Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di seguire lo sviluppo dei denti per diversi giorni. La coltura explan in vitro si ottiene sezionando la mandibola in via di sviluppo di topi fetali in fette vive per esporre i germi dei denti in via di sviluppo come secondo passo. Le fette vengono selezionate, poste su filtri su un terreno di coltura e incubate per consentirne lo sviluppo.

Le fette successive vengono etichettate con un tracciante di linea per tracciare il movimento cellulare durante il periodo di coltura, si ottengono risultati che mostrano la natura dinamica dei tessuti dentali mentre si sviluppano durante la coltura explan. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla coltura di espiantazione convenzionale è che gli organi in via di sviluppo interno, come le gemme dei denti, possono essere osservati durante il loro sviluppo nel contesto del tessuto circostante. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di taglio e selezione possono essere difficili se l'impostazione della macchina o l'orientamento del tessuto sono imprecisi.

Innanzitutto, preparare il terreno di dissezione e coltura per gli organi embrionali aggiungendo l'1% di glutammato e l'1% di penicillina streptomicina a 500 millilitri di terreno eagle F 12 modificato con ECCO avanzato. Quindi, come descritto nell'articolo video di Takahashi Sumi, sezionare gli embrioni di topi tra gli stadi E 11.5 ed E 15.5 e metterli in una capsula di Petri contenente terreno fresco. Successivamente, decapitare gli embrioni utilizzando un ago di tungsteno sterile appena affilato e trasferire le teste in un piatto fresco di terreno pre-raffreddato su ghiaccio.

Quindi isolare le mandibole dalle teste inserendo un ago nella cavità orale e tagliando temporaneamente verso la parte posteriore della testa. Conservare le mandibole isolate in un terreno pre-raffreddato su ghiaccio prima di essere sezionate. Prima di affettare il tessuto mandibolare, pulire il disco di montaggio e la lama del tritatutto con etanolo al 70% e assicurarsi che la lama sia a filo con il disco di montaggio.

Quando cade, la lama dovrà essere sostituita dopo aver affettato circa 200 mandibole, impostare la distanza di taglio tra 200 e 400 micrometri in base all'età del campione e, a seconda che sia necessario l'intero germe del dente per un embrione E 14,5 in cui è richiesto l'isolamento del germe del dente, viene utilizzata una distanza di taglio di 250 micrometri. Quindi, trasferisci una mandibola sul disco di montaggio in plastica e disponila in modo che la lingua in via di sviluppo sia in orientamento trasversale frontale. Quando si sezionano i molari per isolare gli incisivi, prelevare delle fette sagittali attraverso la mandibola.

Una volta orientato correttamente, rimuovere il mezzo in eccesso intorno al tessuto. Utilizzando la carta da filtro, questo guiderà leggermente una mandibola fissandola in posizione sul disco di montaggio. Subito dopo l'essiccazione con la carta da filtro, posizionare il disco sul tavolo circolare in acciaio inox del tritatutto.

Quindi impostare la forza della lama al massimo, accendere la macchina e premere start. La tavola si sposta automaticamente da sinistra a destra, mentre allo stesso tempo il braccio di taglio che porta la lama viene sollevato e abbassato fino a 200 colpi al minuto. Una volta che il fazzoletto è stato completamente affettato, spegnere la macchina.

Assicurarsi che il braccio della lama sia in posizione sollevata, quindi rimuovere il disco. Assicurarsi di non mettere le dita sotto il braccio della lama o di lasciare la macchina incustodita. Quando si trita il fazzoletto, prendere il disco di montaggio e aggiungere immediatamente del terreno alle fette sul disco per evitare un'eccessiva essiccazione.

Quindi rimuovere con cura il tessuto a fette dal fondo del disco usando un ago di tungsteno o una pipetta e pipettarli in una piccola capsula di Petri di terreno. Quindi, separare le singole fette utilizzando un ago e quindi selezionare le fette di tessuto contenenti l'area di interesse sotto uno stereomicroscopio. Posizionare le fette selezionate in piatti di coltura con fresco, medio, preparare griglie metalliche per il sistema di coltura tagliando strisce, che misurano quattro centimetri per 1,5 centimetri da fogli di acciaio inossidabile a trama semplice.

Quindi praticare un foro al centro utilizzando un perforatore fisso standard e piegare i lati in modo che la griglia si adatti perfettamente al pozzetto centrale e si trovi parallela al fondo del piatto. Una volta che le griglie sono sagomate correttamente, sterilizzarle in autoclave prima dell'uso. Successivamente, preparare i piatti di coltura dell'organo del pozzo centrale per la coltura aggiungendo due millilitri di acqua dell'autoclave al pozzetto esterno per prevenire la disidratazione.

Quindi posizionare una griglia metallica sterile al centro del piatto. Tagliare un pezzo di membrana trasparente in polietilene tereftalato con una dimensione dei pori di 0,4 micrometri in modo che sia abbastanza grande da coprire il foro nella griglia. Quindi posizionare la membrana tagliata nel piatto con una fetta di mandibola selezionata se si desidera tracciare il lignaggio.

Per prima cosa preparare un ago capillare di vetro disegnando il vetro con un estrattore di aghi. Quindi rompere la punta dell'ago e posizionarla con la punta verso il basso in una soluzione colorante lipofila come dai eye o dai o, e aspirare parte della soluzione colorante per azione capillare. Dopo alcuni minuti, posizionare l'ago riempito in un supporto e collegarlo a un aspiratore a bocca.

Posizionare la punta dell'ago nel terreno di coltura in modo che tocchi l'area da etichettare, come il follicolo dentale mostrato qui. Quindi spostare una piccola quantità di colorante sul tessuto. Quindi, trasferire la fetta su un tavolino da microscopio fluorescente e verificare che la fetta sia etichettata correttamente.

Una volta etichettata con successo, sollevare con cura la fetta sopra la membrana e quindi trasferire la membrana fuori dal terreno con la fetta appiattita al centro. Quindi posizionare il filtro sul foro circolare al centro della griglia a circa un millilitro di terreno di coltura fino al pozzetto fino a quando il livello del terreno non è al livello della membrana. A questo punto, aggiungi eventuali proteine o inibitori di piccole molecole nel terreno.

Inoltre, visualizza la fetta per una registrazione della morfologia al giorno zero utilizzando un microscopio da dissezione per la migliore fotografia, visualizza le fette con una fonte di luce da sotto. Mantenere le stoviglie in un'atmosfera umidificata del 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius e cambiare il supporto ogni due o tre giorni a intervalli regolari. Continuare a visualizzare le impostazioni cultura per tenere traccia dei progressi.

Qui è mostrata una serie di immagini che documentano lo sviluppo del primo follicolo dentale molare, che è etichettato con colorante fluorescente per gli occhi. La fetta è una fetta frontale spessa 250 micron sezionata dalla mandibola di un topo a E 14,5. Il dente, che è delineato con punti neri, inizia nella fase del cappuccio al giorno zero.

Entro il quarto giorno, il germe del dente ha raggiunto lo stadio di campana e le cellule del follicolo dentale si vedono diffondersi in un arco attorno allo smalto esterno in via di sviluppo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore dall'embrione alla coltura finale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare con successo lo sviluppo degli organi in coltura.