Name: Saggi per lindividuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Scopri come identificare nuovi antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV) utilizzando saggi basati sull'effetto citopatico (CPE), saggi dose-risposta e saggi Time-of-Addition. Questi metodi permettono di valutare l'efficacia antivirale e la citotossicità dei composti selezionati.

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Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 dal NIH per Q. Li, e dai fondi IMPACT dal Dipartimento di Medicina a UAB di Q. Li. Il sostegno del Fondo Molette e Auburn University è apprezzato. Ringraziamo anche le assistenze tecniche da Ms. Pulin Che e Mr. Volodymyr Musiienko durante il corso dei lavori.

1. Le cellule, virus e antivirale Compounds <ol><li> Mantenere cellule BSR, un derivato di criceto neonato (BHK) rene alveoli 10, in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina. </li><li> Per tutti e tre saggi, cellule piastra in DMEM con 1% FCS, 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina, ottimizzata in precedenza 5. Questo mezzo è indicato come terreno di coltura per tutti e tre saggi. </li><li> Incubare tutte le celle in incubatrice a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità. </li><li> Targa-purificare e propagare il tipo 10 BTV (BTV-10) come descritto in precedenza 8. Diluire BTV-10 nel mezzo di saggio per ogni saggi designati. </li><li> Sciogliere tutti i composti di prova in DMSO per formare uno stock con concentrazione a 10 mm. Conservare le scorte a -20 ° C. </li><li> Diluire composti a concentrazioni desiderate utilizzando terreno di coltura per il designatod saggi 2. </li></ol> 2. Saggio-based CPE Uso CTG Kit <ol><li> Seed cellule BSR in una micropiastra 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) con MicroFlo selezionare dispenser. La densità di semina è di 5.000 cellule / pozzetto, e il volume di semina è di 20 microlitri per l&#39;analisi di efficacia antivirale. </li><li> Incubare le cellule per 2-3 ore sino cellule ottenere aderente alla piastra di fondo. </li><li> Aggiungere composto antivirale con una concentrazione finale di 10 mM di ciascun pozzetto. Mescolare completamente. </li><li> Diluire BTV a titolo desiderato e aggiungere 5 ml BTV con denotato MOI a ciascun bene. Per il controllo bene, aggiungere 5 ml di mezzi di dosaggio. Incubare le cellule infettate per 72 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità. </li><li> A 72 hpi, disgelo ed equilibrare tampone CTG e il substrato CTG liofilizzato a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Ricostituire la soluzione omogenea reagente CTG miscelando il liofilizzato enzima / substrato e il reagente tampone secondo thle istruzioni e del produttore. </li><li> Equilibrare le piastre di saggio a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aggiungere un volume uguale (25 microlitri) di reagenti CTG a ciascun pozzetto da un dispenser. Dopo incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, misurare segnali di luminescenza utilizzando un lettore multi-mode con un tempo di integrazione di 0,1 sec. </li></ol> 3. Dose-risposta Assay <ol><li> Seme cellule BSR in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un distributore, con una densità di semina di 5000 cellule / pozzetto in un volume semina di 20 microlitri per saggio antivirale efficacia e 25 pl per test di citotossicità, rispettivamente . </li><li> Incubare le cellule per 2-3 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità fino cellule sono ben attaccato alla piastra. </li><li> Saggio processo in una zona quarto della piastra a 384 pozzetti per ogni composto (equivalente ad una piastra a 96 pozzetti), come mostrato nella Tabella 1. Allocare otto repliche per ogni concentrazionein un singolo dosaggio. Assegnare la prima colonna come controllo positivo senza aggiungere composti e virus, e l&#39;ultima colonna (12 °) come controllo negativo aggiungendo virus solo senza composti. </li><li> Diluire composti a 50 mM in mezzo di saggio e aggiungere alla colonna 2 ° a 20 pl / pozzetto di saggio antivirale efficacia. Mescolare il composto cinque volte usando 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 25 mM. </li><li> Utilizzando 8-channel pipetta semi-automatico, trasferire 20 microlitri miscela in 2 ° colonna per colonna successiva (3 °), mescolare bene per formare una concentrazione di 12,5 micron. Ripetere questo processo trasferendo 20 microlitri miscela di colonna 3 al colonna successiva (4 °) per formare un altro diluizioni doppie con una concentrazione di 6,25 pM. Ripetere questa diluizione seriale duplice fino al 11 esima colonna. Aspirare ed eliminare 20 microlitri della miscela nella 11 esima colonna dopo l&#39;aggiunta e la miscelazione del compound. </li><li> Aggiungere BTV-10, sulla base MOI di 0,01, ad ogni pozzetto da colonna a colonna 2 11 con un volume di 5 ml / pozzetto. Dopo aver aggiunto il virus, la concentrazione del composto finale in ciascuna colonna deve essere: 20 mM in colonna 2, 10 mM in colonna 3, e prosegue con una diluizione duplice giù a colonna 11 con una concentrazione finale di 0,04 pM. </li><li> Aggiungere 5 ml di gamma medio colonna 1 come cellule di controllo solo (positivo) e 5 ml / pozzetto di BTV alla colonna 12 come infezione BTV unico controllo (negativo). </li><li> Diluire composti ad una concentrazione iniziale di 200 pM per test di citotossicità. Analogamente, aggiungere 25 microlitri / pozzetto di composto alla colonna 2 e 5x mescolato con 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 100 mM. Non aggiungere BTV. </li><li> Eseguire la diluizione serie duplice aspirando a 25 microlitri dalla colonna 2 alla colonna vicina 3, e continuò fino all&#39;ultima colonna (12 °). Alla colonna 12, dopo la miscelazione, aspirare e scartare 25 ml di mixture. La concentrazione finale in colonna 2 dovrebbe essere di 100 micron e la 12 esima colonna deve essere di 0,2 micron. La colonna 1 è l&#39;unico controllo cella. </li><li> Per entrambi l&#39;efficacia e la citotossicità saggi antivirali, incubare le piastre a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e 80-95% di umidità per 72 ore dopo il trattamento. Misurare la vitalità cellulare utilizzando il kit di CTG come descritto sopra (protocollo passaggi 2,5-2,7). </li></ol> 4. Time-of-Addition (ToA) Assay <ol><li> Seme cellule BSR da 1-24 colonna in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un dispenser a 5.000 cellule / pozzetto e il volume semina è 15 microlitri / pozzetto. </li><li> Per ogni composto, utilizzare tutti ventiquattro colonne con otto repliche per ogni punto temporale in una metà della piastra a 384 pozzetti (Tabella 2). Assegnare colonna 1 come cellule controllo solo con l&#39;aggiunta di 10 microlitri / pozzetto terreno di coltura. Mark colonna 24 come infezione BTV solo controllo (controllo negativo) aggiungendo 5 microlitri / pozzetto dosaggio medio divirus d 5 microlitri / pozzetto a MOI di 0,01 ad un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. </li><li> Selezionare le colonne con numeri da colonna 2-22 come antivirale colonna di valutazione di efficacia in diverse ore dopo l&#39;infezione (HPI). In queste colonne, infettare le cellule con 5 ml / pozzetto BTV al MOI di 0.01. Al diversa hpi, aggiungi 5 microlitri / composto ben diluito ad ogni pozzetto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. Per il indicati -2 e -1 HPI aggiungono composto da cellule BSR prima infezione BTV. Per 0 hpi, aggiungere il composto e BTV alla cultura contemporanea. </li><li> Parallelamente, designare le colonne dispari da colonna 3-23 come composto controlla solo, dei quali composto sono stati aggiunti a diversi punti temporali come designato (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). In queste colonne, aggiungere 5 microlitri medio / pozzetto dosaggio e 5 microlitri / pozzetto diluito composto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. </li><li> Dopo il trattamento, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 con 80-95% di umidità. </li><li> Determinare la vitalità cellulare a 72 HPI utilizzando il kit CellTiter-Glo come descritto in precedenza (protocollo passaggi 2,5-2,7). </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Elaborare tutti i dati del primo utilizzo corretto del software in-house in base ai segnali luminescenti ottenuti tramite il lettore multi-mode. Determinare il valore medio (media), la deviazione standard (DEVST) per ogni trattamento, nonché le variazioni coefficiente (CV), che richiede un valore non superiore al 10%. </li><li> Trasferire i dati elaborati dal software di cui sopra per un software biostatico e grafica. Effettuare l&#39;analisi di regressione non lineare per determinare i valori di EC 50 e CC 50. </li></ol>

<ol><li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341(2012).</li>
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<li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+Antiinfect.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+100%2C000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+%28H3N2%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100%2C000-compound+library%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li>
<li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li>
<li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li>
<li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li>
<li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per l&#39;identificazione iniziale di colpi antivirali, uno dei passaggi chiave per la scoperta di farmaci antivirali e di sviluppo è quello di sviluppare analisi robuste, che prevede la selezione di un indicatore quantificabile, lo sviluppo di un protocollo semplice, ottenendo segnali sufficienti e meno del 10% CV. Quasi tutte le schermate biochimiche o basati su cellule sono progettati per fornire un punto di partenza chimica basato sulla più robusta, semplice e poco costoso saggio, causa la riproducibilità richiesta ...

BTV è un prototipo di virus a RNA a doppio filamento in genere Orbivirus, famiglia Reoviridae. BTV è una delle malattie più importanti del bestiame domestico, tra cui ovini, caprini, bovini e altri animali domestici, con la perdita di 3.000 milioni dollari / anno nel mondo 1,2. La BTV sierotipo esotico è un importante patogeno animale elencati nella sezione &quot;USDA alta Consequence Bestiame patogeni.&quot; Recentemente, il riemergere di BTV ha causato una grave focolaio di malattia in bovini e ovini in diversi paesi in tutto il Nord Europa 3,4. Come risultato della sua rilevanza economica e come sistema modello, BTV è stato oggetto di approfonditi studi molecolari, genetici e strutturali, e sono stati sviluppati diversi vaccini. Tuttavia, a causa della mancanza di test adeguati per la scoperta di farmaci antivirali, non ci sono disponibili antivirali contro BTV. In un recente screening ad alto rendimento (HTS) campagna usando BTV come sistema modello, Developed, ottimizzato e convalidato un saggio basato CPE-per identificare i potenziali antivirali ad ampio spettro contro arbovirus 5. Saggio basato CPE-è un saggio ben riconosciuto che è stato usato nella scoperta di farmaci antivirali contro una serie di virus che ha indotto un rapido e osservabile CPE / apoptosi 5-7. Nel nostro sistema, infezioni post BTV, CPE è evidente nelle cellule dei vertebrati, tra cui HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE BTV-indotta potrebbe essere monitorato e quantificato utilizzando vari metodi di rilevamento vitalità cellulare, compreso il kit di reagenti vitalità cellulare CellTiter Glo (kit CTG) 9. Questo kit determina il numero di cellule vitali in coltura a base di quantificazione di ATP cellulare presentato, che segnala la presenza di cellule viventi metabolicamente attive. In condizioni ottimali, il saggio basato CPE-qui presentato ha dimostrato la sua fattibilità con il protocollo di un passo &quot;mix e misura&quot;, e la flessibilità con i segnali luminescenti stabili. Nel frattempo, composti tossici riduziamento vitalità cellulare sarà escluso in questo saggio basato CPE. Il saggio basato CPE-ha mostrato la sua robustezza e affidabilità per la scoperta di farmaci antivirali contro BTV, ed è stato utilizzato per schermare il NIH molecolare Biblioteche Piccolo Molecola Repository (MLSMR), che porta alla identificazione di sei romanzo gruppo di potenziali lead compound antivirale (s ) 5. Quando un composto antivirale potenziale è stato identificato utilizzando il saggio basato CPE-, esso dovrà essere sottoposto al dieci concentrazione dosaggio dose-risposta per determinare l&#39;intervallo di efficacia antivirale e citotossicità 2. L&#39;efficacia antivirale, rappresentata come la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) o la concentrazione efficace 50% (EC 50), è la concentrazione di un farmaco che inibisce virus-indotto CPE metà strada tra la linea di base e massimo. La citotossicità dei farmaci antivirali, cioè la concentrazione citotossicità 50% (CC 50), è la concentrazionedi un farmaco che induce il 50% di citotossicità tra la linea base e massimo. L&#39;indice selettivo (SI), indicato come 50% SI (SI 50) è calcolata da CC 50 / IC 50 che determina la specificità del CPE antivirale contro virus-indotta. L&#39;IC 50 (o 50 CE), CC 50 e SI 50 valori sono misure fondamentali per determinare se un composto antivirale è potente e selettivo per l&#39;ulteriore sviluppo della droga. Quando un antivirale ha mostrato alcuna tossicità manifesta in vitro, ma virus impedito indotto CPE e il ciclo di vita virale produttiva, è importante per determinarne la MoA 2. Abbiamo avviato tale caratterizzazione effettuando test ToA per determinare l&#39;eventuale fase (s) di virale ciclo di vita che è influenzata dal antivirale. In generale, composto antivirale sono stati aggiunti alle cellule in diversi momenti pre-o post-infezione da virus. Se gli antivirali sono stati aggiunti alle cellule infettate rispondere alla sua destinazione step durante il corso dell&#39;infezione, ne risulterebbe minore attività rispetto a quella che è stata aggiunta prima della fase. Così, studio ToA è critica per determinare l&#39;efficacia di un composto antivirale, e il suo potenziale bersaglio, sia sul ciclo di vita virale o della macchina ospitante coinvolti nel ciclo di vita virale. Per tutti e tre saggi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG seguenti istruzioni del produttore 5. Questo sistema di rilevamento emette adeguati segnali di luminescenza che potrebbero essere analizzate utilizzando i vari software in-house. Ogni test è stato convalidato ed eseguito in almeno tre esemplari con otto repliche. Per tutti i dati ottenuti, tre parametri, con un valore medio (AVE), deviazione standard (DEVST), e coefficiente di variazione (CV) sono stati analizzati per determinare la robustezza del dosaggio. Una volta che la robustezza del saggio è stata determinata, i dati saranno ulteriormente analizzati e tracciati utilizzando vari biostatics e graficamentestrumenti di C 2.

<table><tbody><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>1134218</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>1000185</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gbico</td><td>1049769</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Kit CellTiter-Glo (CTG)</td><td>Promega</td><td>TB288</td><td>Per la misurazione della vitalità cellulare</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Fisher</td><td>S25309B</td><td>Diluito dal 95%</td></tr><tr><td>Composti huasil antivirali</td><td>NIH MLSMR e sintesi</td><td></td><td></td>de novo</tr><tr><td>BTV-10</td><td>ATCC</td><td>VR-187</td><td></td></tr><tr><td>Cella BSR</td><td>Sviluppato internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre multimodale Synergy-II</td><td>BioTek</td><td></td><td>Per la lettura del segnale luminescente</td></tr><tr><td>Dispenser</td> <td>selezionato MicroFloBioTek</td><td></td><td>Aggiunta di cellule, virus e reagenti</td></tr><tr><td>Micropiastra a fondo piatto a 384 pozzetti</td><td>CORNING</td><td>28908031</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Software Gen. 5</td><td>BioTek</td><td></td><td>Per l'analisi dei risultati di lettura dal lettore di micropiastre multimodale Synergy-II</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Versione 5</td><td>Per analisi biostatiche e tracciatura</td></tr></tbody></table>

saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della bluetongue

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Per identificare potenziali farmaci antivirali contro il BTV, abbiamo sviluppato, ottimizzato e validato tre saggi qui presentati. Il saggio basato CPE-è stato il primo test sviluppato per valutare se un composto ha mostrato alcuna efficacia antivirale e sono stati utilizzati per lo screening grande libreria di composti. Nel frattempo, la citotossicità di farmaci antivirali potrebbe anche essere valutata utilizzando il saggio basato CPE-. Il dosaggio dose-risposta è stato progettato per determinare il campo di efficacia per l&#39;antivirale prescelto, cioè il 50% della concentrazione inibente (IC 50) o la concentrazione effettiva (EC 50), così come la sua gamma di citotossicità (CC 50). Il saggio ToA è stato impiegato per lo studio iniziale MoA per determinare il meccanismo alla base dei nuovi farmaci antivirali durante il ciclo di vita virale del virus o il possibile effetto su un host macchinario cellulare. Questi test sono essenziali per la valutazione dell&#39;efficacia antivirale nel sistema di coltura cellulare, e sono stati utilizzati per le nostre ricerche recenti portarezione per l&#39;identificazione di una serie di nuovi farmaci antivirali contro il BTV.

1. Efficacia antivirale del composto Il saggio CPE a base di cellule è stato sviluppato, ottimizzato e validato in vitro utilizzando il kit CTG basata luminescenti a identificare nuovi farmaci antivirali contro BTV come descritto in precedenza 2,5. Il test di risposta ten-dose è stata impiegata per riflettere l'efficacia antivirale e citotossicità di un composto guida identificato misurando il numero di cellule metabolicamente vitali in coltura a base di quantificazione di A...

Tre saggi, tra cui l&#39;effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d&#39;azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e caratterizzare antivirali a piccole molecole contro il virus della lingua blu o BTV utilizzando il saggio di vitalità cellulare basato su CPE. Ciò si ottiene effettuando prima lo screening di una libreria di composti antivirali utilizzando l'effetto citopatico o il saggio basato su CPE con il reagente bagliore del titolo cellulare. Successivamente, viene confermata l'efficacia antivirale e viene valutata la citotossicità di antivirali selezionati utilizzando il test dose-risposta.Infine, viene effettuato il test del tempo di aggiunta per determinare il possibile stadio del ciclo di vita virale di antivirali selezionati che porta ai possibili meccanismi d'azione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano nuovi antivirali con potente CIE antivirale e bassa citotossicità in base al test dose-risposta e al tempo di aggiunta. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il test TCI D 50 in un test di placca è che questa tecnica fornisce un metodo sensibile, robusto e altamente riproduttivo per lo screening e la classificazione dell'antivirus contro un determinato virus, incluso il virus del glutine, che induce CP misurabile nelle cellule infette In preparazione per il test basato su CPE da cellule BSR mantenute in DMEM integrato, utilizzare un dosatore di selezione a microflusso per Semina 20 microlitri di cellule a 5.000 cellule per pozzetto in un 384.A pozzetti, incubare le cellule per due o tre ore per consentire loro di aderire completamente alla piastra, quindi aggiungere composti antivirali a una concentrazione finale di 10 micromolari a ciascun pozzetto e mescolare completamente. Utilizzare il terreno di prova per diluire la placca di BTV purificata e propagata al titolo desiderato e aggiungere cinque microlitri di BTV con MOI indicato in ciascun pozzetto per il controllo. Aggiungere cinque microlitri di terreno di coltura, inserire nell'incubatore una scatola umida contenente la piastra di analisi e incubare le cellule infette per 72 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e dall'80 al 95% di umidità.Quindi estrarre la piastra di analisi dall'incubatore, quindi scongelare ed equilibrare il tampone CTG e il substrato CTG liofilizzato a temperatura ambiente. Quindi ricostituire la soluzione omogenea del reagente CTG mescolando il substrato enzimatico liofilizzato e il reagente tampone secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver bilanciato le piastre del saggio a temperatura ambiente per 15 minuti, utilizzare un dosatore per aggiungere 25 microlitri di reagenti CTG a ciascun pozzetto, incubare per 15 minuti al buio prima di utilizzare un lettore multimodale con un tempo di integrazione di 0,1 secondi per misurare i segnali luminescenti seminare 5.000 cellule BSR per pozzetto in micropiastra da 384 pozzetti per il test dose-risposta, utilizzando 20 microlitri per il test di efficacia antivirale e 25 microlitri per il test di citotossicità.Dopo un'incubazione di due o tre ore, allocare otto repliche per ogni concentrazione di composto per saggio, come mostrato qui. Assegnare la prima colonna come controllo positivo senza aggiungere composti o virus e l'ultima colonna come controllo negativo aggiungendo virus solo per il test di efficacia antivirale diluire i composti a 50 micromolari nel terreno di saggio e alla seconda colonna aggiungere 20 microlitri per pozzetto. Utilizzando una pipetta semiautomatica a otto canali.Mescolare il composto cinque volte fino a una concentrazione di 25 micromolari. Successivamente, trasferire 20 microlitri della miscela nella seconda colonna nella colonna tre e mescolare bene, ottenendo una concentrazione di 12,5 micromolari. Ripetete l'operazione due volte.Diluizione seriale fino all'11° colonna, che avrà una concentrazione finale di 0,04 micromolare. Quindi aggiungere cinque microlitri di terreno alla colonna uno come unico controllo positivo della cellula e cinque microlitri per pozzetto di BTV alla colonna 12 come solo infezione da BTV A. Controllo negativo: aggiungere cinque microlitri per pozzetto di BTV dalla colonna due alla colonna 11 per il test di citotossicità, diluire il composto a una concentrazione iniziale di 200 micromolari.Aggiungere 25 microlitri per pozzetto di composto alla colonna due e mescolare cinque volte per portare la concentrazione a 100 micromolari. Effettuare la diluizione in doppia serie trasferendo 25 microlitri dalla colonna due alla colonna tre vicina e proseguire attraverso la colonna 12. Dopo aver miscelato la colonna 12, aspirare e scartare 25 microlitri di miscela.La prima colonna è l'unico controllo cellulare per i saggi antivirali e di citotossicità. Mettere una scatola umida contenente la piastra di analisi nell'incubatore per 72 ore e successivamente estrarre la piastra. Quindi utilizzare il kit CT G per misurare la vitalità cellulare.Utilizza un software biostatistico e grafico per calcolare il valore medio, le variazioni del coefficiente di deviazione standard e la percentuale di vitalità cellulare per ogni concentrazione di composto ed esegui analisi di regressione non lineare per determinare l'EC 50 e il CC 50 di ciascun composto. Prepararsi per il momento dell'aggiunta o del saggio TOA seminando 5.000 cellule per pozzetto in 15 microlitri nella colonna da uno a 24 di un 384. Bene la micropiastra per ogni composto.Utilizza tutte le 24 colonne con otto repliche per ogni punto temporale. Assegnare la colonna uno come controllo solo cellule aggiungendo 10 microlitri per pozzetto del terreno di analisi contrassegnare la colonna 24 solo come infezione da BTV. Controllo negativo aggiungendo cinque microlitri per pozzetto di terreno di analisi e cinque microlitri per pozzetto di virus con un MOI di 0,01.In un volume finale di 25 microlitri per pozzetto, selezionare le colonne con numero pari dalla colonna due alla 22 come colonne di valutazione dell'efficacia antivirale in ore diverse dopo l'infezione o HPI in queste colonne, infettare le cellule con cinque microlitri per pozzetto di BTV a un MOI di 0,01 a diversi HPI aggiungere anche cinque microlitri per pozzetto di composto diluito a un volume finale di 25 microlitri per pozzetto per il indicato meno due e meno un HPI. Aggiungere il composto alle cellule BSR prima dell'infezione da BTV per zero HPI, aggiungere contemporaneamente il composto e il BTV alla coltura. In parallelo, designare le colonne con numero dispari da tre a 23 come controlli composti che corrispondono ai diversi punti temporali in queste colonne.Aggiungere cinque microlitri per pozzetto di terreno di analisi e cinque microlitri per pozzetto di composto diluito in un volume finale di 25 microlitri per pozzetto. Dopo aver incubato le cellule a 72 HPI nell'incubatore, estrarre la piastra del saggio e utilizzare il kit di incandescente del titolo cellulare per determinare la vitalità cellulare. Infine, utilizzare un software che elabora i segnali luminescenti ottenuti tramite il lettore multimodale per determinare il valore medio.S-T-D-E-V CV e percentuale di vitalità delle cellule di protezione per ciascun trattamento utilizzando il test CPE per quantificare l'A TP cellulare nelle cellule viventi, abbiamo precedentemente identificato diversi composti guida promettenti con potente efficacia antivirale, bassa tossicità e alta selettività. Ad esempio, è stato determinato che il composto 0 5 2 ha un EC 50 di 0,27 più o meno 0,12 micromolari e CC 50 di 82,69 micromolari, entrambi con curve regressive tipiche. Nell'ambito dell'analisi delle analisi di regressione non lineare, l'SI 50 di C 0 5 2 è stato determinato che 306 in base ai suoi valori EC 50 e CC 50 l'efficacia antivirale su scala nanomolare, la bassa tossicità e di conseguenza l'alto SI 50 indicavano che C 0 5 2 potrebbe essere un potente e selettivo antivirale contro BTV come si vede qui, le cellule sono state infettate con BTV a un MOI di 0,01 in presenza di 10 diverse concentrazioni di C 0 5 2 e la vitalità cellulare è stata determinata a 72 HPI.Utilizzando il kit CTG, ogni punto dati rappresenta medie e SD da cinque repliche. Il test TOA è stato utilizzato per determinare le possibili fasi del ciclo di vita virale bersaglio dei composti. Quando C 0 5 2 è stato aggiunto una o due ore prima dell'infezione da BTV, l'efficacia antivirale è rimasta su scala nanomolare come si vede in questa figura.Inoltre, la vitalità cellulare è diminuita ulteriormente quando C 0 5 2 è stato aggiunto a 32 e 48 HPI, indicando che C 0 5 2 potrebbe agire oltre la fase iniziale del ciclo di vita virale, come l'ingresso del virus. Poiché il primo ciclo di replicazione virale del BTV è solitamente completo nelle cellule infette entro 24 HPI, i nostri risultati hanno suggerito che il C 0 5 2 potrebbe agire nelle fasi avanzate del ciclo di vita virale del BTV, come la replicazione, l'impacchettamento, la maturazione e l'uscita del virus. Nel frattempo, è anche possibile che C 0 5 2 agisca sul macchinario cellulare ospite che funziona durante le fasi successive del ciclo di vita virale.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il miglior saggio CPE per identificare e classificare il potenziale antivirus contro i virus che inducono CPE misurabile dopo l'infezione.

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