Name: Produzione e purificazione di vettori derivati dalladenovirus canino di tipo 2 non replicativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Impara a costruire, produrre e purificare vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) per terapia genica e vaccinazione. Questo metodo consente trasduzione cellulare efficiente in vitro e in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da sovvenzioni dell'INSERM, del CNRS, della Fondation pour la Recherche Médicale e dell'Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) a D.G-D; il Settimo Programma Quadro della Commissione Europea a B.K.; M.S. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato da FRM (programma "Equipe FRM 2009"); C.B. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'UE, nell'ambito dell'accordo di sovvenzione numero 245266 (Orbivac).

1. Costruzione di un plasmide genomico CAV2 non replicativo
Nota: tutti i plasmidi descritti in questo protocollo sono stati descritti in precedenza7 e sono disponibili su richiesta.
<ol>
	<li>Clonare il GOI nel plasmide pShuttle, utilizzando enzimi di restrizione appropriati, per generare pShuttle-GOI (Figura 1A).</li>
	<li>Digerire 2 μg di pShuttle-GOI mediante AscI/PacI. La digestione rilascia il frammento Shuttle-GOI (~2,9 kbp + sequenza ORF GOI) dalla spina dorsale plasmidica (2,8 kbp).</li>
	<li>Purificare il frammento Shuttle-GOI dopo l'elettroforesi su gel di agarosio, utilizzando il gel NucleoSpin e il kit di pulizia PCR.</li>
	<li>Parallelamente, digerire 1 μg di plasmide genomico pCAV2 mediante SwaI. Il plasmide pCAV2 contiene un sito SwaI unico situato all'interno della regione E1 (Figura 1B). Inattivare termicamente questo enzima di restrizione a 65 °C per 20 minuti.</li>
	<li>Trasformare i batteri competenti E. coli BJ5183 con 500 ng di frammento Shuttle-GOI purificato e 100 ng di plasmide pCAV2 linearizzato per la ricombinazione omologa (Figure 1B). Stendere su piastre LB-Amp. Incubare le piastre a 37 °C per almeno 20 ore.</li>
	<li>Eseguire l'analisi PCR direttamente sulle colonie batteriche utilizzando la master mix EmeraldAmp con primer in avanti (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') e inverso (5'-GCGGTAGTTTATCAGTTAAATTGC-3'), nelle seguenti condizioni cicliche: 10 min a 95 °C (per un ciclo), 95 °C per 1 min; 58 °C per 1 min; 72 °C per 1 min/kbp (per 39 cicli), e infine 5 min a 72 °C. Un prodotto di 1 kbp + sequenza ORF GOI viene amplificato da cloni positivi per pCAV-GOI, mentre nessun prodotto di PCR può essere rilevato con cloni negativi.</li>
	<li>Inoculare almeno due colonie positive per una notte ciascuna in 5 ml di LB-amp di terreno a 37 °C in uno shaker (220 giri/min).</li>
	<li>Estrarre il DNA plasmidico utilizzando il kit plasmidico Nucleospin. Trasformare i batteri E. coli DH5α competenti con un'aliquota di ciascun preparato di DNA. Stendere la sospensione batterica su piastre LB-Amp e incubare per una notte a 37 °C.</li>
	<li>Inoculare due colonie di ciascun clone positivo per una notte in 3 ml di terreno LB-amp a 37 °C in un agitatore (220 giri/min). Estrai il DNA plasmidico utilizzando il kit plasmidico Nucleospin.</li>
	<li>Digerire il DNA risultante e il plasmide pCAV2 parentale (come controllo) con NdeI. Il modello di restrizione del pCAV2 parentale è 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp e 1,6 kbp. La cassetta di espressione GOI è inserita all'interno del frammento di 7,9 kbp e contiene almeno un sito NdeI, cioè uno nella cassetta e i siti potenziali presenti nel GOI.</li>
	<li>Seleziona le costruzioni positive e procedi al passaggio 2 con almeno 2 cloni indipendenti.</li>
</ol>
2. Trasfezione del plasmide del genoma CAV2 ricombinante in cellule DK-E1
Nota: i vettori non replicativi derivati da CAV2 sono organismi geneticamente modificati classificati come Livello di Biosicurezza 2 (BSL-2), mentre il loro uso su modelli animali è classificato come BSL-1. Si prega di utilizzare adeguate misure di contenimento e gestione dei rifiuti, compresi i dispositivi di protezione individuale, e di lavorare sotto cappe a flusso laminare BSL-2.
<ol>
	<li>Un giorno prima della trasfezione, seminare le cellule DK-E1 su una piastra a 6 pozzetti. Far crescere le cellule a 37 °C e 5% di CO2, nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio, contenente il 7% di siero fetale di vitello inattivato termicamente (FCS), 1 mM di piruvato di sodio e 100 U/ml di penicillina/100 μg/ml di streptomicina. Le cellule dovrebbero essere confluenti al 70-80% per la trasfezione.</li>
	<li>Digerire 2 μg di plasmide pCAV-GOI con AscI, per rilasciare la sequenza non virale del plasmide. Controllare il modello di restrizione risultante mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. La digestione dovrebbe produrre un frammento di ~31 kbp contenente il genoma ricombinante e un frammento di 2 kbp corrispondente alla spina dorsale del plasmide.</li>
	<li>Mescolare il DNA digerito con 200 μl di Jet Prime Buffer agitando per 10 secondi. Aggiungere 4 μl di Jet Prime e mescolare agitando per 10 secondi. Centrifugare brevemente per rimuovere le goccioline e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia sulle cellule. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la miscela e incubare a 37 °C.</li>
</ol>
3. Propagazione del CAV2 ricombinante
<ol>
	<li>Una settimana dopo la trasfezione, raccogliere le cellule e il terreno di coltura in una provetta di polipropilene da 15 ml. Disgregare le cellule mediante tre cicli di congelamento-scongelamento (-80 °C/37 °C) ed eliminare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1.800 x g.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante e conservare a -20 °C per la successiva propagazione del virus.</li>
	<li>Infettare un monostrato confluente all'80-90% di cellule DK-E1 coltivate in un pozzetto di piastra a 6 pozzetti con 0,5 ml di surnatante contenente virus. Incubare a 37 °C per 1 ora, agitando leggermente. Rimuovere l'inoculo e sostituirlo con 1,5 ml di DMEM completo contenente il 5% di FCS inattivato a caldo.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C per 3-4 giorni. Le cellule devono essere monitorate quotidianamente per la comparsa di un effetto citopatico (CPE, Figure 2A-B). Se non è visibile alcun CPE chiaro, prelevare le cellule dopo 4 giorni di coltura e ripetere i passaggi 3.1-3.4.</li>
	<li>Quando un CPE chiaro colpisce la maggior parte delle cellule, di solito dopo 2-4 cicli di amplificazione virale, raccogliere le cellule con il terreno di coltura e congelare-scongelare 3 volte come descritto sopra. Infettare l'80-90% di cellule DK-E1 confluenti coltivate in tre piastre di coltura tissutale di 10 cm di diametro, utilizzando ogni volta 0,5 ml di surnatante contenente virus.</li>
	<li>Dopo 3-4 giorni (quando il CPE è completo), prelevare le cellule da queste piastre da 10 cm, disgregarle nuovamente con tre cicli di congelamento-scongelamento, eliminare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1.800 x g, raccogliere il surnatante e conservarlo a -20 °C per l'amplificazione CAV2 su larga scala.</li>
</ol>
4. Purificazione CAV2 su larga scala
<ol>
	<li>Infettare l'80-90% di monostrati confluenti di cellule DK-E1 coltivate in piastre di coltura tissutale di quaranta 10 cm di diametro. Per ogni piatto, utilizzare 0,1 ml di surnatante contenente virus diluito in 1 ml di DMEM completo senza FCS. Incubare le cellule a 37 °C per 3-4 ore in leggera agitazione. Aggiungere 5 ml di DMEM completo integrato con il 5% di FCS.</li>
	<li>Incubare per 3 giorni. Raccogliere le cellule infette dalle piastre da quaranta cm in provette di polipropilene da 50 ml. Pellettare le celle a 1.200 x g per 10 minuti a 4 °C e risospenderle in 15 ml di terreno DMEM.</li>
	<li>Disgregare le cellule mediante tre cicli di congelamento-disgelo (-80 °C/37 °C). Rimuovere i detriti cellulari centrifugando a 1.800 x g per 10 minuti e conservare il surnatante a -20 °C prima della purificazione delle particelle virali.</li>
	<li>Preparare un gradiente discontinuo di CsCl in una provetta Ultra-Clear da 14 ml. Per prima cosa, versare 2 ml di soluzione di CsCl (1,40 g/ml in soluzione salina tamponata con fosfato) sul fondo della provetta. Quindi, aggiungere lentamente 2 ml di soluzione di CsCl (1,25 g/ml in soluzione salina tamponata con fosfato) sopra la prima soluzione.</li>
	<li>Caricare con cura il surnatante virale sopra il gradiente di CsCl. Riempire il tubo con olio minerale fino a 2-3 mm dall'alto. Centrifugare per 1,5 ore a 130.000 x g e 18 °C in un rotore SW40 oscillante.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, due bande bianche sono chiaramente visibili all'interfaccia tra i 2 strati di soluzione di CsCl (Figura 2C). Utilizzando un ago da 21 G e una siringa, raccogliere con una puntura laterale la fascia inferiore contenente particelle mature di CAV2. Cerca il più possibile di evitare di raccogliere la banda superiore, che corrisponde a particelle virali vuote.</li>
	<li>Preparare un gradiente continuo di CsCl in una provetta trasparente da 14 ml mescolando le particelle virali raccolte con una soluzione di CsCl (1,34 g/ml in soluzione salina tamponata con fosfato). Riempire il tubo con olio minerale fino a 2-3 mm dall'alto. Centrifugare per 18 ore a 130.000 x g e 18 °C in un rotore SW40 oscillante.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, raccogliere la fascia bianca contenente CAV2 pungendola lateralmente con una siringa come descritto sopra. Ancora una volta, cerca di evitare di raccogliere la banda superiore rimanente. Questo dovrebbe essere più facile in questo gradiente continuo, che separa meglio le due bande. Il volume totale della sospensione raccolta non deve superare i 2 ml.</li>
	<li>Equilibrare una colonna Sephadex G-25 PD-10 con 30 ml di PBS.</li>
	<li>Caricare la sospensione virale ed eliminare il flusso.</li>
	<li>Eluire con frazioni di 500 μl di PBS. Raccogliere le frazioni 5-7, che di solito contengono le particelle CAV2 dissalate. Le frazioni contenenti virus possono essere facilmente identificate perché sono opalescenti. Aggiungere 150 μl di glicerolo a 1,5 ml di sospensione di CAV2 e conservare in aliquote a -80 °C.</li>
</ol>
5. Titolazione di CAV2 mediante diluizione end-point
<ol>
	<li>Scongelare un'aliquota di virus purificato su ghiaccio ed eseguire diluizioni seriali di 10 volte (da 10-2-10-12) in DMEM privo di siero.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di ciascuna diluizione virale in 5 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 1,5 x 104 celle DK-E1 in ogni pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 5 giorni.</li>
	<li>Al 5° giorno dopo l'infezione, monitorare l'aspetto della CPE mediante osservazione microscopica (Figure 2A-B). I titoli infettivi sono determinati come dosi infettive mediane di coltura tissutale (TCID50), utilizzando il metodo statistico di Reed e Muench13.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
<li>Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+canine+adenovirus+type+2+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An update on canine adenovirus type 2 and its vectors.</a> Viruses. 2, 2134-2153 (2010).</li>
<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
<li>Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotropism+and+retrograde+axonal+transport+of+a+canine+adenoviral+vector%3A+a+tool+for+targeting+key+structures+undergoing+neurodegenerative+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes.</a> Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).</li>
<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il semplice metodo qui descritto, adattato dalla ben documentata tecnologia Ad5, consente la produzione efficiente di vettori CAV2 non replicativi con una capacità di clonazione tipica di ~4,2 kbp. Per quanto riguarda le considerazioni temporali, un genoma CAV2 ricombinante viene solitamente generato in due settimane, mentre ci vorranno altre 5 settimane per amplificare, purificare e titolare le sospensioni virali.
Sebbene la produzione del primo lotto di vettori derivati da CAV2 possa sembrar...

Negli ultimi decenni, i vettori derivati dagli adenovirus (Ads) hanno dimostrato la loro efficacia per la terapia genica e la vaccinazione, nonché nella viroterapia oncolitica 1. Gli annunci sono virus icosaedrici senza involucro della famiglia degli Adenoviridae, che sono stati isolati da mammiferi, uccelli, rettili, anfibi e pesci. Dalla loro scoperta nel 1953, gli AD sono stati intensamente studiati come modelli per studiare le interazioni virus/cellula e, più recentemente, come sistemi di consegna genica basati su vettori 2. In effetti, i vettori basati su ADS offrono molti vantaggi, come la loro ampia gamma di ospiti e una biologia ben caratterizzata, insieme alla facilità con cui possono essere manipolati geneticamente e amplificati per la produzione su larga scala.
Al fine di superare le difficoltà cliniche legate all'immunità preesistente nelle popolazioni umane verso i vettori derivati dagli annunci umani 3, noi e altri abbiamo iniziato a derivare vettori dagli annunci non umani 4. Inoltre, i vettori adenovirali non umani sembrano essere più adatti alla vaccinazione di massa in medicina veterinaria rispetto all'adenovirus di tipo 5 (Ad5) di uso classico, poiché dovrebbero essere più conformi ai requisiti di sicurezza durante la valutazione del rischio da parte delle autorità nazionali di regolamentazione. Alla fine degli anni '90, abbiamo descritto il primo CAV2 ricombinante come alternativa non umana ai vettori derivati da Ad5 5. Da allora, numerosi studi hanno confermato il potenziale dei vettori CAV2 per il trasferimento genico terapeutico o antigenico (per le recensioni 6,7). Come altri AD, i vettori derivati da CAV2 sono stabili e possono essere prodotti ad alti titoli, il che ne facilita l'uso in vivo. Sono anche sicuri, poiché non sono integrativi, sebbene consentano un'espressione transgenica di lunga durata in vivo (>1 anno) 8. Sorprendentemente, e meglio dei sierotipi umani di AD, i vettori CAV2 hanno dimostrato di essere altamente neurotropici, con un trasporto retrogrado molto efficiente negli assoni 9,10. Questa proprietà intrinseca ha portato all'idea di utilizzare vettori CAV2 ricombinanti per trasdurre neuroni di specifiche aree cerebrali difficilmente accessibili ai vettori lentivirali, finora comunemente utilizzati per il trasferimento genico nel sistema nervoso centrale 11.
Qui, descriviamo un protocollo semplice e classico per costruire, produrre e purificare vettori CAV2 non replicativi derivati dal ceppo Manhattan. I genomi ricombinanti di CAV2 sono costruiti clonando il gene di interesse desiderato (GOI) in una cassetta a valle del promotore precoce del citomegalovirus (CMV), che fornisce un'espressione ubiquitaria. I vettori CAV2 hanno una capacità di clonazione di ~4,2 kbp, che consente di esprimere cDNA di grandi dimensioni. In una seconda fase, questa cassetta di espressione viene inserita per ricombinazione omologa al posto della regione E1 del genoma CAV2, portando a un virus non replicativo (dlE1), come descritto inizialmente da Chartier et al. 12 Infine, le particelle virali vengono prodotte dopo la trasfezione del plasmide genomico in una linea cellulare di rene canino che esprime CAV2-E1 (DK-E1) e vengono amplificate in serie prima della concentrazione e della purificazione delle scorte virali. Il metodo qui descritto utilizza un'ultracentrifugazione in due fasi in gradienti di cloruro di cesio (CsCl), che consente l'arricchimento di particelle infettive con un alto titolo finale (di solito oltre10-10 particelle infettive per ml). La sospensione virale viene quindi desalinizzata mediante cromatografia attraverso colonne monouso Sephadex G-25 in modo che sia in definitiva sufficientemente pura da poter essere utilizzata direttamente in vivo.

<table><tbody><tr><td>Enzimi di restrizione</td><td>New England Biolabs</td><td>Vari</td><td></td></tr><tr><td>kit di trasfezione Jet Prime</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli batteri BJ5183</td> Colonna di desalinizzazione <td>Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp polimerasi</td><td>Takara</td><td>RR320A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di plasmidi nucleospin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 14 ml, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione e purificazione di vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 non replicativo

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

I vettori derivati dall'adenovirus (Ad) sono stati ampiamente utilizzati per il trasferimento genico a breve o lungo termine, sia per la terapia genica che per le applicazioni vaccinali. A causa della frequente immunità preesistente contro l'adenovirus umano di tipo 5 di uso classico, l'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) è stato proposto come vettore alternativo per il trasferimento genico umano. La biologia ben caratterizzata di CAV2, insieme alla sua facilità di manipolazione genetica, offre importanti vantaggi, in particolare per il trasferimento genico nel sistema nervoso centrale, o per indurre un'ampia gamma di risposte immunitarie protettive, dall'immunità umorale a quella cellulare. Al giorno d'oggi, il CAV2 rappresenta uno degli adenovirus non umani più interessanti per l'uso come vettore di vaccini. Questo protocollo descrive un metodo semplice per costruire, produrre e titolare vettori CAV2 ricombinanti. Dopo aver clonato la cassetta di espressione del gene di interesse in un plasmide navetta, il plasmide genomico ricombinante viene ottenuto per ricombinazione omologa nel ceppo batterico di E. coli BJ5183. Il plasmide genomico risultante viene quindi trasfettato in cellule renali canine che esprimono i geni complementari CAV2-E1 (DK-E1). Un'amplificazione virale consente la produzione di un ampio stock virale, che viene purificato mediante ultracentrifugazione attraverso gradienti di cloruro di cesio e desalinizzato mediante dialisi. La sospensione virale risultante ha abitualmente un titolo di oltre10-10 particelle infettive per ml e può essere somministrata direttamente in vivo.

La produzione di vettori ricombinanti CAV2 si basa su tecniche fondamentali ma importanti di biologia molecolare. Prima della produzione dei vettori virali, è infatti necessario costruire un genoma ricombinante di CAV2 contenente una cassetta di espressione per il transgene. Questa costruzione prevede due passaggi: innanzitutto, il gene di interesse (GDI) viene clonato in un plasmide shuttle come cassetta di espressione (ovvero con promotore e segnale di poliadenilazione). Questo elemento funzionale è delimitato...

Negli ultimi 15 anni, i vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) hanno dimostrato la loro efficienza nel trasdurre cellule in vitro e in vivo e sono ampiamente utilizzati per la vaccinazione e la terapia genica. Qui descriviamo una procedura per costruire, produrre e purificare vettori CAV2, dando origine a sospensioni virali ad alto titolo.

Produzione e purificazione di vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 non replicativo

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire, produrre e purificare vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo due. Ciò si ottiene clonando prima il gene di interesse in un plasmide navetta. Il secondo passo consiste nell'ottenere un plasmide genomico ricombinante mediante ricombinazione omologa.Successivamente, il vitello difettoso ricombinante, due virus prodotti e amplificati in una linea cellulare trans complementante. Il passaggio finale consiste nel purificare e concentrare il virus ricombinante risultante per diverse applicazioni in vivo e in vitro. In definitiva, la microscopia confocale a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare esempi di trasduzione virale nel cervello dei roditori.Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti come i vettori derivati dall'adnevrosi umana è che non esiste un'immunità preesistente contro il secondo vitello nelle popolazioni umane. Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinazione o della terapia genica, come la valutazione del ruolo delle proteine espresse in specifiche aree cerebrali. Quindi a dimostrare questa procedura saranno May KY e Corin Bergeron.Due ricercatori post-dottorato dei nostri laboratori Prepararsi per questa procedura un giorno prima della trasfezione seminando cellule DKE one su una piastra a sei pozzetti per far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 in DMEM con glucosio alto contenente il 7% di calore, vitello fetale inattivato, siero di sodio, piruvato, penicillina e streptomicina. Il giorno seguente, le cellule dovrebbero essere confluenti dal 70 all'80% per la trasfezione digerire due microgrammi di pcal GOI il plasmide genomico ricombinante cav due con ASC uno per rilasciare la sequenza non virale del plasmide, controllare il modello di restrizione risultante dallo 0,8% La digestione per elettroforesi su gel agro dovrebbe produrre un frammento di coppia di circa 31 kilobasi contenente il genoma ricombinante e un frammento di coppia di due kilobasi corrispondente alla spina dorsale del plasmide. Mescolare il DNA digerito con 200 microlitri di tampone jet prime e vortex per 10 secondi.Aggiungere quattro microlitri di jet prime e mescolare vorticando per 10 secondi. Centrifugare brevemente per rimuovere le goccioline e incubare per 10 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia sulle celle DKE one.Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente la miscela e incubare a 37 gradi Celsius. Una settimana dopo la trasfezione, raccogliere le cellule e il terreno di coltura in una provetta di polipropilene da 15 millilitri. Distruggi le cellule con tre cicli di pensiero di congelamento.Eliminare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1, 800 volte G.Raccogliere il surnatante e conservare a meno 20 per la successiva propagazione del virus per propagare il virus infettare un monostrato confluente all'80-90% di cellule DKE uno coltivate in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti con 0,5 millilitri del virus contenente surnatante. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora in leggera agitazione Dopo un'ora. Rimuovere l'inoculo e sostituirlo con 1,5 millilitri di DMEM completo contenente il 5% di FCS inattivato a caldo incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre o quattro giorni.Le cellule devono essere monitorate quotidianamente per la comparsa di un effetto citopatico o CPE. Se non è visibile alcun CPE chiaro. Raccogliere le cellule dopo quattro giorni di coltura e ripetere l'amplificazione virale quando un CPE chiaro colpisce la maggior parte delle cellule.Di solito dopo due o quattro cicli di amplificazione virale, raccogliere le cellule con il terreno di coltura e congelare e scongelare tre volte come dimostrato in precedenza. Infettare dall'80 al 90% confluente. Le cellule DKE 1 sono cresciute in tre piastre di coltura tissutale di 10 centimetri di diametro utilizzando 1,5 millilitri di virus contenente surnatante per piastra dopo tre o quattro giorni quando il CPE è completo.Raccogliere le cellule da queste piastre di 10 centimetri di diametro, interromperle con tre cicli di freestyle e cancellare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1.800 volte. G raccogliere il surnatante e conservarlo a meno 20 per l'amplificazione Cav due su larga scala per iniziare la procedura di ingrandimento, infettare dall'80 al 90% monostrati confluenti di cellule DKE, una cresciuta in 40 piastre di coltura tissutale da 10 centimetri di diametro, per ogni piatto utilizzare 0,1 millilitri di virus contenente surnatante diluito in un millilitro di DMEM completo senza FCS, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore sotto lieve agitazione. Dopo tre o quattro ore, aggiungere cinque millilitri di DMEM completo integrato con il 5% di FCS e incubare per tre giorni.Dopo tre giorni, raccogliere le cellule infette dai 40 piatti da 10 centimetri in tubi di polipropilene da 50 millilitri, le cellule in pellet a 1.200 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Resus sospenderli in 15 millilitri di DMEM medium disrupt cells mediante tre cicli di congelamento-scongelamento. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando a 1.800 volte G per 10 minuti.Conservare il surnatante a meno 20 prima della purificazione delle particelle virali per la purificazione delle particelle virali. Preparare un gradiente discontinuo di cloruro di cesio in una provetta UltraClear da 14 millilitri. Per prima cosa, versare due millilitri della soluzione di cloruro di cesio a densità più elevata sul fondo del tubo.Quindi aggiungere lentamente due millilitri della soluzione di cloruro di cesio a bassa densità sopra la prima soluzione. Caricare con cura il surnatante virale sopra il gradiente di cloruro di cesio. Riempire la provetta con olio minerale fino a due o tre millimetri dalla centrifuga superiore in un rotore SW 40 oscillante per un'ora e 30 minuti a 130, 000 volte g e 18 gradi Celsius dopo la centrifugazione.Due bande bianche sono chiaramente visibili all'interfaccia tra i due strati di soluzione di cloruro di cesio. Utilizzando un ago calibro 21 e una siringa, raccogliere lateralmente la fascia inferiore contenente due particelle mature in cav. Cerca il più possibile di evitare di raccogliere la banda superiore che corrisponde alle particelle virali vuote.Preparare un gradiente continuo di cloruro di cesio in una provetta trasparente da 14 millilitri mescolando le particelle virali collettive con una soluzione di cloruro di cesio. Riempire la provetta con olio minerale fino a due o tre millimetri dalla centrifuga superiore in un rotore SW 40 oscillante per 18 ore a 130, 000 volte G e 18 gradi. Dopo la centrifugazione, raccogliere il vitello bianco due contenente la puntura fianco a fianco con una siringa come dimostrato in precedenza.Ancora una volta, cerca di evitare di raccogliere la banda superiore rimanente. Questo dovrebbe essere più facile in questo gradiente continuo che separa meglio le due bande. Il volume totale della sospensione raccolta non deve superare i due millilitri.Successivamente, equilibrare una colonna cidex G 25 PD 10 con 30 millilitri di PBS. Caricare la sospensione virale sulla colonna e scartare il flusso attraverso l'eluizione con 500 microlitri di frazioni di PBS raccogliere le frazioni da cinque a sette, che di solito contengono le due particelle cav dissalate. Il virus contenente frazioni può essere facilmente identificato perché ci sono benedetto dal profumo.Infine, aggiungere 150 microlitri di glicerolo agli 1,5 millilitri di sospensione CAV due e conservare in Eloqua a meno 80 gradi Celsius per titolare il cav due mediante diluizione finale, scongelare un'aliquota di virus purificato su ghiaccio ed eseguire una diluizione seriale di dieci volte che va da 10 a meno due a 10 a meno 12 in DMEM libero sierico. Aggiungere 50 microlitri di ciascuna diluizione virale in cinque pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 1,5 volte 10 al quarto DKE, una cellula per ciascun pozzetto, incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per cinque giorni al quinto giorno. Monitorare l'aspetto del CPE post-infezione mediante osservazione microscopica.I titoli infettivi sono determinati come dosi infettive mediane di colture tissutali utilizzando il metodo statistico read and men prima della produzione di vettori virali. Un genoma CAV ricombinante con una cassetta di espressione per il transgene è costruito utilizzando tecniche standard di biologia molecolare. In primo luogo, il gene di interesse viene clonato in un plasmide shuttle come cassetta di espressione con un promotore precoce del citomegalovirus e un segnale di poliadenilazione affiancato da due sequenze genomiche derivate da due CAV che rappresentano le sequenze bersaglio di ricombinazione a monte e a valle.In una seconda fase, la cassetta di espressione viene inserita dal plasmide navetta nel genoma CAV due mediante ricombinazione omologa. L'inserimento della cassetta di espressione GOI porterà alla delezione dell'EA e di parte del gene E one B nel genoma ricombinante. Una volta ottenuto il plasmide genomico ricombinante, le particelle virali vengono prodotte utilizzando CAV due cellule E uno a complemento delle cellule DKE 1.Un chiaro effetto citopatico dovuto alla grande quantità di particelle virali prodotte nelle cellule infette può essere facilmente visualizzato dalla microscopia in campo chiaro o dall'espressione transgenica. Questo esempio è di A GFP che esprime CAV a due vettori. Dopo diversi cicli di amplificazione virale utilizzando cellule DKE one fresche, le particelle virali vengono purificate mediante ultracentrifugazione su gradienti di cloruro di cesio.Le particelle virali concentrate appaiono come due bande opalescenti all'interno del gradiente di cesio. La banda inferiore corrisponde al cav due ricombinante maturo che dovrebbe essere raccolto. Mentre la fascia superiore contiene particelle vuote non infettive che dovrebbero essere evitate.Il secondo vettore ricombinante del vitello risultante può essere utilizzato per trasdurre quasi tutti i tipi di cellule in un'ampia varietà di specie, sia in vitro che in vivo. Di seguito è mostrato un esempio applicativo in cui la GFP che esprime CAV due è stata iniettata da stereo taxii in diverse aree del sistema nervoso centrale del topo. Poiché questo protocollo produce titoli elevati e azioni virali pure e pure, l'iniezione di un solo microlitro di GFP diluito PBS che esprime il vettore CAV due nel giro dentato o DG porta a una trasduzione neuronale dal 40 al 50%.Inoltre, a causa della capacità di C due di essere trasportato retrogrado negli assoni iniezione di due microlitri di PBS diluito GFP che esprime CAV due vettore nello striato consente la trasduzione di quasi l'80% dei neuroni di nigro stri AAL nei subs, nigra pars compacta Dopo i suoi sviluppi. Queste tecniche aprono la strada ai ricercatori nel campo della vaccinologia o delle neuroscienze per esplorare nuovi antigeni e la funzione genica nel cervello in molti modelli animali diversi. Quindi non dimenticare che lavorare con CAF due vettori derivati può essere estremamente pericoloso e precauzionale, come adeguate misure di contenimento e gestione dei rifiuti, compresi i dispositivi di protezione individuale e il lavoro in cappe a flusso laminare in BSL due laboratori dovrebbero sempre essere presi durante l'esecuzione di questa procedura.

production-purification-non-replicative-canine-adenovirus-type-2

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Ricombinante adeno-associato virus (rAAVs) vettori stanno diventando sempre più prezioso...

Produzione e titolazione di vettori virali ricombinanti adeno-associato

Qui si descrive un protocollo basato solo sulle infezione delle cellule, che migliora l'efficienza della produzione di parvovirus ricombinante di oltre 100 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di un adenovirus nuovo 5-helper base contenente la VP parvovirus unità di trascrizione (Ad-VP).

Efficienti di produzione Parvovirus ricombinante con l&#39;aiuto delle Adenovirus sistemi derivati

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Viene presentato un protocollo per la generazione di vettori adenovirali ad alta capacità privi di tutte le sequenze di codifica virale. Il clonaggio dei transgeni contenuti nel genoma del vettore si basa sulle endonucleasi di homing. L'amplificazione del virus nelle cellule produttrici cresciute come cellule aderenti e in sospensione si basa su un virus helper che fornisce geni virali in trans.

Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5

Qui, descriviamo una strategia efficiente e riproducibile per produrre, titolo e batch di controllo di qualità di vettori di virus adeno-associato. Permette all'utente di ottenere una preparazione di vettore con alto-titolo (≥ 1 x 1013 vettoriale genomi/mL) e un'elevata purezza, pronta per l'uso in vitro o in vivo .

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di adenovirus utilizzando il sistema pAdEasy. La tecnologia include la ricombinazione dei plasmidi pAdTrack e pAdEasy-1, l'imballaggio e l'amplificazione dell'adenovirus, la purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura, la titolazione virale e il test funzionale dell'adenovirus.

Un metodo efficiente per la produzione di adenovirus

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione su larga scala di vettori AAV di grado di ricerca utilizzando cellule HEK 293 aderenti coltivate in pile cellulari e purificazione cromatografica di affinità. Questo protocollo produce costantemente &gt;1 x 1013 genomi vettoriali / mL, fornendo quantità vettoriali appropriate per studi su animali di grandi dimensioni.

Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

In questo protocollo, il vettore AAV2 è prodotto co-coltivando cellule di insetti Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) o gene terapeutico e cellule Sf9 infette da BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione. Le particelle AAV vengono rilasciate dalle cellule utilizzando detergente, chiarificate, purificate mediante cromatografia a colonna di affinità e concentrate mediante filtrazione a flusso tangenziale.

Sviluppo del processo per la produzione e la purificazione del vettore adeno-associato al virus (AAV)2 utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente &gt; 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .

Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.

Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293

Impara a costruire, produrre e purificare vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) per terapia genica e vaccinazione. Questo metodo consente trasduzione cellulare efficiente in vitro e in vivo.

Produzione e purificazione di vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 non replicativo

Esplora altri video