Name: Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Scopri come salvare il virus della malattia di Newcastle ricombinante da cDNA utilizzando cellule mammifere, plasmidi e uova embrionate. Questo metodo avanzato facilita lo sviluppo di vettori virali per vaccini e terapie innovative.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti nei laboratori di Drs. Peter Palese e Adolfo García-Sastre per lo sviluppo di NDV invertire tecniche di genetica e per l&#39;assistenza tecnica. La ricerca in virus della malattia di Newcastle in laboratorio AG-S è parzialmente finanziato dalla NIAD concedere R01AI088770 e dal Dipartimento di Centro di Eccellenza per la Sicurezza Nazionale Scienza e Tecnologia per emergenti e malattie zoonotiche animali (CEEZAD, numero award 2010-ST-061-AG001). La ricerca in laboratorio LM-S è finanziato da sovvenzioni NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, i Centri NIAID di eccellenza per la ricerca e l&#39;Influenza Surveillance (HHSN266200700008C), e l&#39;Università di Rochester Centro per Biodefense immunitario Modeling (HHSN272201000055C) .

1. Preparazione di cellule di mammifero (Figura 4A, 1 ª giornata) Split HEp-2 o cellule A549 il giorno prima della trasfezione in piastre da 6 pozzetti. Densità delle cellule dovrebbe raggiungere il 80-90% di confluenza il giorno seguente. Di solito, un confluente 100 millimetri piatto può essere suddiviso in 8 pozzetti (circa 1 x 10 6 cellule per pozzetto). Per ogni virus di essere recuperata, 2-4 diversi pozzetti devono essere incluse, nonché 2 pozzetti supplementari per i controlli pCAGGS-GFP e pCITE-GFP 18, volti a monitorare trasfezione e MVA-T7 efficienza di infezione, rispettivamente. 2. L&#39;infezione di cellule di mammifero con il virus del vaiolo vaccino ricombinante Modified Ankara Esprimendo il batteriofago T7 RNA polimerasi (MVA-T7) (Figura 4A, 2 ª giornata) <ol><li> Warm up PBS 1x/BA/PS e dei media a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS 1x/BA/PS. </li><li> Infettare le cellule di mammifero coltivate con il virus MVA-T7 ad una molteplicità di infezione (moi) Di 1 pfu / cellule in un volume finale di 200 microlitri di PBS / BA / PS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Durante l&#39;infezione virale incubazione, preparare la miscela di trasfezione come descritto in 3. </li></ol> 3. Trasfezione di cellule di mammifero (Figura 4A, 2 ª giornata) <ol><li> Preparazione del Lipofectamine: Mescolare 1-2 mg di LPF2000 con 250 ml di OptiMEM per tentativo di salvataggio e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparazione del DNA: Fare un cocktail plasmide per ogni salvataggio in 50 ml di OptiMEM. Aggiungere 0,4 pg di pTM1-NP, 0,2 mg di pTM1-P, e 0,2 mg di pTM1-L per provetta. Aggiungere 1 mg del full-length cDNA clone di NDV essere salvato ad ogni provetta. Anche preparare due transfezioni di controllo, una con 2 mg di pCAGGS-GFP (per verificare l&#39;efficienza di trasfezione) e l&#39;altra con 2 mg di pCITE-GFP (per controllare T7 polimerasi guidato espressione del MVA-T7). </li><li> Dopo che la soluzione LPF2000-OptiMEM è stato preincubato per 5 min (passo 3.1), aggiungere 250microlitri della soluzione ai tubi DNA (passo 3.2) e incubare per 20-30 min a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con MVA-T7, rimuovere l&#39;inoculo del virus mediante aspirazione e sostituire con la miscela di trasfezione di DNA-LPF2000 (passo 3.3). </li><li> Aggiungere 1 ml di DMEM 10% FBS / PS per ogni piatto. </li><li> Incubare le cellule infette / transfettate per 6-8 ore (o tutta la notte) a 37 ° C, 5% CO 2 e quindi sostituire il supporto trasfezione con 1,5 ml di DMEM fresco 10% FBS / PS. </li><li> A 24 ore dopo la trasfezione, pozzetti di controllo possono essere osservati sotto un microscopio a fluorescenza per valutare l&#39;efficienza di trasfezione (pCAGGS-GFP) e l&#39;attività della polimerasi T7 (pCITE-GFP) (Figura 5A). Procedere con la co-coltura delle cellule infette / trasfettate con fibroblasti aviaria come descritto di seguito. </li></ol> 4. Co-coltura di cellule di mammifero con le cellule aviaria (Figura 4A, 3 ª giornata) Di solito, un confluente 100 millimetri di tessuto cultura piatto di pollo (CEFS) or duck (defs) fibroblasti di embrione viene utilizzato per due pozzi transfettate. Assicurati di preparare, in anticipo, abbastanza 100 millimetri di coltura tissutale piatti a base di cellule aviarie per tutti i tentativi di salvataggio. Per salvataggio efficiente del virus, DMEM 10% FBS / PS supporto è completato con 5% di liquido allantoidea 30 mM MgCl 2. A questo punto, 24 hr pi, cellule di mammifero possono iniziare a mostrare effetto citopatico (CPE) a causa di infezione MVA-T7, asevident in figura 5A. <ol><li> Warm up 1x PBS e media a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule di mammifero, 2x, con 1 ml di PBS 1x. </li><li> Trypsinize cellule di mammifero con 0,2 ml di EDTA-tripsina fino a quando non indipendente. Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM 10% FBS / PS, 5% fluido allantoideo, 30 mM MgCl 2 e trasferimento in un piatto di coltura tissutale a 100 mm. Aggiungere 3 ml dello stesso supporto. </li><li> Lavare le cellule aviaria, due volte, con 4 ml di PBS 1x. </li><li> Trypsinize cellule aviarie con 1 ml di EDTA-tripsina e incubare per 1-2 minuti a 37 ° C finché le cellule si staccano. Risospendere thcelle e aggiungendo 8 ml di DMEM 10% FBS / PS, 5% fluido allantoideo, 30 mM MgCl 2 e aggiungere 4 ml delle cellule trypsinized alle cellule di mammifero in 100 mm al piatto di coltura tissutale co-coltura per un volume totale di 8 ml (4 ml di mammifero, 4 ml cellule aviarie). </li><li> Agitare delicatamente a mano le cellule co-coltivate nel piatto a 100 mm in modo da avere una distribuzione uniforme e poi metterli in incubatore a 37 ° C per 3-4 giorni. I criteri per infettare uova 3 o 4 giorni dopo co-coltura di cellule di mammifero e aviarie dipende dalla quantità di effetto citopatico (arrotondamento cella, morte, distacco dalla superficie, ecc.) Si osserva nella infezione virale MVA-T7. </li></ol> 5. L&#39;infezione di uova embrionate di pollo (4A, Giorni 6-7) <ol><li> Dopo 3-4 giorni di co-coltura di cellule di mammifero e aviaria, rimuovere 1 ml del supernatante di coltura tissutale e aggiungere in una provetta Eppendorf. </li><li> Centrifugare il surnatante di coltura tissutale per 1 min a 12.000 rpm in un bancocentrifuga per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Candela le uova utilizzando una scatola speratura luce per vedere l&#39;interfaccia tra la sacca d&#39;aria e la cavità allantoidea. Fare un segno sul confine interfaccia evitando la localizzazione dei vasi sanguigni. Spray etanolo al 70% sopra le uova per stabilire condizioni sterili. Fare delicatamente un foro nel guscio sul punto marcato e inoculare 500 ml di supernatante utilizzando un insulina (1 ml) siringa, puntando l&#39;ago verticalmente e direttamente nella cavità allantoica. (Figura 4B). </li><li> Sigillare il nick in guscio d&#39;uovo con cera fusa o paraffina. </li><li> Incubare le uova per 2-3 giorni a 37 ° C. </li></ol> 6. Raccolta di liquido allantoico da Infected uova embrionate di pollo (4A, giorni 8-10) <ol><li> Incubare le uova infette per 2-4 ore o tutta la notte a 4 ° C, al fine di uccidere l&#39;embrione di pollo e coagulare il sangue. </li><li> Spruzzare le uova con il 70% di etanolo (per mantenere condizioni di sterilità). </li><li> Toccare attentamente la sezione apicale dell&#39;uovo, sopra la cavità d&#39;aria, con un cucchiaio. Una volta che il guscio è incrinato, rimuovere i frammenti con una pinza e pienamente esporre la membrana allantoidea. </li><li> Esporre la cavità allantoica da asportare la membrana allantoico con le pinze e forbici, evitando di danneggiare i vasi sanguigni e il tuorlo. </li><li> Spingere delicatamente verso il basso l&#39;embrione con una spatola e raccogliere il liquido allantoico upflowing (8-12 ml per uovo) con una pipetta 10 ml. Evitare di danneggiare la membrana tuorlo. Trasferire il liquido allantoico ad un tubo da centrifuga da 15 ml sul ghiaccio (utilizzare un tubo per uovo). </li><li> Chiarire il liquido allantoico mediante centrifugazione per 5 min a 1.500 giri. Trasferire il surnatante in una nuova provetta senza disturbare il pellet. </li><li> Conservare i campioni a 4 ° C per un massimo di 1 settimana, fino a quando non controllando la presenza di NDV mediante test di emoagglutinazione. </li></ol> 7. Emoagglutinazione (HA) Assay La presenza del virus nel allantfluido OIC da uova infette può essere determinata macroscopicamente dalla loro capacità di hemagglutinate tacchino globuli rossi (RBC). Nel caso di NDV, circa 10 6 unità formanti placca (pfu) per ml è richiesto di dare un segnale positivo nel saggio HA. Saggi HA sono effettuate in piastre da 96 pozzetti V-bottom. Negativo (PBS 1x, liquido allantoico infetto), così come positivo (liquido allantoico da qualsiasi virus NDV) campioni di controllo devono essere sempre inclusi in qualsiasi dosaggio HA per convalidarlo. Per eseguire un saggio HA: <ol><li> Pipettare 50 ml di PBS 1x per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti V-bottom. </li><li> Pipettare 50 ml di allantoici campioni di liquido nei pozzetti sulla prima colonna della piastra. Effettuare diluizioni seriali di 2 volte per il resto del piatto ed eliminare l&#39;ultimo, extra 50 microlitri dai pozzi nell&#39;ultima colonna. </li><li> Dispensare 50 ml di 0,5% tacchino RBC in PBS 1x per bene. Agitare delicatamente la piastra toccando. </li><li> Incubare la piastra a 4 ° C (o ghiaccio) fo 30-45 minuti o fino a quando un pellet chiaro si forma nei pozzetti di controllo negativi. </li></ol>

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</ol>

Adolfo García-Sastre è un inventore di brevetti sul virus della malattia di Newcastle ricombinanti che sono di proprietà della Scuola di Medicina di Icahn al Monte Sinai.

Diversi fattori devono essere considerati per ottenere buoni risultati, mentre il salvataggio NDV. In primo luogo, il costrutto intera lunghezza cDNA da utilizzare deve essere progettato per consentire l&#39;integrazione funzionale dei nuovi transgeni / modifiche nel genoma NDV. Ciò significa, come detto sopra, che le sequenze (i) end appropriato gene (GE), intergenica (IG) e inizio gene (GS) devono essere aggiunti, se necessario, (ii) non vi sono sequenze putative GE o GS nel estera gene, e (iii) il genoma ricombinante...

Virus della malattia di Newcastle (NDV), un paramyxovirus aviario appartenente al genere Avulavirus 1, è un agente di zoonosi economicamente rilevante e quindi ampiamente studiato e sorvegliato, che può influenzare fortemente l&#39;allevamento di pollame in tutto il mondo. Pur non essendo un agente patogeno umano, NDV è stato anche studiato a fondo al di là del campo veterinario sia come modello paramyxovirus e grazie alle sue molto interessanti, proprietà naturali oncolitici 6. Ricerca su NDV notevolmente beneficiato lo sviluppo di tecniche di genetica inversa per, non segmentati virus a singolo filamento di RNA negativo-senso, in primo luogo descritti per virus della rabbia da Conzelmann e coleagues 2. Una varietà di NDVs geneticamente modificati, portatori di geni estranei o modifiche del loro tipo selvatico genoma sono stati ampiamente studiati da allora. Lavorare con questi virus ricombinanti è stato fondamentale per individuare i diversi fattori di virulenza non solo di NDV, ma anche di altri huma pertinenten agenti patogeni come virus dell&#39;influenza A 7 - o l&#39;emergente Nipah virus 8. Inoltre, diversi studi hanno esplorato l&#39;uso di queste tecniche per migliorare l&#39;attività antitumorale innata NDV 6,9,10, soprattutto migliorando le proprietà immunostimolanti del virus. Altro settore di ricerca sulla NDVs ricombinanti è stata la generazione di candidati vaccini contro altre malattie virali come l&#39;influenza 5,11,12, 13 HIV, morbillo 14, SARS 15, o che ha causato dal virus sincytial respiratorio (RSV) 16. Tra i vari notevoli vantaggi forniti dal NDV sono la mancanza di immunità preesistente nella popolazione umana, la stabilità degli inserti estere genetiche, una mancanza di attività recombinatory e nel complesso un elevato profilo di sicurezza combinato con le suddette proprietà immunostimolanti naturali 17. E &#39;inoltre degno di nota il potenziale uso di vaccini bivalenti ricombinanti in poultry, l&#39;influenza aviaria di protezione contro sia NDV e altamente patogeno virus 11,12. Questo può essere un ottimo modo per diminuire le probabilità di quest&#39;ultimo diffusione da selvatici animali domestici, quindi anche aiutando a prevenire un eventuale salto inter-specifica della temuta influenza aviaria agli esseri umani. Infine, sono stati utilizzati reporter esprimere NDV per la valutazione della risposta immunitaria innata come pure l&#39;identificazione di interferone antagonista codificata dal virus multipli 18-27. Il processo di salvataggio di un ricombinante, non segmentato, virus RNA negativo filamento costituito essenzialmente da forzare artificialmente un ciclo di replicazione virale in una cellula che produce trasfettando cDNA codificanti il macchinario molecolare minimo infettiva, noto come ribonucleoproteina o RNP (Figura 2). Le RNP consistono polimerasi virale (P e proteine ​​L), la nucleoproteina (NP) e l&#39;intera lunghezza antigenomic RNA del virus. Questo RNA + antigenome è ªe modello richiesto per la generazione dei genomi RNA complementari, che, associati anche con il resto delle proteine ​​della RNP virale, ricapitola stesso complesso infettiva che un virus naturale libererebbe il citoplasma della cellula dopo l&#39;infezione (Figura 2A ). Da questo punto in poi, il ciclo virale può procedere in modo naturale e virioni ricombinanti, encapsidating i genomi modificati, verrà generato (Figura 2B). Sorprendentemente, trasfezione del cDNA genomico invece del cDNA antigenomic compromette notevolmente o abolisce efficienza salvataggio 2,28-30 completamente. Anche quando cDNA antigenomic viene trasfettato, l&#39;efficienza del incapsidamento del RNA ricombinante in RNPs in cellule trasfettate è probabilmente molto bassa. A causa di questo, protocolli di salvataggio per NDV spesso includono diversi passaggi per l&#39;amplificazione delle particelle virali pochi rilasciate dalle cellule trasfettate originariamente da essi coculturing con cellule permissive e / o dalinfezione di uova embrionate. Prima del salvataggio, il cDNA può essere manipolato da procedure di clonazione standard per generare le modifiche desiderate. Mentre mutazioni specifiche dei diversi prodotti genici e sequenze regolatrici del virus possono essere direttamente raggiunti in questo modo, molti dei lavori pubblicati coinvolge ricombinante NDV ha richiesto l&#39;aggiunta di una nuova unità trascrizionale nel genoma NDV. Come altri membri della famiglia paramyxovirus, il genoma NDV codifica otto proteine ​​differenti in sei unità trascrizionali, che sono differenzialmente espressi in funzione della loro posizione rispetto alla estremità 3 &#39;in un gradiente critico per il ciclo di vita virale 1 discendente. A causa di questo, la posizione della nuova unità trascrizionale all&#39;interno del genoma va scelto opportunamente per raggiungere un equilibrio tra l&#39;espressione del transgene e compromissione della replicazione virale. Inserimento tra P e M geni è stato usato più, tHough altri siti sono stati anche testati 13,31. Qualunque sia l&#39;inserto, la clonazione in NDV cDNA deve seguire alcune regole per generare un costrutto salvabile: (i) qualsiasi nuovo gene da inserire nel genoma NDV deve essere sotto il controllo dei segnali appropriati per il virale RNA-dipendente-RNA polimerasi. Queste sequenze devono essere aggiunti a monte della nuova fase di lettura aperta (ORF) per la polimerasi possono riconoscere la fine del gene precedente (GE) e l&#39;inizio del nuovo transgene (GS), distanziati di un singolo nucleotide sequenza intergenica (IG) . Aggiunta di un valido Kozak (K) sequenza di migliorare traduzione eucariotico ribosomiale è consigliato anche per una migliore espressione proteina estranea 32; (ii) replica efficiente di NDV, come per la maggior parte dei membri della famiglia Paramyxoviridae, dipende dalla lunghezza del genoma essere multiplo di sei 33, pertanto, qualsiasi inserimento nella NDV deve seguire questa &quot;regola del sei&quot;. Se necessario, required nucleotidi possono essere aggiunti a valle della nuova ORF, e (iii) la sequenza del transgene dovrebbe essere controllata per trovare possibili GE e GS come sequenze che potrebbero compromettere l&#39;efficienza di salvataggio, l&#39;espressione del transgene e / o vitalità del virus. Se presente, queste sequenze devono essere rimossi mediante mutagenesi silenzioso. La generazione di cDNA ricombinante piena lunghezza seguenti norme suddette è il primo passo per produrre efficientemente un NDV geneticamente modificato come qui descritto. Nel sistema tutti i costrutti di DNA sono sotto il controllo del promotore T7 RNA polimerasi (Figura 3). Questa polimerasi citoplasmatica è fornito in trans da coinfezione con un modificato vaccinia virus ricombinante Ankara (MVA-T7) 34. Figura 3A mostra il plasmide pNDV-B1, che codifica l&#39;intera lunghezza cDNA antigenomic 5. Figura 3B mostra plasmidi codificanti pTM1 NP, P e L ORF. Plasmidi pCITE-GFP, che codifica, under il promotore T7, la proteina fluorescente verde (GFP), e pCAGGS GFP 18, che codifica lo stesso ORF sotto il promotore actina di pollo beta 35, sono usati come controlli. In questo protocollo mostriamo la procedura per salvare ricombinante NDV dal cDNA del lentogeno NDV ceppo Hitchner B1 5 (Figura 4).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>35% Albumina Bovina (BA)</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>Qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>Qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (PS) 100x</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>Qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td colspan="4"> Cell lines Le cellule A549 (numero di catalogo CRL-185), le cellule HEp-2 (numero di catalogo CRL-185), i fibroblasti di embrioni di pollo (numero di catalogo CRL-12203) e i fibroblasti di embrioni di anatra (numero di catalogo CCL-141) sono disponibile presso l'American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Tutte le linee cellulari sono mantenute in una temperatura di 37 &deg; Incubatore C con 5% di CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Uova di gallina embrionate Le uova di gallina embrionate possono essere ottenute da Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) e sono mantenuti a 37 &deg;C. La vitalità degli embrioni viene valutata con un candelabro per uova. Le uova si infettano quando raggiungono gli 8-10 giorni di vita. Sia l'infezione che il prelievo del liquido allantoideo avvengono in condizioni sterili. Tutte le uova vengono sterilizzate in autoclave e scartate seguendo i protocolli standard di biosicurezza di laboratorio. Globuli rossi (RBC) I globuli rossi di tacchino possono essere acquistati da Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA) e conservati a 4 °C. Per preparare i globuli rossi per il dosaggio dell'acido ialuronico, lavare 5 ml di brodo commerciale con 45 ml di PBS 1x in una provetta conica da 50 ml. Centrifugare per 5 minuti a 1.000 giri/min e scartare con cura il surnatante. Diluire l'RBC pellettato 1:1.000 in PBS 1x per una concentrazione finale dello 0,5-1,0%. I globuli rossi lavati possono essere conservati a 4 gradi; C per diversi giorni. Plasmidi Le preparazioni plasmidiche sono ottenute con qualsiasi kit maxiprep disponibile in commercio seguendo il produttore&#039; , diluito in ddH20 fino a una concentrazione finale di 1 &mu; g/&mu; l e conservato a -20 &deg;C. La concentrazione e la purezza del DNA sono valutate mediante spettrofotometria a 260 e 280 nm. I preparati con un rapporto 260/280 superiore a 1,8 sono considerati di qualità accettabile per il salvataggio. La qualità del DNA plasmidico viene inoltre regolarmente controllata mediante cromatografia su gel di agarosio. Virus Il protocollo descritto per il salvataggio del ceppo lentogeno NDV Hitchner B1 può essere eseguito in condizioni di livello di biosicurezza (BSL) 2. Il Vaccinia Ankara modificato che esprime l'RNA polimerasi T7 (MVA-T7) è stato descritto34 e ottenuto dal Dr. Bernard Moss. Questo virus cresce in monostrati confluenti di fibroblasti embrionali di pollo ed è titolato in cellule di mammifero (A549 o HEp-2). I ceppi di NDV sono allevati in uova di gallina embrionate e titolati mediante IFA utilizzando siero policlonale allevato contro virioni purificati. Tutto il materiale contaminato deve essere sterilizzato in modo sicuro e smaltito secondo le procedure standard di biosicurezza. Terreni e soluzioni per colture tissutali: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#039; s Aquila modificata&#039; s Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e penicillina/streptomicina (P/S): 445 ml di DMEM, 50 ml di FBS inattivato termicamente, 5 ml di soluzione 100x P/S commerciale. Conservare a 4°C. 10x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na2HPO4.7H2O, 2 g di KH2PO4. Aggiungere ddH2O fino a 1 L. Regolare il pH a 7,3. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente. 1x PBS: Diluire 10x PBS 1:10 con ddH2O. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2,133 g di MgCl2,6H2O e aggiungere ddH2O fino a 100 ml. Autoclavare e conservare a temperatura ambiente. 1x PBS/BA/PS: 50 ml di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave e una volta raffreddato a temperatura ambiente, aggiungere 5 ml 100x Penicillina/Streptomicina 3 ml 35% Bovino e 5 ml di 100x Ca/Mg. Conservare a 4 &deg;C. </td></tr></tbody></table>

salvataggio di virus ricombinante malattia di newcastle da cdna

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Virus della malattia di Newcastle (NDV), il membro prototipo del genere Avulavirus della famiglia Paramyxoviridae 1, è un non-segmentato, negativo-senso, a singolo filamento, avvolta virus RNA (Figura 1), con potenziali applicazioni come vettore per la vaccinazione e trattamento di malattie umane. L&#39;esplorazione in profondità di queste applicazioni è diventato possibile solo dopo l&#39;istituzione della genetica inversa tecniche per salvare i virus ricombinanti da plasmidi che codificano i loro genomi completi come cDNA 2-5. CDNA virale può essere convenientemente modificati in vitro utilizzando procedure di clonazione standard per alterare il genotipo del virus e / o di inserire nuove unità trascrizionali. Salvataggio di tali virus geneticamente modificati, fornisce un prezioso strumento per comprendere i fattori che incidono più fasi dell&#39;infezione, così come consente lo sviluppo e il miglioramento di vettori per l&#39;espressione e la consegna degli antigeniper la vaccinazione e la terapia. Qui si descrive un protocollo per il salvataggio di NDVs ricombinanti.

Salvataggio di NDV è una procedura consolidata, eseguita di routine nei laboratori che hanno accesso al cDNA completa del virus. Tuttavia, la natura intrinseca stocastico del metodo rende difficile raggiungere il 100% di efficienza salvataggio. Monitoraggio prime fasi del processo, specialmente l'efficienza di trasfezione e l'infezione con MVA-T7, aiuta a individuare eventuali problemi. Figura 5a mostra trasfezione standard ed efficienze di trasfezione / infezione che sono abbastanza per un successo sal...

Virus della malattia di Newcastle (NDV) è stata ampiamente studiata negli ultimi anni per sviluppare nuovi vettori per la vaccinazione e terapia, tra gli altri. Questi studi sono stati possibili a causa di tecniche di salvataggio virus ricombinante da cDNA, come quelle descritte.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di salvare il virus ricombinante della malattia di Newcastle o NDV dal DNA clonato. Ciò si ottiene infettando prima le cellule di mammifero con un virus helper che codifica per la T sette polimerasi, e poi sezionando quelle cellule con plasmidi, codificando il meccanismo di replicazione minimo del virus sotto il controllo del promotore T sette. Il secondo passo consiste nel co-coltivare le cellule di mammifero trasfettate con cellule aviarie, che provengono dagli ospiti naturali del virus.Le varietà appena generate rilasciate dalle cellule dei mammiferi infetteranno le cellule aviarie per un primo ciclo di amplificazione. Successivamente, il surnatante della co-coltura viene inoculato in uova di gallina embrionate per un'ulteriore crescita del virus salvato, il passaggio finale consiste nel raccogliere il fluido toico LAN dalle uova inoculate. In definitiva, viene utilizzato un semplice test nazionale dell'emoagglutinina per dimostrare la presenza di NDV nel liquido toico LAN e il successo del processo di salvataggio.I virus ricombinanti salvati con questo metodo possono fornire informazioni su diversi fattori che influenzano l'infezione e possono anche essere utilizzati come vettori per la somministrazione di antigeni per la vaccinazione e la terapia antitumorale. Per iniziare a dividere l'epatite di mammifero due o 5 49 cellule il giorno prima della trasfezione in piastre a sei pozzetti, la densità delle cellule dovrebbe raggiungere l'80-90% di confluenza il giorno successivo. Per ogni virus da salvare, includi da due a quattro pozzetti diversi.Includono anche due pozzetti extra per i controlli PCA, GFP e pite, GFP mirato a monitorare la trasfezione e MVAT sette efficienze di infezione rispettivamente. Lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS riscaldato, quindi infettare le cellule di mammifero in coltura con il virus MVA T sette a una molteplicità di infezione di un PFU per cellula. In un volume finale di 200 microlitri in PBS, lasciare incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente durante l'incubazione dell'infezione virale, preparare la miscela di trasfezione come descritto nel testo scritto dopo aver preparato la soluzione ottimale per la lipectomia e preincubarla per cinque minuti.Versare 250 microlitri della soluzione nelle provette di DNA e incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione con MVAT sette, rimuovere l'inoculo virale per aspirazione e sostituirlo con la miscela di trasfezione di DNA lipo. Aggiungere un millilitro di DMEM 10%FBS a ogni piatto. Incubare le cellule infette trasfettate per sei-otto ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.Quindi sostituire il mezzo di trasfezione con 1,5 millilitri di DMEM fresco 10%FBS A 24 ore dalla trasfezione, i pozzetti di controllo possono essere osservati al microscopio a fluorescenza per valutare l'efficienza della trasfezione e l'attività della T sette polimerasi prima di procedere con la co-coltura delle cellule di mammifero trasfettate infette con fibroblasti aviari. Di solito viene utilizzato un piatto confluente di 100 millimetri di fibroblasti embrionali di embrione di pollo o anatra per due pozzetti trasfettati. Assicurati di prepararti con sufficiente anticipo.Piastre di coltura tissutale da 100 millimetri di cellule aviarie per tutti i tentativi di salvataggio per un salvataggio efficiente del virus. Il terreno DMEM 10%FBS è integrato con il 5% di liquido toico elan e cloruro di magnesio 30 millimolare. Dopo aver lavato le cellule dei mammiferi due volte con una tripsina XPBS riscaldata, le cellule vengono osservate con 0,2 millilitri di tripsina EDTA fino a quando non si staccano.Risospendere le cellule in un millilitro del DMEM integrato e trasferirle in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri a tre millilitri dello stesso terreno. Dopo aver lavato le cellule aviarie due volte con una tripsina XPBS riscaldata, le cellule vengono esaminate con un millilitro di tripsina EDTA e incubate per uno o due minuti a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano. Risospendere le cellule aviarie aggiungendo otto millilitri del terreno preparato.Quindi aggiungere quattro millilitri di cellule aviarie tripizzate alle cellule di mammifero nella piastra di coltura tissutale da 100 millimetri di co-coltura per un volume totale di otto millilitri. Agitare delicatamente le cellule in co-coltura nel piatto da 100 millimetri per garantire una distribuzione uniforme, quindi posizionarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Gli ovuli vengono infettati quando tutte le cellule in co-coltura sono colpite dall'effetto citopatico dovuto all'infezione virale MVAT sette.A questo punto, rimuovere un millilitro di surnatante per colture tissutali e aggiungerlo a una centrifuga per provette DPH eend. Il surnatante della coltura tissutale per un minuto a 12.000 giri/min in una centrifuga da banco. Per rimuovere i detriti cellulari, accendi le uova usando una scatola di speratura leggera per vedere l'interfaccia tra la sacca d'aria e la cavità di Alan Toic.Segnare sul bordo dell'interfaccia evitando la localizzazione dei vasi sanguigni. Spruzzare il 70% di etanolo sulle uova per stabilire le condizioni di sterilità. Fai delicatamente un buco nel guscio d'uovo nel punto contrassegnato.Quindi inoculare 500 microlitri di snat utilizzando una siringa da un millilitro, puntando l'ago verticalmente e direttamente nella cavità di Alan Toic. Sigillare la scalfittura nel guscio d'uovo con cera fusa o paraffina. Incubare le uova per due o tre giorni a 37 gradi Celsius.Incubare le uova infette per due-quattro ore o durante la notte a quattro gradi Celsius per uccidere l'embrione di pollo e coagulare il sangue. Spruzzare le uova con etanolo al 70% per mantenere le condizioni sterili. Picchiettare con cautela la sezione apicale dell'uovo sulla cavità d'aria con un cucchiaio.Una volta che il guscio dell'uovo è rotto, rimuovere i frammenti con una pinza ed esporre completamente la membrana toica LAN. Esporre la cavità toica LAN asportando la membrana toica ORL con pinze e forbici, evitando danni ai vasi sanguigni e alla quercia. Spingere con cautela l'embrione verso il basso con una spatola e raccogliere il liquido toico LAN che scorre verso l'alto con una pipetta da 10 millilitri.Evitare di danneggiare la membrana del tuorlo. Trasferire il liquido toico LAN in una provetta da centrifuga da 15 millilitri con ghiaccio. Chiarificare il fluido toico LAN centrifugando per cinque minuti a 1500 giri/min.Trasferire il surnatante in un tubo nuovo senza disturbare il pellet. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana fino a quando non vengono controllati per la presenza di NDV mediante il test Hemagglutinin Nation. La presenza di virus nel fluido Alan Toic da uova infette può essere determinata macroscopicamente dalla loro capacità di emoagglutinina otto globuli rossi di Turchia, campioni di controllo negativi come un XPBS o un fluido Alan Toic non infetto, nonché campioni di controllo positivi come il fluido Al Toic da qualsiasi virus NDV dovrebbero essere sempre inclusi in qualsiasi test HA per convalidarlo.Per eseguire il test HA, pipettare 50 microlitri di un XPBS per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con fondo a V, quindi pipettare 50 microlitri di campioni di fluido toico LAN nei pozzetti sulla prima colonna della piastra. Eseguire una doppia diluizione seriale attraverso il resto della piastra e scartare gli ultimi 50 microlitri in eccesso dai pozzetti. Nell'ultima colonna, erogare 50 microlitri di globuli rossi di tacchino allo 0,5% in un XPBS per pozzetto, agitare delicatamente la piastra picchiettando, incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 30-45 minuti o fino a quando non si forma un pellet trasparente nei pozzetti di controllo negativi.È possibile monitorare le prime fasi della procedura di salvataggio NDV, in particolare l'efficienza di trasfezione e l'infezione con MVAT seven mostrate qui. Un'immagine rappresentativa in fluorescenza e in campo chiaro di 5 49 cellule trasfettate con PAGs GFP o infettate con MVAT seven e trasfettate con P otto GFP costitutivo. L'espressione della GFP guidata dalle PCA è un indicatore dell'efficienza della trasfezione, mentre l'espressione della GFP guidata dal promotore T sette dal sito P è un controllo per l'infezione da MVAT sette e l'attività della T sette polimerasi.Le immagini mostrano efficienze di trasfezione e infezione da trasfezione che sono sufficienti per un salvataggio di successo dell'NDV dopo i cicli di amplificazione nelle cocolture di mammiferi aviari e nelle uova embrionate, la presenza del virus salvato viene rilevata da pozzetti positivi nel test HA. NDV induce l'emoagglutinina legando gli eritrociti e quindi ne impedisce la sedimentazione sul fondo del pozzetto a forma di V. Pertanto, la mancanza di attività dell'HA può essere facilmente distinta dalla formazione di un pellet rotondo rosso di globuli rossi, come mostrato qui nel controllo negativo, e da un risultato negativo da tre campioni sconosciuti ottenuti dopo il salvataggio Rescue.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come salvare il virus ricombinante della malattia di Newcastle dal CDNA con un'elevata riproducibilità.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.

Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

La recente epidemia del virus zika sottolinea l'importanza di stabilire approcci genetici inversi per sviluppare vaccini e/o strategie terapeutiche. Qui, descriviamo il protocollo per salvare un virus infettivo ricombinante zika da un clone cDNA a lunghezza intera assemblato in un cromosoma artificiale batterico sotto il controllo del promotore riciclo-precoce umano.

Salvataggio del virus zoka ricombinante da un clone cDNA cromosoma artificiale batterico

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente &gt; 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .

Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Questo documento di protocollo descrive la metodologia della microiniezione embrionale di lenti di pollo di un retrovirus RCAS(A) come strumento per studiare la funzione in situ e l'espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente.

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo

Questo articolo presenta un metodo semplificato per la preparazione di 4 unità di emoagglutinazione dell'antigene per i test sierologici del virus della malattia di Newcastle. Determinando con precisione il titolo di emoagglutinazione dell'antigene, combinato con un metodo di titolazione inversa più rigoroso e un processo di aggiustamento ben definito, migliora l'efficienza del test, riduce i falsi positivi e migliora la sorveglianza della malattia nel pollame.

Ottimizzazione della preparazione dell'antigene per il test di inibizione dell'emoagglutinazione della sierologia del virus della malattia di Newcastle

Scopri come salvare il virus della malattia di Newcastle ricombinante da cDNA utilizzando cellule mammifere, plasmidi e uova embrionate. Questo metodo avanzato facilita lo sviluppo di vettori virali per vaccini e terapie innovative.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

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