Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire un modello murino sperimentale che possa essere utilizzato per studiare le ramificazioni dell'infezione concomitante con tubercolosi e malaria in vivo. Ciò si ottiene prima esponendo gli animali da esperimento a em. Tubercolosi contenente goccioline di aerosol infettive utilizzando un sistema di esposizione per inalazione.

Nella seconda fase, l'assorbimento del numero desiderato di M tuberculosis viene verificato mediante analisi CFU del tessuto polmonare. Un giorno dopo l'infezione da aerosol, 40 giorni dopo, i topi sono esposti a zanzare infettive per la trasmissione naturale di plasmodium sporozoiti, che si depositano sotto l'intera pelle durante il pasto di sangue. Nella fase finale, lo sviluppo del parassita dello stadio del sangue malarico viene monitorato mediante l'analisi delle macchie di giemsa, strisci di sangue.

In definitiva, il carico di tubercolosi nel polmone e il numero di parassiti nel sangue degli animali coinfetti possono essere enumerati per determinare il decorso della tubercolosi e della malaria, rispettivamente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tubercolosi, della coinfezione della malaria, come ad esempio in che modo la coinfezione con il parassita della malaria influenza la patogenesi e il controllo dell'infezione da mycobacterium tuberculosis? Questo protocollo è stato sviluppato per studiare come la coinfezione con odium buri influisca sulla fase cronica della tubercolosi microbica, un C 57 PL immunocompetente sei topi.

Può anche essere applicato ad altri ceppi di topi, compresi i topi knockout, o utilizzato con altre specie di micobatteri o odi. Inizia riscaldando il mycobacterium tuberculosis. Stock di un titolo CFU noto.

Quando le cellule si sono scongelate, utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27 per mescolare accuratamente la sospensione cinque volte per disperdere i grumi batterici, evitando la produzione di aerosol, a seconda della dose di infezione desiderata trasferire il volume richiesto del ceppo micobatterico in una provetta da 50 millilitri contenente PBS sterile fino a un volume finale di sei millilitri. Quindi, posiziona gli animali da esperimento singolarmente in cestini a rete a scomparti. Posizionare i cestelli nella camera aerosol circolare e chiudere il coperchio della camera.

Fissare l'unità nebulizzatore Venturi ai tre giunti a bicchiere in acciaio inossidabile. Aspirare la sospensione micobatterica in una siringa da 10 millilitri, dotata di un ago smussato calibro 18 e trasportare la siringa nella camera dell'aerosol in una scatola di trasporto chiusa. Ora rimuovi il tappo a vite del nebulizzatore e inietta con cura la sospensione di micobatteri nell'unità.

Facendo attenzione ad evitare la generazione di aerosol. Gettare la siringa in un contenitore per oggetti taglienti contenente il 2% di Burton, quindi sigillare il nebulizzatore. Azionare l'apparecchio per inalazione al termine del ciclo.

Verificare che la sospensione di micobatteri sia stata completamente nebulizzata prima di aprire la camera di aerosol. Indossare un casco respiratorio per la purificazione dell'aria, quindi riportare gli animali nelle loro gabbie, sterilizzare i cestelli del nebulizzatore e l'interno della camera di aerosol un giorno dopo l'infezione da aerosol, posizionare gli animali di controllo soppressi designati su carta assorbente su una tavola da dissezione in una cabina di biosicurezza di classe due e disinfettare i topi con il 70% di etanolo per ogni topo. Per prima cosa, fai una piccola incisione al centro dell'addome e poi ritrai la pelle sopra la testa dell'animale.

Successivamente, usa le forbici chirurgiche per aprire l'addome e la gabbia toracica. Rimuovere la parete toracica in modo che i polmoni siano accessibili, quindi rimuoverli. Trasferire i polmoni in una provetta da 15 millilitri con due millilitri di tampone di omogeneizzazione, quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da cinque millilitri per filtrare il tessuto attraverso setacci da 100 micrometri in una piccola capsula di Petri.

Utilizzando una pipetta da un millilitro dotata di punta barriera, sciacquare più volte il setaccio e quindi distribuire circa 250 microlitri di omogeneizzato polmonare su otto piastre di agar. Utilizzare spandiconcime monouso per impiattare accuratamente i campioni quando le piastre sono asciutte. Sigillare ogni piastra con perfil.

Avvolgeteli in un foglio di alluminio e incubateli in posizione verticale a 37 gradi Celsius per almeno quattro settimane. Per infettare topi naïve o infetti da micobatterio con la malaria con punture di zanzara, posizionare gli animali anestetizzati sulla rete delle gabbie per zanzare, consentendo alle zanzare infettive di nutrirsi attraverso la membrana per garantire il successo della trasmissione degli sporozoiti. Lascia i topi sulle gabbie per 10-15 minuti.

Trasferisci i topi nelle loro gabbie su un tovagliolo di carta e coprili con un tovagliolo di carta per tenerli al caldo fino a quando non si svegliano dall'anestesia. Uccidi le zanzare spruzzandole con etanolo al 70% o altri disinfettanti attraverso la rete della gabbia e sterilizza le gabbie in autoclave. Per monitorare il para, usa un ago per perforare l'estremità della vena di ogni animale infetto e raccogliere una goccia di sangue.

A ciascuna estremità di un vetrino, usa un altro vetrino per estrarre una goccia di sangue oltre la metà della lunghezza del vetrino inferiore. Quindi capovolgere il vetrino di allargamento e utilizzare l'altro bordo per la seconda sbavatura. Posizionare i vetrini in uno scaffale per colorare.

Fissare brevemente gli strisci di sangue in metanolo assoluto e poi asciugare all'aria. Le diapositive successive, immergere le sbavature in Giza. Dopo 10 minuti, immergere i vetrini dentro e fuori dalle vene di colorazione riempite con acqua deionizzata alcune volte per sciacquare via la macchia in eccesso.

Infine, asciugare all'aria le diapositive in posizione verticale. L'infezione indotta da sporozoiti di animali da esperimento da punture di zanzara provoca un tasso di infezione del 100%, come confermato dalla presenza di parassiti allo stadio sanguigno quattro o cinque giorni dopo. Come illustrato nella tabella, l'infezione di topi con Plasmodium buri da puntura di zanzara, sia di topi naïve che di tubercolosi m-tubercolosi, provoca l'infezione coerente e riproducibile di tutti gli animali all'interno di un gruppo sperimentale.

Confrontando i topi di controllo pre-pervietà e naïve con quelli e gli animali co-infetti da Mycobacterium tuberculosis, si può osservare che la pre-pervietà è leggermente ritardata. Nei topi che sono stati pre-infettati da Mycobacterium tuberculosis in dei topi con Mycobacterium tuberculosis mediante l'uso di un sistema di esposizione per inalazione, si verifica la deposizione di batteri nei polmoni dell'animale con una variabilità relativamente bassa tra i singoli topi. Le cariche micobatteriche nei polmoni dei topi neri infetti C 57 sono aumentate in presenza di p burga.

Al contrario, i topi co-infetti hanno una para emia ridotta rispetto ai topi con singolo inetto di plasmodio. Seguendo questa procedura, metodi come la citometria a flusso, la PCR, Eliza o tecniche istologiche possono essere eseguiti sui tessuti o sui fluidi corporei di interesse per sezionare le risposte immunitarie suscitate simultaneamente contro i parassiti maligni e le basi tubercolari e le loro interazioni nell'ospite co-infetto. Non dimenticare che lavorare con il microbatterio patogeno umano tuberculosis può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare misure per evitare l'esposizione ad aerosol infettivi in ogni momento.

Tutti i lavori sperimentali che coinvolgono il microbatterio tubercolosi devono essere svolti in strutture adeguate di livello tre di biosicurezza.