In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare il numero di neutrofili che hanno attraversato un monostrato di cellule epiteliali in risposta all'infezione. Ciò si ottiene codificando i pozzetti di collagene prima di coltivare attentamente i monostrati di cellule epiteliali utilizzando la manovra del filtro transwell invertito. In una seconda fase, il patogeno batterico viene coltivato per infettare la superficie apicale del monostrato epiteliale cresciuto sui filtri transwell, inducendo le cellule epiteliali a produrre chemioattrattivi neutrofili endogeni

Successivamente, i neutrofili isolati dal sangue intero vengono aggiunti al lato basolaterale dei monostrati epiteliali infetti cresciuti su filtri transwell per saggiare la migrazione dei neutrofili dal lato basolaterale a quello apicale. Si ottengono risultati che mostrano un aumento significativo del numero di neutrofili transepiteliali migratori osservati in risposta a monostrati epiteliali infetti sulla base della quantificazione della mielo perossidasi dai neutrofili migrati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la manovra del filtro transwell invertito per far crescere e infettare le barriere epiteliali non è convenzionale e quindi può essere meno accessibile per gruppi di ricerca non familiari da stabilire nel loro laboratorio.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie infiammatorie delle vie aeree che coinvolgono infezioni come la polmonite o la fibrosi cistica, perché nuovi trattamenti possono essere sviluppati e testati per ridurre la quantità di migrazione transepiteliale dei neutrofili, che può mitigare gli effetti deleteri di una violazione neutrofila troppo zelante delle barriere mucose. Insieme a Mark, che è un borsista clinico nel mio laboratorio, a dimostrare la procedura saranno il tecnico senior Wahi Preza e il borsista post-dottorato Michael Pesos. Per iniziare, rimuovere un'area di crescita di 0,33 centimetri quadrati, i pozzetti con una dimensione dei pori di tre micrometri dalla confezione e posizionare la piastra da 24 pozzetti contenente 12 pozzetti capovolti all'interno della cappa.

Sollevare la piastra inferiore e metterla da parte. I transwell saranno ora capovolti. Appoggiare sopra il coperchio della fiamma della piastra a 24 pozzetti, un emostatico per la sterilità e lasciare raffreddare.

Utilizzando i pozzetti sterili di trasferimento dell'emostatico in una piastra di Petri da 150 x 25 millimetri, mantenendoli in posizione capovolta, pipettare 70 microlitri di una soluzione di collagene preparata da 30 microgrammi per millilitro in etanolo sulla membrana filtrante di ciascuna superficie del pozzetto rovesciato La tensione dovrebbe mantenere questo volume di soluzione in posizione poiché non ci sono pareti attorno alla membrana del filtro quando si accede alla superficie del lato inferiore. Fare attenzione che la soluzione di collagene non goccioli lungo il lato del pozzetto ed evitare di spostare i pozzetti durante la procedura di rivestimento. Lasciare il coperchio della capsula di Petri per un minimo di quattro ore per consentire all'etanolo di evaporare Per mantenere la sterilità durante questo processo.

Tenere accesa la ventola della cappa e la luce ultravioletta dopo il confezionamento delle cellule epiteliali come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 70 microlitri di soluzione di cellule sospese Resus da un tubo da 15 millilitri a ciascun pozzetto rivestito di collagene invertito. Mescolare la sospensione cellulare capovolgendo delicatamente il tubo periodicamente per evitare che le cellule si depositino sul fondo del tubo da 15 millilitri durante la semina dei pozzetti.

Una volta che tutti i pozzetti invertiti sono stati seminati con cellule epiteliali, riposizionare il coperchio della capsula di Petri e posizionare con cura le cellule nell'incubatore di coltura tissutale il giorno successivo. Aggiungere un millilitro di terreno in ciascun pozzetto della piastra sterile originale a 24 pozzetti e utilizzare un emostatico sterilizzato per capovolgere ogni pozzetto trans invertito in ciascun pozzetto contenente un millilitro di terreno. Aggiungere 0,2 millilitri di terreno nella camera superiore di ciascun pozzetto trans e rimetterlo nell'incubatore per colture tissutali.

Rimuovere dall'incubatore la piastra a 24 pozzetti che supporta gli strati epiteliali che sono stati coltivati sul lato inferiore delle membrane filtranti Transwell per almeno otto giorni. Afferrare il bordo di ogni pozzetto trans con un emostatico e sollevarlo dalla piastra a 24 pozzetti. Capovolgere il transwell su un secchio di scarto per scartare i terreni di coltura dalla camera interna del transwell.

Immergere ogni transwell in un bicchiere di lavaggio contenente la soluzione salina bilanciata di Hank con calcio e magnesio o Hank's Plus per riempire la camera interna del Transwell. Quindi scartare il fluido dalla camera interna in un secchio per i rifiuti. Ripeti questo passaggio per un secondo.

Lavare in Hank's plus dopo due lavaggi. Posizionare i Transwells in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di Hank's Plus. In ogni pozzetto, osservare la camera superiore di ciascun pozzetto per valutare l'integrità dello strato cellulare epiteliale.

Hank's Plus non deve fuoriuscire e riempire la camera superiore del Transwell quando viene posizionato nel pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenente un millilitro di Hank's Plus. Dopo aver osservato attentamente ogni pozzetto, aggiungere 0,2 millilitri di Hanks Plus nella camera superiore. Posizionare la piastra nell'incubatore per 30-60 minuti per equilibrare gli strati di cellule epiteliali ed eseguire il saggio di migrazione transepiteliale dei neutrofili.

Afferrare ogni transwell con un emostatico dalla piastra a 24 pozzetti di Wash Transwells bilanciata in Hank's Plus e gettare il fluido nel pozzetto superiore in un secchio dei rifiuti. Posizionare ogni pozzetto capovolto in una piastra di Petri da 150 x 25 millimetri per sei dei pozzetti invertiti. Aggiungere 25 microlitri di Hanks più tre dei pozzetti invertiti.

Infettare le cellule con 25 microlitri di Pseudomonas, arosa o Pao uno diluito in Hanks plus preparato come descritto nel protocollo di testo fino ai tre finali I transwell invertiti infettano le cellule con 25 microlitri di e Coli, K 12 o mc 1000 diluiti in Hanks Plus preparati anche come descritto nel protocollo di testo dopo aver incubato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in una camera umidificata per 60 minuti. Lavare i pozzetti afferrandoli con un emostatico e capovolgendoli nuovamente in una piastra di lavaggio a 24 pozzetti che contiene un millilitro di Hank's plus. Nelle camere inferiori.

Aggiungi 0,2 millilitri di Hank's plus alle camere superiori. Afferrare il Transwell con un emostatico e rimuoverlo dalla prima piastra di lavaggio. Gettare il fluido dalla camera superiore in un secchio per i rifiuti.

Prima di posizionare i Transwells in una seconda piastra di lavaggio a 24 pozzetti contenente un millilitro di Hanks plus, aggiungere 0,2 millilitri di Hanks plus alla camera superiore. Ripetere questo passaggio ancora una volta per un totale di tre lavaggi. Dopo il terzo lavaggio, scartare il fluido dalle camere superiori dei pozzetti trans in un secchio di scarto utilizzando un emostatico. Posizionare tre dei pozzetti trans non infetti in tre pozzetti della piastra di migrazione a 24 pozzetti contenente un millilitro di Hanks Plus, che rappresenta la pipetta di controllo negativo 10 microlitri di una soluzione da 10 micromolari di FMLP in ciascuno dei tre pozzetti della piastra di migrazione a 24 pozzetti contenente un millilitro di Hanks inoltre posizionare tre dei pozzetti trans non infetti in tre pozzetti della piastra di migrazione a 24 pozzetti contenente 100 FMLP nanomolari, che rappresenta un controllo positivo per la capacità dei neutrofili isolati di migrare.

Quindi posizionare i tre pozzetti trans infettati con PAO 1 e i tre pozzetti trans infettati con mc 1000 in tre pozzetti corrispondenti della piastra di migrazione a 24 pozzetti contenente un millilitro di Hanks più aggiungere 0,1 millilitri di Hanks plus alla camera superiore di ogni pozzetto trans sopra gli 0,1 millilitri di Hanks plus in ogni trans. Aggiungere con attenzione 20 microlitri della sospensione di neutrofili preparata come descritto nel protocollo di testo. Incubare per due ore per consentire la migrazione transepiteliale dei neutrofili.

Dopo due ore di migrazione, sollevare i pozzetti afferrandoli con un emostatico e picchiettare delicatamente contro le pareti interne della piastra di migrazione a 24 pozzetti. Prima di scartare i pozzetti trans, valutare la migrazione dei neutrofili grossolanamente nei pozzetti osservando i pozzetti della piastra di migrazione a 24 pozzetti sotto un microscopio invertito utilizzando l'obiettivo 10 x. Quindi aggiungere 50 microlitri di Triton X 100 al 10% a ciascun pozzetto utilizzato nella piastra di migrazione a 24 pozzetti, in ogni standard e nel bianco.

Ruotare gli standard della piastra di migrazione a 24 pozzetti e vuotare a bassa velocità per 20 minuti. A quattro gradi Celsius. Aggiungere 50 microlitri di tampone citrato.

Due pozzetti ciascuno utilizzato nella piastra di migrazione a 24 pozzetti per ogni standard e per il bianco completamente. Mescolare bene il contenuto di ciascun campione pipettando la soluzione su e giù almeno cinque volte. Quindi trasferire 100 microlitri di ciascun pozzetto del campione in duplicato in un trasferimento su piastra a 96 pozzetti, 100 microlitri di ogni standard e il bianco sulla piastra a 96 pozzetti.

Dopo la miscelazione, aggiungere 50 microlitri di perossido di idrogeno al 30% alla soluzione A BTS e vortex. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato BTS A a ciascun campione. Sulla piastra a 96 pozzetti, lasciare che la piastra si sviluppi per cinque-10 minuti al buio.

Osservare lo sviluppo del colore verde nei pozzetti della piastra contenente neutrofili di lisi prima di leggere a una lunghezza d'onda di 405 nanometri. Utilizzando un lettore di micropiastre per valutare la migrazione transepiteliale dei neutrofili, i neutrofili che sono migrati completamente attraverso lo strato epiteliale fino alla camera apicale possono essere visualizzati nel pozzetto inferiore della piastra di migrazione a 24 pozzetti, come visualizzato qui utilizzando un microscopio a luce invertita. Pochissimi neutrofili sono stati osservati migrare attraverso uno strato epiteliale non infetto senza gradiente chemiotattico imposto e rappresentano i livelli di fondo nel test.

Al contrario, un'abbondanza di neutrofili transmi era evidente quando è stato fornito un gradiente FMLP. L'infezione dell'epitelio con E coli mc 1000 non patogeno ha provocato pochi neutrofili transmigrati visibili, mentre molti neutrofili transmigrati erano osservabili quando gli strati epiteliali sono stati infettati con lo pseudomonas aerogen patogeno polmonare. I neutrofili che sono migrati nell'esperimento sono quantificati misurando la loro attività della mielo perossidasi.

Il numero di neutrofili correla positivamente con la quantità di attività della perossidasi misurata dopo la lisi dei neutrofili con valori che mostrano una relazione lineare nell'intervallo del numero di neutrofili selezionato per la curva standard. Un numero significativo di neutrofili migra attraverso gli strati epiteliali in risposta al gradiente FMLP fornito da A o in risposta a uno strato epiteliale infettato da PAO uno. Il numero di neutrofili che migrano in assenza di stimoli o a seguito di infezione epiteliale apicale con e coli mc 1000 non patogeno è inferiore al limite di rilevabilità per il test.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore per il rivestimento di collagene e la semina delle cellule epiteliali sui filtri transwell, seguita da almeno una settimana per consentire alle cellule epiteliali di crescere. Una volta che i monostrati epiteliali sono pronti. Il saggio di migrazione può essere eseguito in cinque ore, compreso l'isolamento dei neutrofili e la preparazione dei batteri, se eseguito correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare i filtri transwell in condizioni sterili per evitare contaminazioni. Questa procedura può essere adattata per rispondere a ulteriori domande relative a questo processo infiammatorio. È possibile eseguire l'analisi delle cellule migrate, dell'epitelio, del supino o persino dell'agente patogeno.