Name: Lievito luminometrici e Xenopus ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Scopri la meccanosensibilità del canale ionico TRPV4 usando lievito transgenico e oociti di Xenopus con tecniche di luminometria ed elettrofisiologia. Questo metodo quantitativo offre alternative potenti per studiare la sensibilità meccanica.

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Vorremmo ringraziare Andrea Kremsreiter per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato da NIH GM096088 e Vilas fiducia della University of Wisconsin - Madison.

1. Metodi di lievito luminometria Utilizzare ceppo BYYT di Saccharomyces cerevisiae. Si tratta di un yvc1-tok1-derivato di BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Trasformare cellule con i-equorina esprimendo pEVP1/Aeq plasmide Leu-selezionabili e ura selezionabili rat--TRPV4 esprimendo plasmide p416GPDV4, come descritto in Batiza et al. 26 e Loukin et al. 24 Con metodi standard di costruzione plasmide e trasformazione 27 . Ceppo di lievito e plasmidi sono disponibili su richiesta. <ol><li> Cultura 2 ml di cellule di lievito durante la notte a fase post-logaritmica in uno shaker 30 ° C in leu-ura-&quot;DCD&quot; dropout medio 28 (una variante solfato-impoverito del mezzo CMD-leu-ura 29), integrato con 1M sorbitolo . Seminare 200 ml di queste culture in 1,8 ml di mezzo fresco integrato con 2 micron del Luciferin coelenterazina. Crescere al buio a temperatura ambiente per altre 24 ore senza agitare. </li><li> Misurare la osmolarità della cultura (tipicamente a 1.400 mOsm) e altre soluzioni (sotto) usando un osmometer pressione di vapore. </li><li> Aliquota 20 ml di coltura fresca in un tubo luminometro 12 mm per un singolo luminometro tubo. </li><li> Per lo shock ipotonico, aggiungere 200 ml di una soluzione contenente 25 NaEGTA mM (pH 7,2) o nomi (pH 7.2) e 500-100 mM NaCl, (osmolarità totale di 1,200-400 mOsm) a seconda del grado di shock desiderato. Monitorare costantemente la luminescenza prima e almeno 120 secondi dopo la downshock osmotica, interrotta solo dalla breve operazione di diluizione. Registrati uscita luminometer su un computer desktop come unità di luminescenza relativa (RUL). </li></ol> Anche se non per lo studio di TRPV4 transgenico, abbiamo utilizzato una variante del protocollo di cui sopra in un sistema automatizzato per esaminare le risposte di un gran numero di ceppi di lievito. Studio of risposte alle ipo-30 o iperosmotico 31 stimoli del deletome lievito (la raccolta di 4.906 lievito deletants un singolo gene) usando un luminometro micropiastre e analizzati con il software corrispondente ha avuto successo. 2. e 3. Ovociti Metodi di Elettrofisiologia Elettrofisiologia utilizza metodi di base 32. PCR amplifica la cornice open-lettura della wild-type o TRPV4 mutante con alta fedeltà PfuUtra polimerasi e integrato nel pGH19 33. Ciò comporta un inserimento preciso della ORF tra i 5 &#39;e 3&#39; UTR del Xenopus β-globina ed a valle di un promotore T7 RNA polimerasi. Linearizzare il costrutto valle UTR in 3 &#39;e usato come modelli in vitro un T7 RNA polimerasi in reazione. Utilizzare tecniche di biologia molecolare standard di 34. Utilizzare fase V-VI ovociti da X. laevis. Zootecnia, ovariecto parzialela mia, la rimozione busta defolliculation, e vitellina seguire procedure standard 32,33,35. Iniettare 2-40 ng di soluzione di cRNA per ovocita con un microinjector automatico Drummond Nanoinject II. Iniettare ~ 30 ovociti per ciascuna serie di esperimenti. Dopo l&#39;iniezione TRPV4-cRNA, incubare gli ovociti nel medio ND96 con gentamicina (100 ug / ml) e 1 mM rosso rutenio 14. 2. Due elettrodi di tensione morsetto <ol><li> Tirare borosilicato pipette di registrazione vetro dalla precisione monouso Micropipette 100 microlitri individualmente con un estrattore pipetta. </li><li> Pull sia la tensione di misura ed elettrodi pipette correnti-iniezione sono tirato avere un&#39;apertura punta di circa 1 micron di diametro. </li><li> Elettrodi recupero informazioni con 2 M KCl conseguente 0,1-0,2 resistenza mW. Li montano sul headstages HS2A, che insieme ad un virtuale di messa a terra clamp bagno VG-2Ax100, sono collegati ad una interfaccia amplificatore GeneClamp 500 attraverso un Digidata 1440 digitalizzatore. Acquisire<html> dati utilizzando il software pClamp10. </li><li> Mettere l&#39;ovocita da testare in un bagno di 1 ml in una camera di plastica fabbricato montato sul palco di un microscopio da dissezione con 20X di ingrandimento. La soluzione del bagno è virtuale a terra da un ponte agar 3 M KCl e un filo di argento clorurato collocati in prossimità del ovocita e collegato ad una fase terra virtuale VG-2A. </li><li> Costruire la camera di perfusione continua con tubi di plastica come soluzione di ingresso e di uscita. Collegare il tubo di ingresso è collegato ad un sistema di perfusione fabbricato, che è un collettore di sei conchiglie siringa 50 ml, riempiti ognuno con una soluzione differente. Velocità di avanzamento di gravità di qualsiasi soluzione particolare è controllato da ~ 2-3 ml / min con fascette di rampa &quot;Keck&quot; sui tubi. </li><li> Montare entrambi gli elettrodi con i loro headstages su micromanipolatori. Eseguire penetrazioni degli elettrodi l&#39;ovocita da micromanipolazione. </li></ol> 3. Patch Clamp Esame della diretta mechanosensitivity &quot;&gt; I metodi di base di patch clamp compresa la preparazione pipetta, formazione GΩ-sigillo, e la formazione di on-cella o modalità escisse sono quelli in Hamill et al. Conn 36 e 32. <ol><li> Riempire pipette in vetro borosilicato con una ~ 1 micron apertura del diametro in punta (numero bolla 5-6) con 98 mM KCl, 1 mM MgCl 2, e 10 mM K +-HEPES, pH 7.2. </li><li> Fissare la pipetta patch clamp attraverso un tubo di plastica per una siringa da 5 ml e attraverso un giunto a T, anche ad un manometro. Utilizzare un computer per gestire sia l&#39;elettrodo e le uscite manometro. Acquisire dati a 10 kHz, e quindi riprodurre attraverso un filtro a otto poli Bessel a 1 kHz per l&#39;analisi. </li><li> Patch differenti possono essere asportati dallo stesso ovocita ripetutamente. Questa pratica rende l&#39;esame delle attività molecolare di TRPV4 più efficiente e affidabile. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Come indicato nella Premessa, i metodi comunemente usati per studiare le funzioni TRPV4 talvolta portato a incongruenze e controversie. Le due serie di metodi qui descritti offrono alcuni vantaggi e possono integrare i metodi esistenti. Mentre si descrivono solo gli studi sulla TRPV4, i metodi possono essere estesi a studiare altri canali ionici pure. 1. Metodi di lievito luminometria Lievito in erba ha un nativo di Ca 2 +-risposta afflusso allo shock ip...

TRP (potenziali recettori transitori) comprendono sette sottofamiglie di canali di comunicazione che servono funzioni sensoriali 1,2. Nei mammiferi, TRPV, sottofamiglia vanilloid del TRP, ha sei varietà. TRPV4 (tipo 4) 3,4 risponde al calore, alcune sostanze chimiche, gonfiore osmotico, o shear stress. Il gene TRPV4 stato ripetutamente isolato mediante candidato-gene e / o espressione clonazione 5-8. Quest&#39;ultimo metodo seguito la risposta del prodotto genico di ipo-osmolarità. TRPV4 è espresso in quasi tutti gli organi e le funzioni per lo sviluppo, fisiologia, patologia o di molti tipi di cellule disparate 3,4. Striking sono le autosomiche dominanti umano mutazioni TRPV4&gt; 50, causando neuropatie periferiche e / o displasie scheletriche (anomalie nello sviluppo scheletrico) 9-11. La gamma di displasie scheletriche da lievi tipo brachyomia 3 (tipo 3 nanismo), displasia spondilometafisaria tipo Kozlowski, a Severe displasie, alcuni causando la morte neonatale o embrionale. Anche se tutte le maniere di meccanismi sembrano possibili, nessuno spiega la diversità, la complessità, la variabilità e sovrapposizioni occasionali di queste malattie 4. Come altri canali TRP 1, TRPV4 è un tetramero. Nel ratto o TRPV4 umana, ogni subunità è costituita da 871 residui. Il suo elemento centrale è il sei transmembrana una eliche (S1-S6), che sono probabilmente disposti in un modo simile a K + canali voltaggio-dipendenti. Lì, S1 a S4 formare un dominio periferico e la S5 e S6 formano il dominio permeazione poro. Tra S5 e S6 di TRPV4 è un&#39;elica poro breve seguito dal LDLFKLTIGMGDL sequenza, quattro delle quali presumibilmente convergono per formare il filtro catione. Il 470-residuo N-terminale del segmento citoplasmatico contiene 6 ripetizioni ankyrin, noti per legare le proteine ​​o piccoli ligandi. Il 152-residuo segmento citoplasmatica C-terminale include una sequenza-calmodulina legame tra gli altri possibili siti che legano oti suoi elementi 3. TRPV4 è un canale cationico che esclude essenzialmente anioni 1. Mentre la sua funzione fisiologica è per trasdurre stimoli a Ca 2 + afflusso, è anche permeabile ai cationi attraverso una sequenza permeabilità Eisenman IV, favorendo bivalente a P Ca: P Na ~ 7 12. Conduttanza monocanale rettifica a ~ 90 pS verso l&#39;esterno e verso l&#39;interno ~ 40 pS 6,13,14. Eterologamente espressa corrente (in basso) può essere attivato da ipo-osmotico gonfiore, sforzo di taglio, o di calore 15. Inoltre è stato attivato da acidi grassi polinsaturi 16,17 e l&#39;estere sintetico phorbal 4αPDD 18. Allo stato attuale, il più potente agonista è GSK1016790A 19 e antagonista è GSK2193874, efficace nel 10 -9 a 10 -8 M 20, entrambi scoperti da alta velocità, schermo piccolo-molecolare. Due settori chiave della ricerca TRPV4 rimangono confuse: (1) Anche se TRPV4 è ampiamente studiato per la sua mechanosensitivity, la sua base molecolare è controversa. Un modello descrive ipo-osmolarità qualche modo attiva la fosfolipasi A2 (PLA2) per produrre l&#39;acido grasso polinsaturo (PUFA) acido arachidonico (AA), che viene convertito in acido epoxyeicosatrienoic (TEE) da un epoxygenase, e il legame di EET attiva TRPV4 16, 17. Eppure, TRPV4 si è dimostrato di rispondere direttamente ai membrana tratto 14 (sotto), fornendo una spiegazione più semplice. (2) Le patologie mutanti TRPV4 sono sconcertanti. Alla base, si ha la necessità di sapere se le malattie sono dovute alla perdita, la riduzione o l&#39;aumento di attività di canale. Anche qui, la letteratura è tutt&#39;altro che chiara. Mentre alleli multipli scheletrico-displasia sono stati segnalati per avere attività superiori, (guadagno-di-funzione, GOF) 4,21, vari sono stati segnalati per aver ridotto le attività (perdita-di-funzione, LOF) 10,22. Uno studio sistematico di 14 alleli li ha trovati pertutte le mutazioni essere GOF (sotto) 23. L&#39;affermazione che alcuni sono LOF sembra contraddire il fenotipo di TRPV4-/ - topo knockout, che sono vitali o fertili, con solo piccoli difetti, nonostante una perdita completa della funzione TRPV4. Una parte di queste polemiche ha origine metodologica. I laboratori usano metodi diversi, o varianti di un metodo, e utilizzano diversi standard di giudizio. Più comunemente, TRPV4 viene transitoriamente espresso in cellule di mammifero in coltura (HEK, CHO, HeLa) e l&#39;ascesa di interno [Ca 2 +] sulla agonista o stimolazione ipotonico è registrato con il colorante fluorescente + sensibile Ca 2, Fura-2. L&#39;eccessivo affidamento su questo test fluorimetrico è stato criticato 1. Il livello di espressione in differenti popolazioni, la distribuzione in esso, nonché la concentrazione di colorante efficace, deve essere controllato e documentato. Più attendibile è esami elettrofisiologici diretti. Anche questo, come commonly praticato, inoltre, non è senza problemi. Poiché i livelli di espressione in cellule coltivate individuali sono difficili da controllare, correnti di cellule intere hanno grandi variazioni. Inoltre, perché le correnti sono piccole, statistiche affidabili dovranno fare affidamento su campioni di grandi dimensioni, spesso non è pratico. Raramente sono stati effettuati gli esami di patch-clamp. Alcune di queste registrazioni mostrano gruppi di scoppi di attività che rendono la valutazione statistica impegnativo 16,17. Per capire meglio il mechanosensitivity molecolare, abbiamo sviluppato due sistemi aggiuntivi per esaminare TRPV4. (1) Per isolare TRPV4 lontano dai suoi abituali partner di mammiferi, abbiamo espresso ratto TRPV4 in erba lievito 24. Espressione funzionale di TRPV4 in questo contesto evolutivamente distante ha dimostrato che potrebbe ancora rispondere alla forza osmotica senza i suoi abituali partner. Perché il lievito non rilascia acidi grassi polinsaturi come AA o EET, e il suo genoma non ha PLA2 o epoxygenase geni, questa espresSsion dimostra anche che non sono necessari per TRPV4 di percepire la forza. Avere TRPV4 in eucarioti biologicamente più suscettibili molecolari permette anche manipolazioni efficiente avanti o indietro genetici 25. (2) Per le analisi biofisiche di TRPV4 in profondità, abbiamo espresso TRPV4 in ovociti di Xenopus. A differenza delle cellule coltivate, che producono sub-nA a nA (10 -10 a 10 -9 A) correnti, un ovocita esprime correnti μA di (10 -6 a 10 -4 A). Molto più grande segnale su rumore consente una migliore quantificazione e comparazione più sicuri. TRPV4, così espresso, può anche essere esaminata come singole molecole utilizzando una patch clamp. Un singolo ovocita permette il campionamento di patch ripetuto, ancora una volta rendendo quantificazione più attendibile. Tali studi hanno dimostrato che canale TRPV4 stessa può essere attivata direttamente con la forza membrana tratto 14. Le analisi hanno inoltre dimostrato che 14 rappresentative alleli scheletrico-displasia sono tutte le mutazioni guadagno-di-funzione. Inoltre, il Degree di questa costitutiva Ca 2 + perdite parallelo alla gravità delle malattie scheletriche 23. A causa della loro novità e l&#39;utilità, le modalità dettagliate di questi due metodi sono riuniti qui per consentire repliche in futuro la ricerca sulle TRPV4 o canali simili.

<table><tbody><tr><td>Osmometro a pressione di vapore</td><td>Wescor Wescor</td><td>5500</td><td>Logan, UT, USA</td></tr><tr><td>Luminometro a tubo singolo Sirius&nbsp;</td><td>Titertek-Berhold</td><td></td><td>Sirius Huntsville, LA, USA</td></tr><tr><td>Luminometro per micropiastre</td><td>Titertek-Berthold</td><td>Mithras LB940</td><td>Huntsville, LA, USA</td></tr><tr><td>Software di luminometria</td><td>Titertek-Berthold</td><td>MikroWin2000</td><td>Huntsville, LA, USA</td></tr><tr><td>Patch clamp e software</td><td>Axon Instrument</td><td>HS2A headstage, VG-2Ax100 morsetto per vasca virtuale con messa a terra, amplificatore GeneClamp 500, digitalizzatore digidata 1440, software pClamp10</td><td>Union City, CA, USA</td></tr><tr><td>Manometro</td><td>Bio-Tec</td><td></td><td>Winooski, VT, USA</td></tr><tr><td>Estrattore di pipette</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Modello P-97</td><td>Novata, CA, USA</td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoinject II</td><td>Broomall, PA, USA</td></tr><tr><td>Luciferina celterazina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>T7 RNA polimerasi reazione</td><td>Ambion</td><td>mMessage mMachine</td><td>Austin, TX, USA</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rosso rutenio</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette&nbsp;</td><td>Pipette Drummond</td><td>da 100 microlitri</td><td>Broomall, PA, USA</td></tr><tr><td>PfuUtra polimerasi ad alta fedeltà&nbsp;</td><td>Stratagene</td><td></td><td>La Jolla, CA, Stati Uniti</td></tr></tbody></table>

lievito luminometrici e xenopus ovocita elettrofisiologiche esami del mechanosensitivity molecolare del trpv4

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potenziali, famiglia vanilloid, tipo 4) è ampiamente espressa nei tessuti vertebrati ed è attivato da diversi stimoli, tra cui da forze meccaniche. Alcune mutazioni TRPV4 causano complesso osso ereditaria o patologie neuronali umano. Wild-type o mutante TRPV4 transgeni sono comunemente espresse in cellule di mammifero in coltura ed esaminati dalla Fura-2 fluorometria e da elettrodi. In termini di meccanismo mechanosensitivity e le basi molecolari delle malattie, la letteratura attuale è confusa e controversa. Per completare metodi esistenti, si descrivono due metodi aggiuntivi per esaminare le proprietà molecolari di TRPV4. (1) Rat TRPV4 e un transgene aequorina si trasformano in lievito in erba. Uno shock ipo-osmtic della popolazione trasformante produce un segnale luminometrici causa della combinazione di equorina con Ca 2 +, rilasciato attraverso il canale TRPV4. Qui TRPV4 è isolato dai suoi abituali partner di proteine ​​di mammiferie rivela la propria mechanosensitivity. (2) cRNA di TRPV4 viene iniettato in oociti di Xenopus. Dopo un adeguato periodo di incubazione, la corrente TRPV4 macroscopico viene esaminato con un morsetto di tensione a due elettrodi. L&#39;attuale aumento dopo la rimozione di osmoticum inerti dal bagno ovocita è indicativo di mechanosensitivity. I microampere (10 -6 a 10 -4 A) correnti da ovociti sono molto più grandi rispetto alle subnano-to nA (10 -10 a 10 -9 A) correnti da cellule in coltura, producendo quantificazioni più chiare e valutazioni più sicuri. Correnti microscopiche che riflettono le attività delle proteine ​​dei singoli canali possono anche essere direttamente registrati sotto una patch clamp, in on-cella o in modalità asportato. Lo stesso ovocita fornisce più campioni di patch, consentendo la replica dei dati migliori. Aspirazioni applicate le patch possono attivare TRPV4 per valutare direttamente mechanosensitivity. Tali metodi dovrebbero anche essere utile nello studio di altri tipi di canali TRP.

In un tipico esperimento luminometria, una serie di 400-1,200 mOsm shock ipotonici non si raggiunge con l&#39;aggiunta di 200 ml di soluzione d&#39;urto di diversa bassa osmolarità a 20 ml di cultura a 1.400 mOsm. L&#39;attività TRPV4 è evidente quando il RLU della disposizione sperimentale è confrontata con quella di due controlli negativi: cellule di lievito trasformate con il plasmide p416GPDV4 vuoto o uno che contiene il gene TRPV4 con una mutazione nel filtro di ioni (Figura 1) 24.</s...

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca 2 + luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

Lievito luminometrici e Xenopus ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare la sensibilità meccanica del canale ionico V quattro. Ciò può essere ottenuto trasformando le cellule di lievito con il gene del trip V four ed esaminando l'ingresso di calcio ipoteticamente indotto attraverso un estraneo transgenico utilizzando un luminometro. Questo può essere esaminato anche con l'approccio elettrofisiologico.Il Trip V four CRNA viene prima generato e iniettato nei citi di xenopus dopo l'incubazione. I citi vengono esaminati da due elettrodi voltage clamp dopo la sfida ipotonica. Per esaminare la sensibilità meccanica a livello di singolo canale, viene applicata l'aspirazione ai cerotti di membrana asportati dai citi.Sono il professor Jin Kung. In precedenza, le attività dei quattro canali ionici TRIP B sono state ampiamente dimostrate da URA per il mito della fluorescenza sviluppato qui, fornendo alternative potenti e quantitative per esaminare la sensibilità meccanica del trip B quattro. Il primo metodo che abbiamo adottato per l'uso del lum lum è attraverso l'acqua transgenica per esaminare la sensibilità meccanica del Trip V four nel lievito in gemmazione.Nel secondo metodo con approccio elettrofisiologico, vengono esaminate le proprietà di Trip V four e l'espressione appropriata del tributo V four CRNA in XUS Cytes. Il metodo di base dell'elettrofisiologia dei citi, come la rimozione della membrana vilin e la formazione di sigilli propri sono già stati dimostrati in un lavoro di Brown e collaboratori in questa stessa rivista nel 2008 qui mostreranno ulteriori passaggi necessari per studiare la sensibilità meccanica di Triv quattro. Questo è il mio collega, il dottor Jin Fcon.Dimostrerà l'uso della geometria T lum e la fabbricazione delle pipette di iniezione, il riempimento delle pipette con la soluzione di CRNA e l'iniezione della soluzione nei vecchi siti. Inoltre, dimostrerà la registrazione delle vongole patch in cella e in modalità asportata al rovescio verso l'esterno. Mostrerà anche l'attivazione del canale meccanosensibile nativo della membrana del sito O, così come i risultati dell'attivazione di eterologhi.Lay espresso TV quattro Iniziare questa procedura coltivando due millilitri di cellule di lievito durante la notte per post-fase logaritmica in DCD Lu Yura dropout medium, integrato con un molare di sorbitolo in un agitatore a 30 gradi Celsius. Il giorno successivo inoculare 200 microlitri di coltura in 1.800 microlitri di terreno fresco, integrato con due micromolari Lucifer. Le Risine crescono quindi al buio a temperatura ambiente per altre 24 ore senza agitare subito prima della diluizione.Misurare l'osmolarità della coltura arricchita con sorbitolo di un molare e del cloruro di sodio utilizzando un OSM ter a pressione di vapore. Successivamente, aliquotare 20 microlitri di coltura fresca in un tubo luminometrico da 12 millimetri per un luminometro a tubo singolo. Per lo shock ipotonico, aggiungere 200 microlitri di soluzione contenente 25 millimolari di sodio EGTA a pH 7,2 o di sodio MES a pH 7,2 e da 500 a 100 millimolari di cloruro di sodio a 20 microlitri di coltura a 1.400 Milli Osmo, monitorare continuamente la luminescenza prima, durante e almeno 120 secondi dopo lo shock osmotico verso il basso interrotto solo dalla breve operazione di diluizione, registrare l'uscita del luminometro sul computer come unità di luminescenza relativa.In questa procedura, estrarre una micropipetta con un estrattore per pipette. La micropipetta deve avere un gambo lungo al microscopio da dissezione. Pizzicare con cautela il gambo della micropipetta estratta nel punto appropriato per creare un'apertura.L'apertura della micropipetta deve avere un diametro di circa 30 micrometri per facilitare il riempimento e l'espulsione della soluzione di CRNA. Ecco il micro iniettore e il porta pipetta. Questo è il controllo con le funzioni di assorbimento ed espulsione chiaramente contrassegnate.Dopo aver riempito nuovamente la pipetta con olio minerale montato sul supporto, abbassarla in una goccia di soluzione di CRNA. Successivamente riempire automaticamente la pipetta con il microiniettore al microscopio da dissezione, selezionare un ovocita. Quindi abbassare la micropipetta riempita per penetrare nell'ovocita.Dopo aver inserito la micropipetta, iniziare l'iniezione di CRNA. Dopo che sono stati iniettati circa 30 citi, trasferirli nel terreno ND 96 contenente rosso rutenio e gentamicina. Quindi, trasferirli singolarmente in una piastra a 96 pozzetti contenente il terreno ND 96 alla fine.Metterli nell'incubatrice per diversi giorni per consentire l'espressione del trip V a quattro canali. Due metodi elettrofisiologici vengono utilizzati per esaminare la sensibilità del meccanismo del trip V quattro. Il primo metodo è il morsetto di tensione a due elettrodi, e questa è la configurazione in questo passaggio.Estrarre le pipette di registrazione per la misurazione della tensione e l'iniezione di corrente dai bicchieri bolici da 100 microlitri con un tiro per pipette. Gli elettrodi della pipetta devono avere un'apertura della punta di circa un micron di diametro. Quindi, riempire gli elettrodi con due molari di cloruro di potassio, che si tradurrà in una resistenza da 0,1 a 0,2 mega.Montatele sull'HS a due stadi di testa. Questi due sono i micro manipolatori che trattengono l'elettrodo di controllo della tensione e l'elettrodo di iniezione di corrente, che insieme a un morsetto da bagno virtuale VG due x 100 sono collegati a un'interfaccia amplificatore gene clamp 500 tramite un digitalizzatore a cifre 1440. E i dati vengono acquisiti utilizzando il software P clamp 10.Seduto sul tavolino del microscopio invertito c'è la camera di registrazione per eseguire una registrazione, un cito xenopus viene posizionato nella camera e i due elettrodi vengono inseriti in essa attraverso una micro manipolazione. La soluzione che bagna il cito nella camera di registrazione avviene in un flusso continuo attraverso la gravità. L'alimentazione dell'ingresso nella camera è collegata attraverso un tubo in un collettore fabbricato con una serie di gusci di siringhe.Ogni guscio è riempito con una soluzione diversa. Il contenuto del bagno viene modificato mediante la chiusura o l'apertura di diversi morsetti sul tubo. Cambiare il bagno da un'osmolarità alta a una bassa offre una forma di stimolazione meccanica.Ora, riempi le pipette di vetro estratte con la soluzione interna. La configurazione per il patch clamp è simile a quella per il voltage clamp con l'elettrodo montato sullo stadio di testa e poi fissato sul micromanipolatore. Collegare la pipetta patch clamp a una siringa da cinque millilitri e a un manometro.L'elettrodo patch clamp viene manipolato sulla superficie dell'ovocita. Dopo la rimozione della membrana Vitale, applicare un'aspirazione continua per far aderire il cerotto alla punta della pipetta, aumentando così la resistenza elettrica all'impulso della corrente di prova. Quando la resistenza è sufficientemente grande da indicare la corretta formazione di un giga seal, l'elettrodo con il cerotto viene quindi estratto dall'ovocita per stabilire la modalità di registrazione dall'interno verso l'esterno asportato.Quindi applicare impulsi di aspirazione nel cerotto asportato. C'è un canale meccanosensibile Siemens a 40 pico nativo dell'ovocita xenopus. Questa figura mostra l'attivazione di questi canali quando viene applicato un impulso di aspirazione nella membrana, patch asportate da ovociti che esprimono con successo il trip V quattro.L'attivazione della conduttanza unitaria Siemens di 90 pico dello sgancio V quattro può essere osservata in modo simile. Qui è mostrato il trip V 4 del ratto espresso in lievito che risponde allo shock ipotonico. Uno shock ipotonico di 750 milliosmoli innesca un grande aumento della luminescenza nelle prestazioni del trip V quattro T, ma non nelle prestazioni T di un plasmide vuoto o di un plasmide portante un trip V quattro con una mutazione nel suo filtro ionico.Ed ecco la relazione dose-risposta tra lo shock ipotonico e la risposta di picco. Le risposte macroscopiche della corrente dell'intero ovocita agli stimoli ipotonici sono state esaminate con un voltage clamp a due elettrodi. Le correnti di picco di un ovocita che esprime livelli molto elevati di wild type fanno scattare V quattro o 100 millisecondi di tensione in risposta alla rimozione di 100 millimolari di sorbitolo dalla soluzione del bagno Osmo da 250 milligrammi e all'aggiunta di tre micromolari di rutenio rosso.La corrente di picco ripetuta aumenta in caso di stimoli ipotonici e diminuisce al ritorno alla soluzione isotonica o all'aggiunta del bloccante del canale. Questa figura mostra l'attivazione diretta del trip wild type V four mediante l'allungamento della membrana visto sotto il patch clamp, un campione di tracce grezze di qualità media da un patch asportato da un ovocita che esprime il trip V four che mostra l'attivazione da 60 millimetri di aspirazione di mercurio applicata a un patch esportato dall'interno verso l'esterno mantenuto a 50 volt positivi. La traccia più in alto viene visualizzata in una base temporale più veloce per mostrare la transizione di corrente unitaria tra un livello chiuso e uno aperto.Questa videocassetta dovrebbe darvi una comprensione più concreta su come la luminanza del lievito, la geometria e i metodi elettrofisiologici del sito O possono essere applicati allo studio della sensibilità meccanica dei quattro canali.

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