Name: Saggi per lindividuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Scopri come identificare nuovi antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV) utilizzando saggi basati sull'effetto citopatico (CPE), saggi dose-risposta e saggi Time-of-Addition. Questi metodi permettono di valutare l'efficacia antivirale e la citotossicità dei composti selezionati.

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Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 dal NIH per Q. Li, e dai fondi IMPACT dal Dipartimento di Medicina a UAB di Q. Li. Il sostegno del Fondo Molette e Auburn University è apprezzato. Ringraziamo anche le assistenze tecniche da Ms. Pulin Che e Mr. Volodymyr Musiienko durante il corso dei lavori.

1. Le cellule, virus e antivirale Compounds <ol><li> Mantenere cellule BSR, un derivato di criceto neonato (BHK) rene alveoli 10, in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina. </li><li> Per tutti e tre saggi, cellule piastra in DMEM con 1% FCS, 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina, ottimizzata in precedenza 5. Questo mezzo è indicato come terreno di coltura per tutti e tre saggi. </li><li> Incubare tutte le celle in incubatrice a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità. </li><li> Targa-purificare e propagare il tipo 10 BTV (BTV-10) come descritto in precedenza 8. Diluire BTV-10 nel mezzo di saggio per ogni saggi designati. </li><li> Sciogliere tutti i composti di prova in DMSO per formare uno stock con concentrazione a 10 mm. Conservare le scorte a -20 ° C. </li><li> Diluire composti a concentrazioni desiderate utilizzando terreno di coltura per il designatod saggi 2. </li></ol> 2. Saggio-based CPE Uso CTG Kit <ol><li> Seed cellule BSR in una micropiastra 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) con MicroFlo selezionare dispenser. La densità di semina è di 5.000 cellule / pozzetto, e il volume di semina è di 20 microlitri per l&#39;analisi di efficacia antivirale. </li><li> Incubare le cellule per 2-3 ore sino cellule ottenere aderente alla piastra di fondo. </li><li> Aggiungere composto antivirale con una concentrazione finale di 10 mM di ciascun pozzetto. Mescolare completamente. </li><li> Diluire BTV a titolo desiderato e aggiungere 5 ml BTV con denotato MOI a ciascun bene. Per il controllo bene, aggiungere 5 ml di mezzi di dosaggio. Incubare le cellule infettate per 72 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità. </li><li> A 72 hpi, disgelo ed equilibrare tampone CTG e il substrato CTG liofilizzato a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Ricostituire la soluzione omogenea reagente CTG miscelando il liofilizzato enzima / substrato e il reagente tampone secondo thle istruzioni e del produttore. </li><li> Equilibrare le piastre di saggio a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aggiungere un volume uguale (25 microlitri) di reagenti CTG a ciascun pozzetto da un dispenser. Dopo incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, misurare segnali di luminescenza utilizzando un lettore multi-mode con un tempo di integrazione di 0,1 sec. </li></ol> 3. Dose-risposta Assay <ol><li> Seme cellule BSR in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un distributore, con una densità di semina di 5000 cellule / pozzetto in un volume semina di 20 microlitri per saggio antivirale efficacia e 25 pl per test di citotossicità, rispettivamente . </li><li> Incubare le cellule per 2-3 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità fino cellule sono ben attaccato alla piastra. </li><li> Saggio processo in una zona quarto della piastra a 384 pozzetti per ogni composto (equivalente ad una piastra a 96 pozzetti), come mostrato nella Tabella 1. Allocare otto repliche per ogni concentrazionein un singolo dosaggio. Assegnare la prima colonna come controllo positivo senza aggiungere composti e virus, e l&#39;ultima colonna (12 °) come controllo negativo aggiungendo virus solo senza composti. </li><li> Diluire composti a 50 mM in mezzo di saggio e aggiungere alla colonna 2 ° a 20 pl / pozzetto di saggio antivirale efficacia. Mescolare il composto cinque volte usando 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 25 mM. </li><li> Utilizzando 8-channel pipetta semi-automatico, trasferire 20 microlitri miscela in 2 ° colonna per colonna successiva (3 °), mescolare bene per formare una concentrazione di 12,5 micron. Ripetere questo processo trasferendo 20 microlitri miscela di colonna 3 al colonna successiva (4 °) per formare un altro diluizioni doppie con una concentrazione di 6,25 pM. Ripetere questa diluizione seriale duplice fino al 11 esima colonna. Aspirare ed eliminare 20 microlitri della miscela nella 11 esima colonna dopo l&#39;aggiunta e la miscelazione del compound. </li><li> Aggiungere BTV-10, sulla base MOI di 0,01, ad ogni pozzetto da colonna a colonna 2 11 con un volume di 5 ml / pozzetto. Dopo aver aggiunto il virus, la concentrazione del composto finale in ciascuna colonna deve essere: 20 mM in colonna 2, 10 mM in colonna 3, e prosegue con una diluizione duplice giù a colonna 11 con una concentrazione finale di 0,04 pM. </li><li> Aggiungere 5 ml di gamma medio colonna 1 come cellule di controllo solo (positivo) e 5 ml / pozzetto di BTV alla colonna 12 come infezione BTV unico controllo (negativo). </li><li> Diluire composti ad una concentrazione iniziale di 200 pM per test di citotossicità. Analogamente, aggiungere 25 microlitri / pozzetto di composto alla colonna 2 e 5x mescolato con 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 100 mM. Non aggiungere BTV. </li><li> Eseguire la diluizione serie duplice aspirando a 25 microlitri dalla colonna 2 alla colonna vicina 3, e continuò fino all&#39;ultima colonna (12 °). Alla colonna 12, dopo la miscelazione, aspirare e scartare 25 ml di mixture. La concentrazione finale in colonna 2 dovrebbe essere di 100 micron e la 12 esima colonna deve essere di 0,2 micron. La colonna 1 è l&#39;unico controllo cella. </li><li> Per entrambi l&#39;efficacia e la citotossicità saggi antivirali, incubare le piastre a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e 80-95% di umidità per 72 ore dopo il trattamento. Misurare la vitalità cellulare utilizzando il kit di CTG come descritto sopra (protocollo passaggi 2,5-2,7). </li></ol> 4. Time-of-Addition (ToA) Assay <ol><li> Seme cellule BSR da 1-24 colonna in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un dispenser a 5.000 cellule / pozzetto e il volume semina è 15 microlitri / pozzetto. </li><li> Per ogni composto, utilizzare tutti ventiquattro colonne con otto repliche per ogni punto temporale in una metà della piastra a 384 pozzetti (Tabella 2). Assegnare colonna 1 come cellule controllo solo con l&#39;aggiunta di 10 microlitri / pozzetto terreno di coltura. Mark colonna 24 come infezione BTV solo controllo (controllo negativo) aggiungendo 5 microlitri / pozzetto dosaggio medio divirus d 5 microlitri / pozzetto a MOI di 0,01 ad un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. </li><li> Selezionare le colonne con numeri da colonna 2-22 come antivirale colonna di valutazione di efficacia in diverse ore dopo l&#39;infezione (HPI). In queste colonne, infettare le cellule con 5 ml / pozzetto BTV al MOI di 0.01. Al diversa hpi, aggiungi 5 microlitri / composto ben diluito ad ogni pozzetto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. Per il indicati -2 e -1 HPI aggiungono composto da cellule BSR prima infezione BTV. Per 0 hpi, aggiungere il composto e BTV alla cultura contemporanea. </li><li> Parallelamente, designare le colonne dispari da colonna 3-23 come composto controlla solo, dei quali composto sono stati aggiunti a diversi punti temporali come designato (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). In queste colonne, aggiungere 5 microlitri medio / pozzetto dosaggio e 5 microlitri / pozzetto diluito composto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. </li><li> Dopo il trattamento, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 con 80-95% di umidità. </li><li> Determinare la vitalità cellulare a 72 HPI utilizzando il kit CellTiter-Glo come descritto in precedenza (protocollo passaggi 2,5-2,7). </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Elaborare tutti i dati del primo utilizzo corretto del software in-house in base ai segnali luminescenti ottenuti tramite il lettore multi-mode. Determinare il valore medio (media), la deviazione standard (DEVST) per ogni trattamento, nonché le variazioni coefficiente (CV), che richiede un valore non superiore al 10%. </li><li> Trasferire i dati elaborati dal software di cui sopra per un software biostatico e grafica. Effettuare l&#39;analisi di regressione non lineare per determinare i valori di EC 50 e CC 50. </li></ol>

<ol><li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341(2012).</li>
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<li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+Antiinfect.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+100%2C000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+%28H3N2%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100%2C000-compound+library%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li>
<li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li>
<li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li>
<li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li>
<li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per l&#39;identificazione iniziale di colpi antivirali, uno dei passaggi chiave per la scoperta di farmaci antivirali e di sviluppo è quello di sviluppare analisi robuste, che prevede la selezione di un indicatore quantificabile, lo sviluppo di un protocollo semplice, ottenendo segnali sufficienti e meno del 10% CV. Quasi tutte le schermate biochimiche o basati su cellule sono progettati per fornire un punto di partenza chimica basato sulla più robusta, semplice e poco costoso saggio, causa la riproducibilità richiesta ...

BTV è un prototipo di virus a RNA a doppio filamento in genere Orbivirus, famiglia Reoviridae. BTV è una delle malattie più importanti del bestiame domestico, tra cui ovini, caprini, bovini e altri animali domestici, con la perdita di 3.000 milioni dollari / anno nel mondo 1,2. La BTV sierotipo esotico è un importante patogeno animale elencati nella sezione &quot;USDA alta Consequence Bestiame patogeni.&quot; Recentemente, il riemergere di BTV ha causato una grave focolaio di malattia in bovini e ovini in diversi paesi in tutto il Nord Europa 3,4. Come risultato della sua rilevanza economica e come sistema modello, BTV è stato oggetto di approfonditi studi molecolari, genetici e strutturali, e sono stati sviluppati diversi vaccini. Tuttavia, a causa della mancanza di test adeguati per la scoperta di farmaci antivirali, non ci sono disponibili antivirali contro BTV. In un recente screening ad alto rendimento (HTS) campagna usando BTV come sistema modello, Developed, ottimizzato e convalidato un saggio basato CPE-per identificare i potenziali antivirali ad ampio spettro contro arbovirus 5. Saggio basato CPE-è un saggio ben riconosciuto che è stato usato nella scoperta di farmaci antivirali contro una serie di virus che ha indotto un rapido e osservabile CPE / apoptosi 5-7. Nel nostro sistema, infezioni post BTV, CPE è evidente nelle cellule dei vertebrati, tra cui HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE BTV-indotta potrebbe essere monitorato e quantificato utilizzando vari metodi di rilevamento vitalità cellulare, compreso il kit di reagenti vitalità cellulare CellTiter Glo (kit CTG) 9. Questo kit determina il numero di cellule vitali in coltura a base di quantificazione di ATP cellulare presentato, che segnala la presenza di cellule viventi metabolicamente attive. In condizioni ottimali, il saggio basato CPE-qui presentato ha dimostrato la sua fattibilità con il protocollo di un passo &quot;mix e misura&quot;, e la flessibilità con i segnali luminescenti stabili. Nel frattempo, composti tossici riduziamento vitalità cellulare sarà escluso in questo saggio basato CPE. Il saggio basato CPE-ha mostrato la sua robustezza e affidabilità per la scoperta di farmaci antivirali contro BTV, ed è stato utilizzato per schermare il NIH molecolare Biblioteche Piccolo Molecola Repository (MLSMR), che porta alla identificazione di sei romanzo gruppo di potenziali lead compound antivirale (s ) 5. Quando un composto antivirale potenziale è stato identificato utilizzando il saggio basato CPE-, esso dovrà essere sottoposto al dieci concentrazione dosaggio dose-risposta per determinare l&#39;intervallo di efficacia antivirale e citotossicità 2. L&#39;efficacia antivirale, rappresentata come la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) o la concentrazione efficace 50% (EC 50), è la concentrazione di un farmaco che inibisce virus-indotto CPE metà strada tra la linea di base e massimo. La citotossicità dei farmaci antivirali, cioè la concentrazione citotossicità 50% (CC 50), è la concentrazionedi un farmaco che induce il 50% di citotossicità tra la linea base e massimo. L&#39;indice selettivo (SI), indicato come 50% SI (SI 50) è calcolata da CC 50 / IC 50 che determina la specificità del CPE antivirale contro virus-indotta. L&#39;IC 50 (o 50 CE), CC 50 e SI 50 valori sono misure fondamentali per determinare se un composto antivirale è potente e selettivo per l&#39;ulteriore sviluppo della droga. Quando un antivirale ha mostrato alcuna tossicità manifesta in vitro, ma virus impedito indotto CPE e il ciclo di vita virale produttiva, è importante per determinarne la MoA 2. Abbiamo avviato tale caratterizzazione effettuando test ToA per determinare l&#39;eventuale fase (s) di virale ciclo di vita che è influenzata dal antivirale. In generale, composto antivirale sono stati aggiunti alle cellule in diversi momenti pre-o post-infezione da virus. Se gli antivirali sono stati aggiunti alle cellule infettate rispondere alla sua destinazione step durante il corso dell&#39;infezione, ne risulterebbe minore attività rispetto a quella che è stata aggiunta prima della fase. Così, studio ToA è critica per determinare l&#39;efficacia di un composto antivirale, e il suo potenziale bersaglio, sia sul ciclo di vita virale o della macchina ospitante coinvolti nel ciclo di vita virale. Per tutti e tre saggi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG seguenti istruzioni del produttore 5. Questo sistema di rilevamento emette adeguati segnali di luminescenza che potrebbero essere analizzate utilizzando i vari software in-house. Ogni test è stato convalidato ed eseguito in almeno tre esemplari con otto repliche. Per tutti i dati ottenuti, tre parametri, con un valore medio (AVE), deviazione standard (DEVST), e coefficiente di variazione (CV) sono stati analizzati per determinare la robustezza del dosaggio. Una volta che la robustezza del saggio è stata determinata, i dati saranno ulteriormente analizzati e tracciati utilizzando vari biostatics e graficamentestrumenti di C 2.

<table><tbody><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>1134218</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>1000185</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gbico</td><td>1049769</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Kit CellTiter-Glo (CTG)</td><td>Promega</td><td>TB288</td><td>Per la misurazione della vitalità cellulare</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Fisher</td><td>S25309B</td><td>Diluito dal 95%</td></tr><tr><td>Composti huasil antivirali</td><td>NIH MLSMR e sintesi</td><td></td><td></td>de novo</tr><tr><td>BTV-10</td><td>ATCC</td><td>VR-187</td><td></td></tr><tr><td>Cella BSR</td><td>Sviluppato internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre multimodale Synergy-II</td><td>BioTek</td><td></td><td>Per la lettura del segnale luminescente</td></tr><tr><td>Dispenser</td> <td>selezionato MicroFloBioTek</td><td></td><td>Aggiunta di cellule, virus e reagenti</td></tr><tr><td>Micropiastra a fondo piatto a 384 pozzetti</td><td>CORNING</td><td>28908031</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Software Gen. 5</td><td>BioTek</td><td></td><td>Per l'analisi dei risultati di lettura dal lettore di micropiastre multimodale Synergy-II</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Versione 5</td><td>Per analisi biostatiche e tracciatura</td></tr></tbody></table>

saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della bluetongue

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Per identificare potenziali farmaci antivirali contro il BTV, abbiamo sviluppato, ottimizzato e validato tre saggi qui presentati. Il saggio basato CPE-è stato il primo test sviluppato per valutare se un composto ha mostrato alcuna efficacia antivirale e sono stati utilizzati per lo screening grande libreria di composti. Nel frattempo, la citotossicità di farmaci antivirali potrebbe anche essere valutata utilizzando il saggio basato CPE-. Il dosaggio dose-risposta è stato progettato per determinare il campo di efficacia per l&#39;antivirale prescelto, cioè il 50% della concentrazione inibente (IC 50) o la concentrazione effettiva (EC 50), così come la sua gamma di citotossicità (CC 50). Il saggio ToA è stato impiegato per lo studio iniziale MoA per determinare il meccanismo alla base dei nuovi farmaci antivirali durante il ciclo di vita virale del virus o il possibile effetto su un host macchinario cellulare. Questi test sono essenziali per la valutazione dell&#39;efficacia antivirale nel sistema di coltura cellulare, e sono stati utilizzati per le nostre ricerche recenti portarezione per l&#39;identificazione di una serie di nuovi farmaci antivirali contro il BTV.

1. Efficacia antivirale del composto Il saggio CPE a base di cellule è stato sviluppato, ottimizzato e validato in vitro utilizzando il kit CTG basata luminescenti a identificare nuovi farmaci antivirali contro BTV come descritto in precedenza 2,5. Il test di risposta ten-dose è stata impiegata per riflettere l'efficacia antivirale e citotossicità di un composto guida identificato misurando il numero di cellule metabolicamente vitali in coltura a base di quantificazione di A...

Tre saggi, tra cui l&#39;effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d&#39;azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e caratterizzare antivirali a piccole molecole contro il virus della lingua blu o BTV utilizzando il saggio di vitalità cellulare basato su CPE. Ciò si ottiene effettuando prima lo screening di una libreria di composti antivirali utilizzando l'effetto citopatico o il saggio basato su CPE con il reagente bagliore del titolo cellulare. Successivamente, viene confermata l'efficacia antivirale e viene valutata la citotossicità di antivirali selezionati utilizzando il test dose-risposta.Infine, viene effettuato il test del tempo di aggiunta per determinare il possibile stadio del ciclo di vita virale di antivirali selezionati che porta ai possibili meccanismi d'azione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano nuovi antivirali con potente CIE antivirale e bassa citotossicità in base al test dose-risposta e al tempo di aggiunta. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il test TCI D 50 in un test di placca è che questa tecnica fornisce un metodo sensibile, robusto e altamente riproduttivo per lo screening e la classificazione dell'antivirus contro un determinato virus, inclu

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo semplice macchia di slot è stato sviluppato per la quantificazione del emoagglutinina e neuraminidasi dell'influenza virale utilizzando anticorpi universali indirizzare le proprie sequenze più conservate identificate attraverso l'analisi bioinformatica. Questo approccio innovativo può fornire una valida alternativa alla determinazione quantitativa di tutti i emoagglutinina e neuraminidasi virale.

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Qui, presentiamo un protocollo che esamina passaggi specifici dell'ingresso virale per identificare e valutare nuovi agenti antivirali.

All&#39;inizio virali ingresso saggi per l&#39;identificazione e la valutazione di composti antivirali

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

Questo protocollo introduce una procedura operativa di laboratorio standard per il test diagnostico degli antigeni lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan.

Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan

È stata sviluppata una reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa nidificata di Pan-Lyssavirus per rilevare in modo specifico tutti i Lyssaviruses conosciuti. La validazione utilizzando campioni di cervello di rabbia di diverse specie animali ha mostrato che questo metodo ha una sensibilità e una specificità equivalenti al test anticorpale fluorescente standard oro e potrebbe essere utilizzato per la diagnosi di rabbia di routine.

Valutazione di una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di Lyssaviruses

Qui descriviamo un'immunocattura indiretta del panino ELISA per determinare il contenuto di glicoproteina immunogenica nei vaccini sulla rabbia. Questo test utilizza un anticorpo Monoclonal neutralizzante (mAb-D1) riconoscendo i trimer di lecoproteine. È un'alternativa al test NIH in vivo per seguire la coerenza della potenza del vaccino durante la produzione.

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

Questo RT-PCR in tempo reale utilizzando dsDNA tintura intercalating è adatto per diagnosticare le infezioni da lyssavirus. Il metodo inizia con l'RNA estratto dalla rabbia sospetti campioni ante mortem o post-mortem, dettagliando la preparazione del mix master, l'aggiunta di RNA, l'impostazione della macchina in tempo reale e la corretta interpretazione dei risultati.

Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

L'obiettivo del protocollo è quello di illustrare i diversi saggi relativi all'ingresso virale che possono essere utilizzati per identificare gli inibitori di ingresso virale candidati.

Uso di saggi di ingresso virale e analisi di docking molecolare per l'identificazione di candidati antivirali contro il coxsackievirus A16

Presentiamo un protocollo completo per la diagnosi post-mortem della rabbia animale in condizioni di campo utilizzando un rapido test diagnostico immunocromatico (RIDT), dal campionamento della biopsia cerebrale all'interpretazione finale. Descriviamo anche ulteriori applicazioni utilizzando il dispositivo per l'analisi molecolare e la genotipizzazione virale.

Test diagnostico immunocromatico rapido sulla rabbia sul campo per impostazioni limitate alle risorse con ulteriori applicazioni molecolari

In questo lavoro, descriviamo i protocolli utilizzati nei saggi basati su enzimi replicon e virali per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika in un formato di screening ad alto rendimento.

Saggi antivirali ad alto rendimento per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika

Questo articolo descrive la metodologia per generare particelle pseudotipate di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema di segnalazione luciferasi e il suo impiego per identificare gli inibitori di ingresso. Questi protocolli sono dimostrati utilizzando due diversi inibitori di ingresso, una proteina di fusione umana ACE2-Fc ricombinante e il composto a piccole molecole arbidolo.

Procedure per l'identificazione degli inibitori dell'ingresso del SARS-CoV-2 come potenziali antivirali utilizzando pseudovirus basati su MLV

Scopri come identificare nuovi antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV) utilizzando saggi basati sull'effetto citopatico (CPE), saggi dose-risposta e saggi Time-of-Addition. Questi metodi permettono di valutare l'efficacia antivirale e la citotossicità dei composti selezionati.

Saggi per l'individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

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