Name: Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine di membrana In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Scopri il metodo Membrana-SPINE per identificare interazioni proteina-proteina di membrane in vivo. Utilizza reticolazione con formaldeide, purificazione con tag streptavidina e spettrometria di massa per rivelare interazioni deboli o transitorie.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 di SH

Nota: Le informazioni per i buffer indicati nel protocollo è disponibile in Tabella 1. 1. Fissazione delle interazioni proteina-proteina da formaldeide Cross-linking nelle cellule viventi <ol><li> Per iniziare a preparare i terreni di crescita, soluzioni madre e tampone P1 <ol><li> Preparare medie 500 ml: Il mezzo deve offrire le condizioni che supportano l&#39;interazione tra proteina di membrana esca e proteine ​​preda. Inoltre, un esperimento deve essere effettuato in condizioni in cui si prevede alcuna interazione (ad esempio, senza cross-linking). Nota: Confrontiamo interazioni proteina-proteina nei batteri stressati e non stressati. Pertanto, ci prepariamo 500 ml Luria Bertani (LB) medio (Tabella 1) che ci completiamo con un agente stressante (ad esempio 0,5 M NaCl) in un pallone da 2 L Erlenmeyer. Per il controllo, usiamo normale medio LB con 0,17 M NaCl (pH 7,0). </li><li> Preparare Tris-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) e 0,1 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), soluzione 8,0 archivio di pH (Tabella 1). </li><li> Preparare tampone P1. Sciogliere saccarosio ad una concentrazione finale di 0,5 M in tampone Tris. Sterilizzare tampone P1 per filtrazione e conservarlo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Crescere cellule che esprimono la proteina di membrana esca con un C-terminale Strep-tag fusion da un vettore. Indurre l&#39;espressione di proteine ​​esca membrana per un tempo sufficiente. Nota: indurre l&#39;espressione di proteine ​​di membrana esca batteriche in fase precoce-log (A 600 = 0,3) mediante aggiunta di 250 microlitri 1 M isopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a 500 ml di mezzo (concentrazione finale: 0,5 mM) . Per consentire l&#39;espressione sufficiente, abbiamo incubare i batteri fino alla fase tardo-log (A 600 = 1.2). </li><li> Preparare per ogni cultura due bicchieri centrifuga con un volume minimo di 300 ml ciascuno e disporli sul ghiaccio. </li><li> Eseguire formaldeide cross-linking. CAUZIONE: La formaldeide è altamente tossico Si consiglia di lavorare sotto una cappa aspirante sicurezza.. <ol><li> Trasferire il recipiente di coltura sotto una cappa di sicurezza. Dividere ogni campione in due campioni, uno omettendo reticolazione (- X) e uno compresa la formaldeide reticolante (+ X). Aggiungere la soluzione di formaldeide 4 ml 37% a 250 ml cultura per raggiungere una concentrazione finale di 0,6%. </li></ol></li><li> Trasferire i recipienti di coltura indietro e far crescere le cellule per ulteriori 20 minuti come prima. </li><li> Riempite i vostri culture nelle provette da centrifuga sotto una cappa di sicurezza. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 xg per 30 min. </li><li> Gettare il surnatante pipettando con cautela sotto una cappa di sicurezza. Raccogliere tossico-formaldeide contenente surnatante e smaltirla in modo appropriato. </li><li> Al fine di raggiungere il rendimento ottimale durante la preparazione di proteine ​​di membrana, preparare prima sferoplasti. Qui, forniamo un protocollo per la formazione spheroplast di batteri Gram-negativi: <ol><li> Prepae tampone P2 (Tabella 1) da polvere liofilizzata. Sciogliere delicatamente 2 mg di lisozima in 0,1 M EDTA, pH 8, in una provetta da 1,5 ml. Sempre preparare tampone P2 fresco per il giorno dell&#39;esperimento. </li><li> Preparare tampone Tris con inibitore della proteasi (tampone P3). A 10 ml di tampone Tris, aggiungere 0,1 ml di 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (Tabella 1) ad una concentrazione finale di 10 mM. Utilizzare il buffer immediatamente, per garantire il corretto funzionamento di PMSF come inibitore della proteasi. </li><li> Pellet cellulari risospendere in 10 ml di tampone Tris con inibitori della proteasi e la soluzione di trasferimento in una provetta da 15 ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone P2 e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Raccogliere sferoplasti per centrifugazione a 3000 g per 30 minuti e scartare con attenzione il surnatante. </li></ol></li><li> Incubare il pellet spheroplast notte a -20 ° C. </li></ol> 2. Purificazione di Strep-tag Membrane Protein (Bait) <ol><li> Mettere spheroplast pellet sul ghiaccio. &lt;/ Li&gt; <li> Durante il tempo i pellets spheroplast disgelo su ghiaccio, preparare 10 ml tampone P3 per ciascun preparato spheroplast. Sciogliere delicatamente 1 mg DNaseI in 10 ml di tampone Tris. Aggiungere 0,1 ml di 1 M PMSF prima dell&#39;uso. </li><li> Risospendere il pellet in 6 ml P3 preparati al momento. Sonicare il campione quattro volte per 1 minuto continuamente su ghiaccio con 1 min pausa tra ciascun burst, al fine di interrompere sferoplasti. </li><li> Centrifugare il campione a 10.000 xg per 10 min a detriti cellulari raccolto. Trasferire il surnatante con una pipetta ad un tubo ultracentrifuga. </li><li> Pellet la frazione di membrana a 100.000 xg per 30 min. Lavare il pellet con cura in Tris-buffer, senza scioglierla. Essiccare il tubo con un fazzoletto di carta (ad esempio Kleenex). Evitare di disturbare il pellet in qualsiasi momento. </li><li> Risospendere accuratamente il pellet (= membrane) in 1 ml di tampone Tris. Usare un&#39;aliquota di 20 microlitri per determinare la concentrazione proteica mediante saggio es BCA. A questo punto, le membrane possono essere scosse congelati in Liazoto quid e conservati a -80 ° C. </li></ol> 3. Purificazione di Strep-tag membrana Bait Proteine ​​e SDS-PAGE <ol><li> Normalizzare la concentrazione proteica della frazione di membrana a 5 mg / ml con tampone Tris. Prendere 2,5 ml frazione di membrana (5 mg / ml) in una provetta ultracentrifuga e aggiungere 0,25 ml di 20% Triton X-100 per raggiungere una concentrazione finale del 2%, in modo da solubilizzare le proteine ​​di membrana. Aggiungi una canna micro-magnetico e mescolare in ghiaccio per 1 ora. Nota: Anche se in generale abbiamo buoni risultati con Triton X-100 come detergente, potrebbe essere utile cambiare il detersivo per l&#39;ottimizzazione. A questo proposito, abbiamo migliori risultati con quelli detergenti usati per la purificazione funzionale della rispettiva proteina di membrana esca. </li><li> Durante l&#39;esecuzione passo 3.1, preparare 50 ml di soluzione tampone W e 5 ml di tampone E da (Tabella 1). Riempire 10 ml tampone 5x W concentrato a 50 ml e aggiungere 150 microlitri 20% Triton X-100. <ol><li> Riempire 1 ml 5x buffer E concentrato a 10 ml e aggiungere 30 ml 20% Triton X-100. Equilibrare un Strep-Tactin superflow gravità colonna 1 ml di flusso con 8 ml di soluzione tampone W. Nota: E &#39;essenziale per il detersivo utilizzato per solubilizzazione in una concentrazione 10 volte superiore alla concentrazione micellare critica (CMC) in ogni buffer durante la procedura di purificazione. </li></ol></li><li> Rimuovere l&#39;asta di micro-magnetico dal campione solubilizzazione e ultracentrifuga a 100.000 xg per 30 min, per far sedimentare la frazione di membrana insolubile. Rimuovere il surnatante con una pipetta per ulteriore purificazione. </li><li> Caricare il supernatante alla colonna. Eseguire la colonna solo con il flusso di gravità. Lavare la colonna con 5 ml di tampone W. Ripetere questa fase di lavaggio 5x. </li><li> Eluire le proteine ​​di membrana esca con 1 ml di tampone E. Ripetere questo passaggio eluizione 4x. </li><li> Concentrato frazioni di eluizione 2, 3, e da 4 a 300 ul di un&#39;unità filtro centrifugo. </li><li> Mescolare 200 ml di ogni campione con 50 microlitri 5x SDS-PAGE colorante di caricamento. Split ogni preparazione in 125 microlitri aliquote. Bollire un&#39;aliquota di ciascuna preparazione per 20 min a 95 ° C, per invertire formaldeide legami crociati. Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente per almeno 10 minuti sul banco superiore. </li><li> Carico 30 microlitri di ciascun campione in una singola corsia di un gel di poliacrilammide-adatto per immunoblotting. Usare un pennarello prestained peso molecolare per la migliore orientamento ed eseguire SDS-PAGE 10. </li></ol> 4. Immunoblot analisi per confermare partner di interazione <ol><li> Una volta passo 3.8 è completato, proteine ​​di trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa per es semisecco. </li><li> Bloccare la membrana per impedire l&#39;etichettatura aspecifica. Preparare tampone di bloccaggio mediante pesatura albumina di siero bovino (BSA) per ottenere 3% in peso per volume in soluzione salina tamponata con Tris supplementato con una concentrazione finale di 0,05% Tween-20 (TBS-T). Utilizzare un volume sufficiente di tampone di bloccaggio per coprire la membrana. Bloccare la membrana per 1 ora a RT. </li><li> Diluire unnd incubare il primo anticorpo specifico proteine ​​preda come al solito. Utilizzare un anticorpo HRP-linked come secondo anticorpo. </li><li> Sviluppare l&#39;immunoblot utilizzando un kit rivelazione chemiluminescente ad alta sensibilità. Monitorare il segnale utilizzando una procedura classica lavorazione del film o apparecchiature di imaging digitale. </li></ol> 5. Esperimenti NanoLC-ESI-MS/MS ad alta risoluzione per identificare partner di interazione <ol><li> Nel caso in cui nessun anticorpo specifico è disponibile per la proteina preda o partner di interazione sconosciuti dovrebbero essere identificata, utilizzare la spettrometria di massa (MS) per l&#39;identificazione. Al fine di prevenire la contaminazione cheratina, usare gel prefabbricato per la separazione delle proteine. </li><li> Argento macchia la SDS-PAGE usando un kit di colorazione compatibile MS secondo il protocollo del produttore. Eseguire tutte le operazioni di colorazione e lavaggio in vasche di vetro. </li><li> Accise rispettive bande ed analizzare questi per alta risoluzione LC / MS 9. </li></ol>

<ol><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li>
<li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li>
<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li>
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<li>Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-SPINE%3A+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li>
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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Analisi membrana colonna vertebrale è un approccio biochimico che permette di confermare e per identificare a questo punto sconosciuti partner di interazione di proteine ​​di membrana. Membrana SPINE combina in vivo reticolazione da formaldeide con purificazione di una proteina di membrana esca Strep-tag. La combinazione con immunoblotting facilita la conferma di partner di interazione previsti (Figura 2). Inoltre, la combinazione con analisi MS consente l&#39;identificazione di partner di inte...

Per comprendere la funzione di una proteina è fondamentale conoscere i suoi partner di interazione. Diverse tecniche classiche sono disponibili per l&#39;identificazione di partner di interazione di proteine ​​solubili. Tuttavia, queste tecniche non sono facilmente trasferibili ad proteine ​​della membrana a causa della loro natura idrofoba 4. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato il Strep-proteina esperimento di interazione membrana (Membrane-SPINE) 6. Si basa sul metodo colonna vertebrale, che è adatto solo per le proteine ​​solubili 7. Benefici membrana e colonna vertebrale da due vantaggi della formaldeide agente reticolante: primo, formaldeide possono facilmente penetrare le membrane e quindi genera un&#39;istantanea precisa dell&#39;interattoma di una cellula vivente 8. In secondo luogo, formaldeide cross-link possono essere invertite bollendo 9. Qui, questi due vantaggi sono utilizzati per identificare non solo gli IPP permanenti, ma anche transitori di membrana proteins 6. In breve, un Strep-tag è fuso al C-terminale della proteina di membrana integrale esca. Cellule che esprimono la proteina esca membrane vengono incubate con formaldeide che legami incrociati preda proteine ​​alla proteina esca membrana (Figura 1). Non sono necessarie modificazioni delle proteine ​​preda. Successivamente, la frazione di membrana è disposta. Pertanto, proteine ​​di membrana vengono solubilizzati mediante trattamento detergente e esca proteine ​​sono co-purificati con le sue proteine ​​preda utilizzando purificazione per affinità. Successivamente, il cross-link è invertita mediante ebollizione, e l&#39;esca e le sue proteine ​​preda co-eluiti sono separati mediante SDS-PAGE. Infine, le proteine ​​preda possono essere identificati mediante analisi immunoblot o spettrometria di massa.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldeide</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Non deve essere più vecchio di un anno</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Asta micromagnetica</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm di lunghezza, 2 mm di diametro</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>detergente standard per solubilizzazione</td></tr><tr><td>n-Dodecil-beta;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>il miglior detergente per solubilizzare CpxA</td></tr><tr><td>1 ml Colonna di flusso per gravità superflow Strep-Tactin</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Set di tamponi per la purificazione delle proteine Strep-tag</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Contiene tampone W e tampone</td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Amicon Ultra-4</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Substrato chemiluminescente SuperSignal West Pico</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Kit di colorazione dell'argento</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Kit di colorazione</td><td>Proteome Factory</td><td>PS-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrana-spine: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana in vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Le proteine ​​di membrana sono essenziali per la vitalità delle cellule e sono quindi importanti bersagli terapeutici 1-3. Dal momento che funzionano in complessi 4, sono necessari metodi per identificare e caratterizzare le loro interazioni 5. A questo scopo, abbiamo sviluppato l&#39;esperimento di interazione Strep-proteina di membrana, denominata membrana SPINE 6. Questa tecnica combina in vivo reticolazione usando l&#39;reversibile reticolante formaldeide con purificazione per affinità di una proteina di membrana esca Strep-tag. Durante la procedura, proteine ​​preda reticolati sono co-purificati con la proteina esca membrana e successivamente separati mediante ebollizione. Quindi, due compiti principali possono essere eseguiti quando si analizzano le interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana con membrana SPINE: in primo luogo, la conferma di un partner di interazione proposto da immunoblotting, e in secondo luogo, l&#39;individuazione di nuovi partner di interazione mediante analisi di spettrometria di massa . Inoltre, anche low affinità, PPI transitori sono rilevabili da questa tecnica. Infine, membrana SPINE è adattabile a quasi ogni tipo di cellula, che lo rende applicabile come strumento di screening potente per identificare PPI di proteine ​​di membrana.

Analisi membrana SPINE permette la co-purificazione di proteine ​​di membrana e transitoriamente interagenti partner proteici. Il co-purificazione è ottenuto utilizzando l'agente formaldeide reticolazione. Due parametri sono fondamentali per evitare aspecifiche legami incrociati: la concentrazione di formaldeide e il tempo di reticolazione. L'uso sufficiente, ma non eccessivo di formaldeide può essere facilmente controllato mediante immunoblotting. Complessi proteici formaldeide reticolati possono essere separati median...

Un approccio biochimico è descritto per identificare in vivo interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana. Il metodo combina proteina reticolazione, purificazione per affinità e spettrometria di massa, ed è adattabile a qualsiasi tipo cellula o organismo. Con questo approccio, anche l&#39;identificazione degli IPP transitori diventa possibile.

Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare le proteine in vivo, le interazioni proteiche delle proteine di membrana attraverso un esperimento di interazione proteica streptococco di membrana o colonna vertebrale di membrana. Ciò si ottiene mediante reticolazione in vivo utilizzando il reticolante reversibile per la formaldeide. Il secondo passo consiste nel purificare la proteina esca di membrana marcata con strept insieme alle proteine della preda reticolate.Successivamente, il legame incrociato viene invertito mediante ebollizione. Il passaggio finale è la separazione della proteina esca di membrana e delle proteine della preda co-purificate mediante sodio do desal solfato, elettroforesi su gel di poliacrilammide o pagina SDS. Infine, l'analisi dell'immunoblotting e della spettrometria di massa viene utilizzata per identificare le proteine della preda, consentendo l'analisi delle interazioni proteiche di membrana.Sono Sabina Hunka e oggi vi mostreremo la tecnologia della colonna vertebrale a membrana. Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto ai metodi esistenti come il co IP, è che consente di rilevare anche interazioni proteiche a bassa affinità o transitorie. Kline Shaana ti mostrerà la procedura.È una delle mie studentesse di dottorato che ha sviluppato il protocollo Per iniziare questa procedura, coltivare cellule batteriche che esprimono la proteina esca di membrana con una fusione di streptococco terminale C inducono l'espressione di proteine esca di membrana nella fase logaritmica iniziale mediante l'aggiunta di 0,5 millimolari di IPTG a 500 millilitri di terreno per consentire un'espressione sufficiente. Incubare i batteri fino alla fase di log tardivo. Prepararsi a eseguire la reticolazione della formaldeide sotto una cappa di sicurezza a causa della tossicità della formaldeide.Trasferire il recipiente di coltura sotto una cappa aspirante di sicurezza. Suddividere ogni campione in due campioni, uno che omette la reticolazione e uno che include la reticolazione della formaldeide. Aggiungere quattro millilitri di soluzione di formaldeide al 37% a una coltura da 250 millilitri per raggiungere una concentrazione finale dello 0,6%Trasferire nuovamente i recipienti di coltura e far crescere le cellule per altri 20 minuti come prima.Quindi riempire le colture in provette da centrifuga sotto una cappa di sicurezza. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3000 volte G per 30 minuti. Rimuovere il surnatante mediante prima decantazione e poi aspirazione.Utilizzando una pipetta sotto una cappa di sicurezza, scartare i surnatanti eliminando correttamente il surnatante contenente formaldeide tossica. Al fine di raggiungere una resa ottimale durante la preparazione delle proteine di membrana, in primo luogo, preparare le piastre Sphero per iniziare a sciogliere delicatamente due milligrammi di lisozima in 0,1 molari E-D-T-A-P-H otto in una provetta da 1,5 millilitri. Per preparare il tampone P due, che dovrebbe essere preparato fresco il giorno dell'esperimento.Sospendere i pellet cellulari in 10 millilitri di tampone tris saccarosio appena preparato con inibitore della proteasi e trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di tampone P 2 e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Raccogliere le piastre Sphero mediante centrifugazione a 3000 volte G per 30 minuti ed eliminare il surnatante.Incubare con cura i pellet Sphero plast per una notte a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius lavorando sul ghiaccio. Resus sospendere il palato Sphero Plast in sei millilitri di tampone appena preparato. P tre.Sonicare il campione quattro volte per un minuto ininterrottamente sul ghiaccio con una pausa di un minuto tra ogni raffica. Per disgregare la centrifuga Sphero plast, il campione a 10.000 volte G per 10 minuti per raccogliere i detriti cellulari dopo la centrifugazione. Trasferire il surnatante utilizzando una pipetta in una provetta per ultracentrifuga.Pellettare la frazione di membrana a 100.000 volte G per 30 minuti. Lavare accuratamente il pellet in tampone tris da 20 millimolari pH otto senza scioglierlo. Quindi avvitare un tubo con un fazzoletto di carta evitando di disturbare il pellet in qualsiasi momento.Per risospendere il pellet contenente le membrane, aggiungere un millilitro di tris, tamponare una micro barra magnetica e risospendere il pellet, in parte con una pipetta agitare sul ghiaccio per un'ora, utilizzare un'aliquota da 20 microlitri per determinare la concentrazione proteica. Normalizzare la concentrazione proteica della frazione di membrana a cinque milligrammi per millilitro con tampone tris, pipettare 2,5 millilitri della frazione di membrana in una provetta per ultracentrifuga e aggiungere 0,25 millilitri di Triton X 100 al 20% per raggiungere una concentrazione finale del 2% al fine di solubilizzare le proteine di membrana. Quindi aggiungere una micro bacchetta magnetica e mescolare con ghiaccio per un'ora.Equilibrare una colonna di flusso per gravità da un millilitro di actina da strepto con otto millilitri di tampone. W.Rimuovere l'asta micromagnetica dal campione di solubilizzazione e ultracentrifugare a 100, 000 volte G per 30 minuti per pellettare la frazione di membrana insolubile al termine della corsa, rimuovere lo stato utilizzando una pipetta. Per un'ulteriore purificazione, applicare il surnatante sulla colonna utilizzando il flusso per gravità.Lavare la colonna con quattro millilitri di tampone W Ripetendo questa fase di lavaggio cinque volte. Eluire le proteine dell'esca di membrana con un millilitro di tampone E.Ripetere questa eluizione. Passo quattro volte, concentrare le frazioni alluse.Due, tre e quattro a 300 microlitri con un'unità di filtraggio centrifuga. Mescolare 200 microlitri di ogni campione con 50 microlitri di cinque x come colorante per il caricamento delle pagine DS. Dividere ogni preparazione in aliquote da 125 microlitri prima dell'ebollizione.Un'aliquota di ogni preparazione per 20 minuti a 95 gradi Celsius per invertire i legami incrociati della formaldeide. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per almeno 10 minuti sul banco. Caricare dall'alto 30 microlitri da ciascun campione su una singola corsia di un gel di poliacrilammide adatto per l'immunoblotting.Utilizzare un marcatore di peso molecolare prestato per il miglior orientamento ed eseguire come pagina DS dopo il trasferimento delle proteine su una membrana di nitrocellulosa. Bloccare la membrana per evitare un'etichettatura non specifica per un'ora. A temperatura ambiente, diluire e incubare l'anticorpo primario specifico per la proteina della preda.Utilizzare un anticorpo legato all'HRP come anticorpo secondario e sviluppare l'immuno blot utilizzando un kit di rilevamento chemiluminescente ad alta sensibilità. Monitora il segnale utilizzando una classica procedura di elaborazione della pellicola o un'apparecchiatura di imaging digitale. Se non sono disponibili anticorpi specifici per la preda, la proteina o l'interazione sconosciuta, devono essere identificati i partner.Utilizzare la spettrometria di massa o la MS per l'identificazione. Macchiare l'argento sulla pagina SDS utilizzando un kit di colorazione compatibile con MS. Secondo il protocollo del produttore, eseguire tutte le fasi di colorazione e lavaggio in serbatoi di vetro.Estrarre le rispettive bande prima di analizzarle con LCMS ad alta risoluzione come proteina esca. È stata utilizzata la proteina di membrana integrale CPXA di VISIA coli. CPXA è una chinasi sensore ed è costituito da un dominio sensore N terminale con due domini transmembrana che integrano un grande dominio sensore extra citoplasmatico e un dominio catalitico citoplasmatico C terminale altamente conservato.Dopo la stimolazione, CPXA attiva il suo regolatore di risposta affine, CPXR attivato CPXR si diffonde per mediare la risposta per la colonna vertebrale della membrana. Il tag streptococco è stato fuso al terminale C di CPX. Un'analisi della colonna vertebrale della membrana rivela che lo streptococco CPXA è reticolato ad altre proteine o complessi proteici indicati da uno striscio nel campione trattato con formaldeide non svelato.Senza trattamento con formaldeide, questo striscio è assente. Inoltre, un'interazione proteina proteina diretta dello streptococco CPXA con la sua proteina regolatrice della risposta affine CPXR come proteina preda è rilevabile solo in presenza di formaldeide. Supportare la specificità della reticolazione della formaldeide con la colorazione dell'argento.È evidente una banda specifica per il campione bollito. La freccia indica una banda che è stata analizzata da MS. Analisi e che ha confermato CPXR come partner di interazione di CPXA. Dopo aver visto questo video, dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare la purificazione di affinità pro e cross linking alla spettrometria di massa per identificare i partner di interazione delle proteine di membrana.

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