiae. Ciò consente di eseguire la clonazione molecolare in E. coli, ad esempio per incorporare il gene per la proteina fluorescente verde delle meduse in un vettore navetta, che può essere introdotto nel lievito per farli brillare.

Il plasmide integrativo del lievito è un tipo di vettore navetta che consente l’incorporazione di DNA estraneo nel genoma del lievito attraverso un processo chiamato ricombinazione omologa. La ricombinazione omologa è uno scambio di DNA tra sequenze corrispondenti o simili che si traduce in un crossover genetico tra il vettore e il DNA genomico dell’ospite. Ciò può causare l’uscita di un gene o lo scambio di un gene con un altro. Inoltre, poiché la ricombinazione omologa provoca l’integrazione nel genoma dell’ospite, il cambiamento genetico persiste dopo che la cellula di lievito si divide.

Ora che sai cosa rende il lievito così conveniente per lo studio, diamo un’occhiata al motivo per cui queste piccole creature sono state così importanti scientificamente. Molto, molto tempo fa, all’inizio del 6 ° millennio B.C., il lievito era coinvolto nella fermentazione delle uve per fare vino. Il lievito in seguito ha avuto un ruolo nella cottura del pane nell’antico Egitto.

Fu solo nel 1856 che Luis Pasteur identificò S. cerevisiae come il microbo chiave per la vinificazione e la cottura del pane. Ha classificato il lievito come un anaerobe facoltativo, che, in assenza di ossigeno, passa alla fermentazione, un processo che consente al lievito di metabolizzare gli zuccheri e produce alcol come sottoprodotto. In questo processo, il piruvato, prodotto dalla glicolisi, viene ridotto ad acetilaldeide, che viene poi, grazie alla conversione del NADH in NAD+, ridotto a etanolo, l’ingrediente determinante nel vino.

Saltando avanti al 20 ° secolo, la scoperta delle proteine che regolano il ciclo cellulare è stata trovata nel lievito da Hartwell e Nurse.

Il ciclo cellulare è una serie di eventi cellulari che include la corretta replicazione e segregazione del DNA nucleare prima che una cellula si divida. L’identificazione della proteina ciclina e della chinasi ciclina-dipendente, insieme al cambiamento della loro abbondanza relativa attraverso l’interfase e la mitosi, ha suggerito che queste proteine sono regolatori chiave della divisione cellulare. La natura altamente conservata di queste proteine rende il loro studio nel lievito prezioso per comprendere il ruolo delle chinasi ciclina-dipendenti negli organismi multicellulari, come la disregolazione del ciclo cellulare, che può portare alla divisione cellulare incontrollata, o al cancro.

Avanzando fino a 15 anni dopo, Blackburn, Greider e Szostak fecero studi rivoluzionari nella comprensione dei telomeri e nella scoperta delle telomerasi. I telomeri sono sequenze ripetitive di DNA alla fine di un cromosoma che impediscono al DNA genomico di degenerare. L’aggiunta di queste sequenze ripetitive viene effettuata dalle telomerasi all’estremità 3′ fiancheggiante del cromosoma, e la complementazione dei nucleotidi è seguita dalla DNA polimerasi nel filamento in ritardo. I telomeri hanno implicazioni nell’invecchiamento poiché questi segmenti di DNA si accorciano per tutta la vita di un organismo.

Ancora più recentemente, nel 1992, Ohsumi e i suoi colleghi hanno scoperto geni che regolano l’autofagia, una sorta di riciclaggio cellulare. Durante la fame di nutrienti, gli organelli sacrificabili vengono inghiottiti da un autofagosoma. L’autofagosoma si fonderà quindi con un lisosoma, al fine di scomporre ulteriormente le proteine organellari in amminoacidi essenziali per la produzione di nuove proteine. L’autofagia è coinvolta negli importanti meccanismi cellulari che proteggono dagli agenti patogeni invasori e dalla crescita del tumore.

Ci sono una vasta gamma di applicazioni per lo studio del lievito. Il lievito può, ad esempio, essere utilizzato per studiare la mitofagia, che è la rimozione dei mitocondri danneggiati dagli autofagosomi. Questo processo ha implicazioni in malattie come l’Alzheimer e il Parkinson. In questo video, l’autofagia è indotta nelle cellule di lievito con l’aggiunta di mezzo di fame di azoto. Successivamente, le cellule vengono preparate per la microscopia a fluorescenza, al fine di osservare la mitofagia nelle cellule affamate di azoto.

S. cerevisiae è usato per esprimere e purificare grandi quantità di proteine, ad esempio la proteina regolante la conduttanza transmembrana della fibrosi cistica. In questo video, le cellule di lievito che trasportano il plasmide CFTR vengono coltivate in grandi colture. Successivamente, viene eseguita la centrifugazione delle cellule per separare i microsomi. I microsomi sono vasi artefatti formati dal reticolo endoplasmatico quando le cellule vengono interrotte. L’isolamento e la purificazione del CFTR dai microsomi consentiranno agli scienziati di studiare la struttura della proteina utilizzando metodi come la cristallografia a raggi X.

Il lievito può anche essere utilizzato come sistema modello per studi genetici delle proteine di riparazione del DNA umano. Queste proteine rilevano e riparano il DNA danneggiato al fine di prevenire la proliferazione di cellule portatrici di un genoma difettoso, come le cellule tumorali. Qui vedete autori che placcano cellule di lievito con la proteina di riparazione del DNA trasformata, WRN, su piastre di media selettivi. La morfologia cellulare dei mutanti per WRN può essere visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza e il rilevamento di questa proteina nel lizzata cellulare viene effettuato eseguendo un gel proteico per l’analisi Western Blot.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE a S. cereviae. In questo video abbiamo recensito: la storia, la biologia cellulare e molecolare e le applicazioni biomediche di S. cerevisiae. Speriamo che il nostro video ti sia piaciuto e ti invitiamo a condividerlo con un bocciolo.

Transcript

Saccharomyces cerevisiae, otherwise known as baker’s yeast, is one of the many model organisms studied in laboratories all over the world. Because it’s genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is easy to maintain in the lab, this species of yeast has been an invaluable resource in the understanding of fundamental cellular processes such as cell division and cell death. This video will give you an overview of this model organism and its wide range of applications in biological and biomedical research.

Yeast belong to the domain Eukaryota, which is comprised of organisms with membrane-bound nuclei, referred to as eukaryotes. Along with mushrooms and molds, S. cerevisiae belongs to the Kingdom Fungi due to the presence of a cell wall made out of chitin, a polysaccharide polymer that’s found not only in Fungi, but also in the exoskeletons of insects and crustaceans.

Interestingly, many proteins found in yeast share similar sequences with proteins from their fellow Eukaryotes. These proteins are often homologous, and their similar sequences indicate that the organisms share a common ancestor. By investigating the function of a given protein in yeast, researchers gain insight into the protein’s function in higher eukaryotes, such as us, humans.

In nature, S. cerevisiae is found in warm, moist environments, with a source of sugar close at hand. One of its favorite hang out spots is the vineyard, where it dwells on grape skin.

S. cerevisiae has a round to ellipsoidal ovoid shape and is typically 5-10 micrometers in diameter when visualized using a bright field microscope.

When most eukaryotic cells divide via mitosis and cytokinesis, there is an equal segregation of genetic material and cytoplasm in daughter cells. On the other hand, S. cerevisiae undergoes cell division through a process called budding.

This form of asexual reproduction involves the formation of a newly synthesized bud from the mother cell, which grows in size throughout the cell cycle until cytokinesis. Unlike typical eukaryotic cell division, the two cells are not equal in size following mitosis.

Now that we’ve learned a bit about S. cerevisiae as an organism, let’s discuss what makes it a great model system for research.

First, yeast cells grow quickly and divide approximately every 90 minutes. Second, they are easy to grow, and need only simple technique and instrumentation for propagation. Third, being the first eukaryotic organism to have its entire genome sequenced, S. cerevisiae has all of its gene sequences publicly available via the yeast genome database.

Genetic manipulation of yeast is also extremely practical. Most S. cerevisiae vectors, carriers of a DNA sequence of interest, are shuttle vectors. Shuttle vectors are usually plasmids that can propagate in two different species, such as both E. coli and S. cerevisiae. This allows molecular cloning to be performed in E. coli, say to incorporate the gene for green fluorescent protein from jellyfish into a shuttle vector, which can be introduced in yeast to make them glow.

The yeast integrative plasmid is a type of shuttle vector which allows incorporation of foreign DNA into the yeast genome through a process called homologous recombination. Homologous recombination is an exchange of DNA between matching or similar sequences that results in a genetic crossover between the vector and host genomic DNA. This can cause a gene to be knocked out, or one gene to be swapped with another. In addition, since homologous recombination results in integration into the host genome, the genetic change persists after the yeast cell divides.

Now that you know what makes yeast so convenient for study, let’s have a look at why these little critters have been so important scientifically. A long, long time ago, in early 6th millennium B.C., yeast was involved in the fermentation of grapes to make wine. Yeast later played a role in baking bread in ancient Egypt.

It was not until 1856 that Luis Pasteur identified S. cerevisiae as the key wine-making and bread-baking microbe. He classified yeast as a facultative anaerobe, which, in the absence of oxygen, switches to fermentation, a process that allows yeast to metabolize sugars and produces alcohol as a byproduct. In this process, pyruvate, which is produced by glycolysis, is reduced to acetylaldehyde, which is then, thanks to the conversion of NADH to NAD+, reduced to ethanol, the defining ingredient in wine.

Jumping ahead to the 20th century, the discovery of proteins that regulate the cell cycle were found in yeast by Hartwell and Nurse.

The cell cycle is a series of cellular events that includes the proper replication and segregation of nuclear DNA before a cell divides. The identification of the protein cyclin and cyclin-dependent kinase, along with the change in their relative abundance through interphase and mitosis, suggested that these proteins are key regulators of cell division. The highly conserved nature of these proteins makes their study in yeast valuable for understanding the role of cyclin-dependent kinases in multicellular organisms, such as the dysregulation of the cell cycle, which can lead to uncontrolled cell division, or cancer.

Advancing to 15 years later, Blackburn, Greider, and Szostak made breakthrough studies in understanding telomeres as well as the discovery of telomerases. Telomeres are repetitive sequences of DNA at the end of a chromosome that prevent genomic DNA from degenerating. The addition of these repetitive sequences is carried out by telomerases at the 3’ flanking end of the chromosome, and complementation of nucleotides is followed by DNA polymerase in the lagging strand. Telomeres have implications in aging as these DNA segments get shorter throughout an organism’s lifetime.

Even more recently, in 1992, Ohsumi and his colleagues discovered genes regulating autophagy, a kind of cell recycling. During nutrient starvation, expendable organelles are engulfed by an autophagosome. The autophagosome will then fuse with a lysosome, in order to further break down organellar proteins to amino acids essential for making new proteins. Autophagy is involved in the important cellular mechanisms that protect against invading pathogens and tumor growth.

There are a wide range of applications for the study of yeast. Yeast can, for example, be used to study mitophagy, which is the removal of damaged mitochondria by autophagosomes. This process has implications in diseases such as Alzheimer’s and Parkinson’s. In this video, autophagy is induced in yeast cells with the addition of nitrogen starvation medium. Next, cells are prepared for fluorescence microscopy, in order to observe mitophagy in nitrogen-starved cells.

S. cerevisiae is used to express and purify large amounts of proteins, for example the cystic fibrosis transmembrane conductance regulatory protein. In this video, yeast cells carrying the CFTR plasmid are grown in large cultures. Next, centrifugation of the cells is carried out in order to separate the microsomes. Microsomes are artifactual vessels formed from the endoplasmic reticulum when cells are disrupted. Isolation and purification of CFTR from microsomes will allow scientists to study the structure of the protein by using methods such as x-ray crystallography.

Yeast can also be used as a model system for genetic studies of human DNA repair proteins. These proteins detect and fix damaged DNA in order to prevent proliferation of cells carrying a defective genome, such as cancer cells. Here you see authors plating yeast cells with the transformed DNA repair protein, WRN, on selective media plates. Cell morphology of mutants for WRN can be visualized using fluorescence microscopy, and detection of this protein in cell lysate is carried out by running a protein gel for Western Blot analysis.

You’ve just watched JoVE’s introduction to S. cereviae. In this video we reviewed: the history, cell and molecular biology, and biomedical applications of S. cerevisiae. We hope you enjoyed our video, and we encourage you to share it with a bud.