Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare singoli eventi mitocondriali come i flash di superossido e le fluttuazioni del potenziale di membrana in situ o in vivo per ottenere una valutazione in tempo reale della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevante. Ciò si ottiene esponendo prima il muscolo scheletrico nell'arto posteriore del topo. Successivamente, si ottengono immagini confocali in time-lapse dei muscoli scheletrici in vivo.

Quindi il cuore del topo viene perfuso e ripreso mediante microscopia confocale. Infine, le immagini vengono elaborate e i dati analizzati. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano singoli lampi di superossido mitocondriale e fluttuazioni del potenziale di membrana nei muscoli scheletrici, in vivo o nel cuore perfuso attraverso immagini confocali time-lapse e bidimensionali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai muscoli esistenti, come la valutazione della funzione mitocondriale nell'isolamento dei mitocondri, è che questa tecnica consente la valutazione in tempo reale della singola funzione mitocondriale in una condizione fisiologicamente rilevante. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto l'imaging confocale con coltello, animale o coltello è difficile da imparare perché è una procedura più ripida e complicata. Dopo aver preparato la soluzione salina isotonica bilanciata o IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer, o KHB e gli strumenti chirurgici secondo il protocollo di testo, anestetizzare un topo con un'iniezione intraperitoneale di Pentobarbital ed eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per confermare che l'animale è sedato.

Usando un rasoio, rimuovere i peli su uno degli arti posteriori prima di disinfettare il sito con etanolo al 70%. Successivamente, praticare un'incisione sulla pelle lungo il lato esterno dell'arto per esporre i muscoli dell'anemia gastrica. Quindi, usando una pinza affilata, raccogli delicatamente l'epimisio e usa le forbici per praticare un'incisione attraverso di esso.

Dissezionare ulteriormente per rimuovere l'epimisio ed esporre le fibre muscolari sottostanti. Aggiungere 500 nanomolari tetraetile, estere metilico di rod domine o TMRM all'IBSS e immergere il muscolo nella soluzione per 30 minuti. Dopo aver caricato il TMRM nel muscolo, lavare il muscolo con IBSS senza TMRM utilizzando un obiettivo a olio 40x.

Posizionare il mouse su un lato sul tavolino del microscopio confocale e trattenere l'arto posteriore in modo che il muscolo scheletrico esposto si trovi in una camera realizzata su misura contro il vetrino coprioggetti. Quindi premere delicatamente sulla gamba per stabilire un contatto stretto tra il tessuto e il vetrino coprioggetti e immergere i muscoli esposti in IBSS utilizzando una profondità di pixel di otto bit e una frequenza di campionamento di un secondo per fotogramma per registrare una scansione seriale bidimensionale del muscolo. Raccogli immagini sequenziali prima emozionando a 405 nanometri e raccogliendo a più di 505 nanometri.

Quindi eccitante a 488 nanometri mentre si raccoglie a più di 505 nanometri. Per l'eccitazione a doppia lunghezza d'onda di MT. CCP YFP, utilizza l'eccitazione sequenziale a 405, 488 e 543 nanometri e raccoglie l'emissione rispettivamente da 505 a 5, da 45,505 a 5, 45 e maggiore di 560 nanometri. Per l'imaging di eccitazione a tripla lunghezza d'onda di M-T-C-P-Y-F-P e TMRM per l'imaging del cuore del topo, iniettare nell'animale 200 unità di eparina.

Dopo aver atteso 10 minuti e aver soppresso il topo mediante toracotomia, rimuovere rapidamente il cuore, i polmoni e il timo ad esso attaccati. Trasferire rapidamente il tessuto impiantato in IBSS ghiacciato. Quindi identifica i lobi del timo e staccali delicatamente.

Per esporre l'aorta ascendente, rimuovere il polmone e il timo e isolare l'aorta rimuovendo con cura il tessuto circostante. Quindi, praticare un taglio all'estremità superiore dell'aorta ascendente prima del primo ramo dell'arco aortico. Quindi, con due pinze per micro sutura, afferrare delicatamente la parete dell'aorta per esporre il lume e posizionarlo con cura su una cannula.

Utilizzare un morsetto per microvasi per tenere l'aorta in posizione e legare rapidamente i punti di sutura attorno ad essa. Rimuovere il morsetto e utilizzare una pinza per controllare attentamente che la punta della cannula si trovi sopra la radice aortica. Fissare ulteriori lacci se necessario per tenere il cuore in posizione.

Accendere la pompa peristaltica e perfondere il cuore. A un millilitro al minuto, il cuore riprenderà a battere dopo la perfusione. Dopo 10 minuti di stabilizzazione, perfondere il cuore con 10 statine BLE micromolari e TMRM da 100 a 500 nanomolari.

Il battito cardiaco rallenterà dopo 10 minuti. Successivamente, regolare la posizione del sistema di perfusione e posizionare il cuore sul tavolino del microscopio dotato di un adattatore per riscaldare la camera a 37 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di soluzione di perfusione KHB nella camera per immergere parzialmente il cuore.

Utilizzare una pompa peristaltica per rimuovere l'effluente dalla camera. Aumentando gradualmente la velocità della pompa per fornire un flusso sufficiente al cuore per garantire uno stretto contatto del cuore con il vetrino coprioggetto e per sopprimere ulteriormente il battito cardiaco, applicare una leggera pressione sul cuore. Immagina l'organo come descritto per il muscolo in precedenza in questo video, regolando il piano focale per rivelare l'immagine più chiara possibile.

Utilizzando il modulo di analisi fisiologica del software per microscopio confocale. Inizia aprendo il database generato automaticamente e poi il file immagine 2D da analizzare. Fai clic sulla regione di interesse o sulla media del ROI.

Per passare alla modalità media del ROI. Disattivare la visualizzazione dei canali ad eccezione di CP YFP a 488 nanometri per la selezione dei flash. Ingrandisci l'immagine e sposta manualmente la barra di scorrimento per riprodurre le immagini 2D seriali.

Successivamente, identificare i singoli lampi di superossido mitocondriale individuando il sito in cui il segnale fluorescente aumenta transitoriamente. Utilizzare lo strumento ROI appropriato per contrassegnare i lampi che la traccia che mostra la variazione di fluorescenza dipendente dal tempo di ciascuna ROI apparirà accanto all'immagine. Dopo aver selezionato tutti i flash, accendere il display degli altri canali.

Selezionare una ROI sull'immagine al di fuori della cella per la sottrazione del segnale di sfondo. Quindi emetti la fluorescenza media di ciascun ROI insieme alle etichette temporali. Registrare il numero di flash in ciascuno dei file di immagine di scansione seriale insieme al tempo di scansione e all'area della cella.

Usa Excel per calcolare la frequenza dei flash come numero di flash per 100 secondi e per area di cella di 1000 micron quadrati. Per calcolare il tempo di ampiezza per il picco e il tempo di decadimento per ogni flash. Utilizza un programma sviluppato su misura per l'analisi dei parametri flash che fa parte di un programma sviluppato su misura scritto in linguaggio di dati interattivo.

Utilizzando questo protocollo, l'imaging in vivo di singoli eventi mitocondriali può essere eseguito nei muscoli scheletrici di topi anestetizzati, seguito dall'imaging insi nel cuore perfuso. Come illustrato di seguito. Il TMRM, che è un indicatore di potenziale di membrana mitocondriale, viene spesso utilizzato per verificare la posizione di M-T-C-P-Y-F-P e dovrebbe mostrare un modello di sovrapposizione completo con il segnale M-T-C-P-Y-F-P.

I suoi spettri sono distinguibili da quelli di CP YFP e, utilizzando il metodo di eccitazione sequenziale, i segnali di emissione di TMRM e M-T-C-P-Y-F-P non interferiranno tra loro. Queste immagini dimostrano che il singolo flash di superossido mitocondriale accompagnato da depolarizzazione della membrana può essere identificato nelle immagini di scansione 2D seriali, che hanno mostrato un aumento transitorio della fluorescenza rispetto ai segnali di fondo sia nei tessuti muscolari scheletrici che nel miocardio. Oltre all'alta risoluzione, è richiesta anche un'adeguata intensità di fluorescenza.

Ciò può essere ottenuto modulando l'intensità del laser e il guadagno nei canali di raccolta. In generale, il segnale di fluorescenza basale dalla cellula è impostato da un terzo a un quarto dell'intensità massima del canale. Poiché il livello di espressione di M-T-C-P-Y-F-P e il carico di TMRM possono variare tra gli animali, è necessario effettuare una messa a punto delle condizioni di imaging per ogni esperimento, sia delle perturbazioni fisiologiche che patologiche, come i substrati metabolici.

La stimolazione elettrica, come indicato qui, e la riperfusione ischemica sono state utilizzate per dimostrare che l'attività flash del superossido risponde ai cambiamenti nello stato metabolico cellulare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere un'adeguata anestesia della bocca e la corretta condizione del cuore perfuso. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ischemia e la fusione per rispondere a ulteriori domande come la disfunzione mitocondriale durante la leucemia miocardica e il danno da riperfusione.