Name: Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Scopri come monitorare eventi mitocondriali singoli come flash di superossido e fluttuazioni del potenziale di membrana in muscoli scheletrici e cuore perfuso di topo in vivo mediante microscopia confocale.

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Gli autori desiderano ringraziare Drs. Heping Cheng, Huiliang Zhang e Stephen Kolwicz per i loro utili commenti e supporto tecnico nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH e la Scientist Development Grant dalla American Heart Association a WW.

1. Esperimento Preparazione <ol><li> Preparare la soluzione isotonica salina bilanciata (50 ml) contenente: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e HEPES 10 mM (pH 7,2) per imaging in vivo muscolo scheletrico. </li><li> Preparare 1 L di tampone Krebs-Henseleit (KHB) contenente: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 MgSO mm 4, EDTA 0,5 mm e 25 NaHCO mm 3. </li><li> Bubble il KHB con gas contenente 95% O 2/5% di CO 2 per 10-15 minuti prima dell&#39;aggiunta di 2 mM CaCl 2. Aggiungi substrati metabolici (glucosio ad esempio 10 mm e piruvato 0,5 mm). </li><li> Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzando la pinza, forbici e pinze in etanolo al 70% e poi risciacquo in sterilizzata DDH 2 O. </li><li> Accendere il sistema di perfusione cardiaca, regolare la temperatura su bagnomaria e circolatore, impostare la velocità della pompa peristaltica di 6 ml / min. </li><li> Bubble il KHB con il 95% O 2/ 5% CO 2 gas, e il controllo della portata e della temperatura (37 ° C, da una sonda di temperatura a fibre ottiche) dell&#39;acqua residua. Il sistema necessita di circa 20 minuti per il gas e temperatura di equilibrazione. </li></ol> 2. Imaging confocale dei muscoli scheletrici In Vivo <ol><li> Anestetizzare mouse con pentobarbital (80 mg / kg, ip). L&#39;animale raggiungerà anestesia chirurgica (nessuna risposta al pinch tep) entro 10-15 minuti e rimane in questo stato per 1-1,5 ore, sufficiente per l&#39;imaging in vivo dei muscoli scheletrici. </li><li> Rimuovere peli su una delle zampe posteriori e sterilizzare la pelle con etanolo al 70%. </li><li> Fare un&#39;incisione sulla pelle lungo il lato esterno dell&#39;arto per esporre i muscoli gastrocnemio. </li><li> Sollevare il epimisio delicatamente con una pinza taglienti e fare un&#39;incisione attraverso di essa con le forbici. Ulteriore sezionare per rimuovere il epimisio ed esporre le fibre muscolari sotto di esso. </li><li> Per il carico in vivo di TMRM nel scheletricomuscolare, includono TMRM (500 nM) in soluzione isotonica salina bilanciata di immergere muscolare per 30 minuti e poi lavare con una soluzione priva di indicatore. </li><li> Posizionare il mouse su un lato con il microscopio confocale (Zeiss LSM 510) stadio e trattenere l&#39;arto posteriore in una posizione che il muscolo scheletrico esposta sia rivolta contro il coprioggetto che forma il fondo della camera. Il vetrino è tra il tessuto muscolare e l&#39;obiettivo invertita (olio 40X). </li><li> Premere la gamba delicatamente verso il basso per rendere stretto contatto tra il tessuto e il vetrino. Immergere i muscoli esposti in soluzione isotonica salina bilanciata. </li><li> Record bidimensionali (2D, xy) le immagini confocale ad una frequenza di campionamento di un secondo per fotogramma. L&#39;intensità di ciascun pixel viene digitalizzato in profondità di 8-bit. Di solito, una scansione seriale contiene 100 fotogrammi. </li><li> Raccogliere immagini sequenziali di primo emozionante a 405 nm e la raccolta a&gt; 505 nm poi a 488 nm, mentre la raccolta a&gt; 505 nm per doppia lunghezza d&#39;onda excitation imaging mt-cpYFP. Utilizzare eccitazione sequenziale a 405, 488 e 543 nm, e raccogliere emissione a 505-545, 505-545 e&gt; 560 nm, rispettivamente, per tre lunghezze d&#39;onda di eccitazione imaging mt-cpYFP e TMRM. </li></ol> 3. Imaging confocale di cuore perfuso mouse <ol><li> Subito dopo imaging in vivo dei muscoli scheletrici, iniettare il mouse con 200 unità di eparina (ip). Dieci minuti dopo, eutanasia il mouse toracotomia e rapidamente rimuovere il cuore con i polmoni e timo collegato ad esso. </li><li> Rimuovere rapidamente il polmone in tampone ghiacciato. Identificare i lobi del timo e la buccia delicatamente per esporre l&#39;aorta ascendente. </li><li> Rimuovere il timo e isolare l&#39;aorta rimuovendo accuratamente qualsiasi tessuto circostante. </li><li> Effettuare un taglio all&#39;estremità superiore della aorta ascendente prima del primo ramo della dell&#39;arco aortico. </li><li> Tenere la parete dell&#39;aorta delicatamente con due pinze sutura micro per esporre il lume e posizionare accuratamente l&#39;aorta sulla cannula (PE50 tubo). L&#39;aorta è tenuto in posizione con un morsetto nave micro mentre suture vengono rapidamente legato intorno all&#39;aorta. </li><li> Rimuovere la fascetta, controllare attentamente la cannula con una pinza per assicurarsi che la punta della cannula è al di sopra della radice aortica. Legami vengono aggiunti se necessario per tenere il cuore a posto. </li><li> Accendere la pompa peristaltica e profumato cuore a 1 ml / min. Il cuore riprende a battere su di perfusione. </li><li> Regolare la posizione del sistema di perfusione e mettere il cuore sul palco microscopio. Lo stadio ha un adattatore che permette il riscaldamento della camera che contiene il cuore. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di perfusione KHB nella camera di immergere parzialmente cuore. Controllo della temperatura della camera a 37 ° C. Rimuovere effluenti dalla camera utilizzando una pompa peristaltica. </li><li> Aumentare la velocità della pompa peristaltica gradualmente per fornire un flusso sufficiente (circa 2 ml / min) al cuore. </li><li> Dopo 10 min di stabilizzazione, profumato il heart con 10 micron blebbistatin e 100-500 nM TMRM. Battito cardiaco rallenta dopo 10 min. </li><li> Applicare una leggera pressione sul cuore per assicurare stretto contatto del cuore con il coprioggetto sul fondo della camera e per sopprimere ulteriormente battito cardiaco. </li><li> Seguire la stessa procedura per l&#39;imaging confocale di miocardio intatto come descritto nel precedente punto 2.8. Regolare accuratamente il piano focale per rivelare l&#39;immagine più chiara possibile. </li></ol> 4. Image Processing e Analisi dei Dati <ol><li> Utilizzare gli strumenti forniti dal modulo &quot;Analisi fisiologica&quot; del software confocale per analizzare singoli mitocondriali lampeggia e membrana potenziali cambiamenti. Questo modulo è spesso incluso nel software di acquisizione di immagini del sistema confocale e permette la determinazione di certe aree dell&#39;immagine così come uscita di intensità di fluorescenza con etichette temporali. </li><li> Aprire il database e quindi il file immagine 2D di serie da analizzare. </li><li> Fare clic su &quot;Regioned&#39;interesse (ROI) significa &quot;per passare al&quot; media di ROI &quot;mode. Clicca sul&quot; regione di interesse (ROI) significare &quot;per passare alla modalità&quot; media del ROI &quot;. </li><li> Disattivare la visualizzazione di altri canali, tranne il canale di cpYFP 488 nm per la selezione dei lampi. </li><li> Zoom a immagine e spostare manualmente barra di scorrimento per riprodurre le immagini 2D seriali. </li><li> Identificare i singoli mitocondriali superossido lampeggia individuando il luogo in cui gli aumenti segnale fluorescente transitoriamente. Utilizzare lo strumento ROI adeguato per contrassegnare i flash. La traccia mostrando tempo-dipendente variazione di fluorescenza di ogni ROI apparirà accanto all&#39;immagine. </li><li> Dopo aver selezionato tutti i flash, attivare la visualizzazione di altri canali. Selezionare un ROI sull&#39;immagine all&#39;esterno della cellula per segnale sottrazione del fondo. Uscita la fluorescenza media di ogni ROI insieme alle etichette temporali. </li><li> Registrare il numero di lampeggi in ciascuno dei file immagine di scansione seriale con il tempo di scansione e l&#39;area dila cella. Utilizzare Excel per calcolare la frequenza flash come numero di lampi per 100 sec / 1,000 micron 2 superficie cellulare. </li><li> Utilizzare un programma personalizzato sviluppato scritto in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) per calcolare i parametri di ogni flash (ampiezza, tempo al picco e tempo di decadimento). Software IDL è disponibile in commercio e il programma personalizzato sviluppato per analisi parametro flash può essere ottenuta dall&#39;autore su richiesta. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Imaging eventi mitocondriali singoli organi irrorati di animali vivi o ha un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali di valutazione della funzione mitocondriale 17,19,21,22,24,25. La tecnica qui descritta può realizzare in tempo reale in situ determinazione della funzionalità mitocondriale in una condizione fisiologica reale alla risoluzione subcellulare. Ciò è particolarmente utile, quando combinato con altre misurazioni, per studiare sistematicamente il ruolo dei mitocondri nel norm...

I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella bioenergetica di cellule, di segnalazione dei radicali liberi, redox omeostasi, regolazione ione, e il destino delle cellule determinazione 1,2. La disfunzione dei mitocondri spesso accompagna e sottende la patogenesi delle malattie 3-6. Soprattutto nei sistemi muscolari come il cuore e nei muscoli scheletrici, respirazione mitocondriale fornisce la maggior parte di ATP per sostenere regolamentazione tempestiva di calcio intracellulare e robusto 7,8 sviluppo della forza. Questi muscoli in possesso di un gran numero di mitocondri, che spesso occupano fino al 20-40% del volume cellulare totale e sono &quot;corretti&quot; tra miofilamenti 2. Nonostante i numerosi studi, la nostra comprensione della regolazione della funzione mitocondriale, in particolare in vivo e in condizioni fisiologicamente rilevanti, è limitata. Uno dei motivi è che la maggior parte dei metodi sviluppati per valutare la funzione mitocondriale contare su di Vitroo approcci ex vivo, quali il monitoraggio del consumo di ossigeno di mitocondri isolati, completata con substrati artificiali, e la determinazione indiretta della funzionalità mitocondriale mediante la morfologia (ad esempio microscopia elettronica), l&#39;attività enzimatica (ad esempio attività aconitasi), o livelli di ATP intracellulari 9-11 . Recentemente, piccoli indicatori fluorescenti molecola con relativa arricchimento mitocondriale sono stati applicati per fornire un assaggio dei segnali mitocondriali, tra cui il potenziale di membrana, di calcio e di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), in cellule intatte 11-13. Inoltre, vari proteina fluorescente verde (GFP) basato redox e ROS indicatori sono stati sviluppati per ottenere una valutazione più specifica del redox intracellulare compartimenti o segnali ROS 14-16. Tra questo, abbiamo sviluppato un indicatore geneticamente codificato superossido, la proteina fluorescente gialla permutato circolare, e targeted in mitocondri (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP può essere eccitato a 405 o 488 nm con entrambi i picchi di emissione a 515 nm. L&#39;emissione a 488 nm di eccitazione è specificamente rispondenti a superossido come mostrato dalla precedente in vitro e in vivo calibrazioni 17,18. L&#39;emissione a 405 nm di eccitazione viene utilizzato come controllo interno (si veda la Figura 1 di Ref 17 per informazioni dettagliate sulle emissioni di eccitazione e spettri di mt-cpYFP in varie condizioni). Con il time-lapse imaging confocale, questo indicatore rileva scoppio eventi di produzione di superossido, chiamato superossido lampi, in singoli mitocondri delle cellule intatte. Superossido in flash serve come una funzione composta di respirazione mitocondriale, accompagnamento transitoria depolarizzazione della membrana mitocondriale e la produzione di ROS 17-20. Recentemente, abbiamo generato i pan-tessuto mt-cpYFP topi transgenici con il vettore pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 su C57/BL6 sfondo e verificato le forti espressionisione di questo indicatore nel cuore, muscoli scheletrici e altri tessuti (Figura 2). I topi transgenici sarà disponibile per ricercatori accademici interessati su richiesta e approvazione MTA dall&#39;Università di Washington. In questo studio, descriviamo in situ imaging lampeggia superossido in Langendorff cuore perfuso e immagini in vivo di eventi flash nella muscoli scheletrici di anestetizzati mt-cpYFP topi transgenici 17,19. Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale dei singoli eventi mitocondriali di produzione di ROS in una condizione fisiologicamente rilevanti o in vivo 21,22. È anche possibile utilizzare il sistema per monitorare altri parametri singoli mitocondriali come potenziale di membrana e calcio con indicatori fluorescenti appropriati. Valutazione ulteriore, simultanea o parallela della funzione mitocondriale con eventi intracellulari (ad esempio transienti di calcio) o funzione cardiaca (ad esempio. Frazione di eiezione) può essere raggiunto. Perturbazioni patologiche, quali ischemia e riperfusione, possono essere applicati al cuore perfuso per valutare l&#39;impatto dello stress sulla singola funzione mitocondriale nel miocardio intatta.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros Organics</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td colspan="4">Microscopio a scansione a linea confocale (LSM 510 Meta, Zeiss), versione software 4.2 SP1 incluso il modulo "Analisi fisiologica".</td></tr></tbody></table>

imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o in vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitocondrio è un organello intracellulare critico responsabile per la produzione di energia e di segnalazione intracellulare nei sistemi eucarioti. Disfunzione mitocondriale spesso accompagna e contribuisce alla malattia umana. La maggior parte dei metodi che sono stati sviluppati per valutare la funzione mitocondriale e la disfunzione si basano su in vitro o ex vivo misurazioni. I risultati di questi esperimenti hanno limitato la capacità di determinare la funzione mitocondriale in vivo. Qui, descriviamo un nuovo approccio che utilizza la microscopia confocale a scansione per l&#39;imaging di tessuti intatti in aminals vivi, che permette di valutare singola funzione mitocondriale in maniera tempo reale in vivo. In primo luogo, generiamo topi transgenici che esprimono la mitocondriale mirato indicatore superossido, proteina fluorescente giallo circolarmente permutato (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestetizzato mouse è fissato su una scheda palcoscenico su misura e time-lapse immagini sono prese fRom muscoli scheletrici esposte del arti posteriori. Il mouse viene successivamente sacrificato e il cuore è impostato per Langendorff perfusione con soluzione fisiologica a 37 ° C. Il cuore perfuso è posizionato in una camera speciale sul palco microscopio confocale e leggera pressione viene applicata per immobilizzare il cuore e sopprimere battito cardiaco indotto artefatti da movimento. Superossido lampi vengono rilevati mediante real-time confocale 2D immagini ad una frequenza di un fotogramma al secondo. La soluzione di perfusione può essere modificata per contenere diversi substrati respiratori o altri indicatori fluorescenti. La perfusione può anche essere regolata per produrre modelli di malattie come l&#39;ischemia e riperfusione. Questa tecnica è un approccio unico per la determinazione della funzione di singolo mitocondrio in tessuti normali e in vivo.

Secondo questo protocollo, imaging in vivo di eventi mitocondriali singoli può essere realizzata in muscoli scheletrici di topi anestetizzati, seguita da in situ imaging cuore perfuso (Figura 1). La regolazione ottimale delle condizioni di imaging garantisce immagini chiare dei tessuti muscolari intatte e con una risoluzione singolo mitocondrio (Figura 2). TMRM viene spesso utilizzato per verificare la posizione del mt-cpYFP e dovrebbe mostrare un pattern completa sovr...

La microscopia confocale a scansione viene applicato per l&#39;imaging eventi mitocondriali singoli in cuore perfuso o muscoli scheletrici in animale vivo. Monitoraggio in tempo reale dei processi mitocondriali singoli, come vampate di superossido e di membrana potenziali fluttuazioni consente la valutazione della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevanti e durante le perturbazioni patologiche.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare singoli eventi mitocondriali come i flash di superossido e le fluttuazioni del potenziale di membrana in situ o in vivo per ottenere una valutazione in tempo reale della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevante. Ciò si ottiene esponendo prima il muscolo scheletrico nell'arto posteriore del topo. Successivamente, si ottengono immagini confocali in time-lapse dei muscoli scheletrici in vivo.Quindi il cuore del topo viene perfuso e ripreso mediante microscopia confocale. Infine, le immagini vengono elaborate e i dati analizzati. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano singoli lampi di superossido mitocondriale e fluttuazioni del potenziale di membrana nei muscoli scheletrici, in vivo o nel cuore perfuso attraverso immagini confocali time-lapse e bidimensionali.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai muscoli esistenti, come la valutazione della funzione mitocondriale nell'isolamento dei mitocondri, è che questa tecnica consente la valutazione in tempo reale della singola funzione mitocondriale in una condizione fisiologicamente rilevante. La dimostrazione di questo me

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Biologia

Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ​​ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

Fusione mitocondriale è stato misurato mediante il monitoraggio di equilibrare le photoconverted matrice mirata GFP attraverso la rete mitocondriale nel corso del tempo. Finora, una sola cella può essere sottoposto ad un'ora lunga analisi cinetica alla volta. Vi presentiamo un metodo che misura contemporaneamente più celle, in modo da accelerare il processo di raccolta dati.

Una più veloce, ad alta risoluzione, MTPA-GFP-based test Fusion mitocondriale Acquisizione dati cinetici di più celle in parallelo con microscopia confocale

L'obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

Fonte: Kennedy, L. H., et. al. Visualizzazione e imaging dal vivo di organelli di oligodendrociti in fette di cervello organotipiche utilizzando virus adeno-associati e microscopia confocale. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'imaging dei mitocondri degli oligodendrociti in fette di cervello di topo organotipiche. La fetta viene posta all'interno di una camera a bagno con circolazione continua del fluido e temperatura controllata. Dopo aver impostato vari parametri del microscopio...

Imaging confocale del movimento mitocondriale all'interno di oligodendrociti in colture organotipiche di fette cerebrali

L'analisi della relazione struttura-funzione mitocondriale è necessaria per una comprensione approfondita dei meccanismi regolatori della funzionalità mitocondriale. In questo articolo sono descritti e dimostrati metodi specifici per lo studio della struttura e della funzione mitocondriale nelle ovaie di Drosophila vive e fisse.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in Drosophila ovaie

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all'interno delle cellule HeLa utilizzando l'imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.

Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa

Il perossido di idrogeno (H 2 O2 ) è sia una fonte di danno ossidativo che una molecola di segnalazione. Questo protocollo descrive come misurare l'H 2 O2mitocondriale utilizzando HyPer7 mirato ai mitocondri (mtHyPer7), un biosensore raziometrico geneticamente codificato, nel lievito vivente. Descrive in dettaglio come ottimizzare le condizioni di imaging ed eseguire analisi quantitative cellulari e subcellulari utilizzando software disponibili gratuitamente.

Imaging di mtHyPer7, un biosensore raziometrico per il perossido mitocondriale, in cellule di lievito viventi

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

Questo articolo descrive l'uso della microscopia confocale e di ImageJ per valutare la dinamica di fissione/fusione mitocondriale tramite la fluorescenza a fotocommutazione Dendra2.

Valutazione della dinamica della fissione/fusione mitocondriale nelle cellule tubulari prossimali renali

Scopri come monitorare eventi mitocondriali singoli come flash di superossido e fluttuazioni del potenziale di membrana in muscoli scheletrici e cuore perfuso di topo in vivo mediante microscopia confocale.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o In Vivo

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