Produzione e purificazione di vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 non replicativo

Negli ultimi 15 anni, i vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) hanno dimostrato la loro efficienza nel trasdurre cellule in vitro e in vivo e sono ampiamente utilizzati per la vaccinazione e la terapia genica. Qui descriviamo una procedura per costruire, produrre e purificare vettori CAV2, dando origine a sospensioni virali ad alto titolo.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire, produrre e purificare vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo due. Ciò si ottiene clonando prima il gene di interesse in un plasmide navetta. Il secondo passo consiste nell'ottenere un plasmide genomico ricombinante mediante ricombinazione omologa.

Successivamente, il vitello difettoso ricombinante, due virus prodotti e amplificati in una linea cellulare trans complementante. Il passaggio finale consiste nel purificare e concentrare il virus ricombinante risultante per diverse applicazioni in vivo e in vitro. In definitiva, la microscopia confocale a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare esempi di trasduzione virale nel cervello dei roditori.

Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti come i vettori derivati dall'adnevrosi umana è che non esiste un'immunità preesistente contro il secondo vitello nelle popolazioni umane. Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinazione o della terapia genica, come la valutazione del ruolo delle proteine espresse in specifiche aree cerebrali. Quindi a dimostrare questa procedura saranno May KY e Corin Bergeron.

Due ricercatori post-dottorato dei nostri laboratori Prepararsi per questa procedura un giorno prima della trasfezione seminando cellule DKE one su una piastra a sei pozzetti per far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 in DMEM con glucosio alto contenente il 7% di calore, vitello fetale inattivato, siero di sodio, piruvato, penicillina e streptomicina. Il giorno seguente, le cellule dovrebbero essere confluenti dal 70 all'80% per la trasfezione digerire due microgrammi di pcal GOI il plasmide genomico ricombinante cav due con ASC uno per rilasciare la sequenza non virale del plasmide, controllare il modello di restrizione risultante dallo 0,8% La digestione per elettroforesi su gel agro dovrebbe produrre un frammento di coppia di circa 31 kilobasi contenente il genoma ricombinante e un frammento di coppia di due kilobasi corrispondente alla spina dorsale del plasmide. Mescolare il DNA digerito con 200 microlitri di tampone jet prime e vortex per 10 secondi.

Aggiungere quattro microlitri di jet prime e mescolare vorticando per 10 secondi. Centrifugare brevemente per rimuovere le goccioline e incubare per 10 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia sulle celle DKE one.

Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente la miscela e incubare a 37 gradi Celsius. Una settimana dopo la trasfezione, raccogliere le cellule e il terreno di coltura in una provetta di polipropilene da 15 millilitri. Distruggi le cellule con tre cicli di pensiero di congelamento.

Eliminare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1, 800 volte G.Raccogliere il surnatante e conservare a meno 20 per la successiva propagazione del virus per propagare il virus infettare un monostrato confluente all'80-90% di cellule DKE uno coltivate in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti con 0,5 millilitri del virus contenente surnatante. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora in leggera agitazione Dopo un'ora. Rimuovere l'inoculo e sostituirlo con 1,5 millilitri di DMEM completo contenente il 5% di FCS inattivato a caldo incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre o quattro giorni.

Le cellule devono essere monitorate quotidianamente per la comparsa di un effetto citopatico o CPE. Se non è visibile alcun CPE chiaro. Raccogliere le cellule dopo quattro giorni di coltura e ripetere l'amplificazione virale quando un CPE chiaro colpisce la maggior parte delle cellule.

Di solito dopo due o quattro cicli di amplificazione virale, raccogliere le cellule con il terreno di coltura e congelare e scongelare tre volte come dimostrato in precedenza. Infettare dall'80 al 90% confluente. Le cellule DKE 1 sono cresciute in tre piastre di coltura tissutale di 10 centimetri di diametro utilizzando 1,5 millilitri di virus contenente surnatante per piastra dopo tre o quattro giorni quando il CPE è completo.

Raccogliere le cellule da queste piastre di 10 centimetri di diametro, interromperle con tre cicli di freestyle e cancellare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1.800 volte. G raccogliere il surnatante e conservarlo a meno 20 per l'amplificazione Cav due su larga scala per iniziare la procedura di ingrandimento, infettare dall'80 al 90% monostrati confluenti di cellule DKE, una cresciuta in 40 piastre di coltura tissutale da 10 centimetri di diametro, per ogni piatto utilizzare 0,1 millilitri di virus contenente surnatante diluito in un millilitro di DMEM completo senza FCS, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore sotto lieve agitazione. Dopo tre o quattro ore, aggiungere cinque millilitri di DMEM completo integrato con il 5% di FCS e incubare per tre giorni.

Dopo tre giorni, raccogliere le cellule infette dai 40 piatti da 10 centimetri in tubi di polipropilene da 50 millilitri, le cellule in pellet a 1.200 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Resus sospenderli in 15 millilitri di DMEM medium disrupt cells mediante tre cicli di congelamento-scongelamento. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando a 1.800 volte G per 10 minuti.

Conservare il surnatante a meno 20 prima della purificazione delle particelle virali per la purificazione delle particelle virali. Preparare un gradiente discontinuo di cloruro di cesio in una provetta UltraClear da 14 millilitri. Per prima cosa, versare due millilitri della soluzione di cloruro di cesio a densità più elevata sul fondo del tubo.

Quindi aggiungere lentamente due millilitri della soluzione di cloruro di cesio a bassa densità sopra la prima soluzione. Caricare con cura il surnatante virale sopra il gradiente di cloruro di cesio. Riempire la provetta con olio minerale fino a due o tre millimetri dalla centrifuga superiore in un rotore SW 40 oscillante per un'ora e 30 minuti a 130, 000 volte g e 18 gradi Celsius dopo la centrifugazione.

Due bande bianche sono chiaramente visibili all'interfaccia tra i due strati di soluzione di cloruro di cesio. Utilizzando un ago calibro 21 e una siringa, raccogliere lateralmente la fascia inferiore contenente due particelle mature in cav. Cerca il più possibile di evitare di raccogliere la banda superiore che corrisponde alle particelle virali vuote.

Preparare un gradiente continuo di cloruro di cesio in una provetta trasparente da 14 millilitri mescolando le particelle virali collettive con una soluzione di cloruro di cesio. Riempire la provetta con olio minerale fino a due o tre millimetri dalla centrifuga superiore in un rotore SW 40 oscillante per 18 ore a 130, 000 volte G e 18 gradi. Dopo la centrifugazione, raccogliere il vitello bianco due contenente la puntura fianco a fianco con una siringa come dimostrato in precedenza.

Ancora una volta, cerca di evitare di raccogliere la banda superiore rimanente. Questo dovrebbe essere più facile in questo gradiente continuo che separa meglio le due bande. Il volume totale della sospensione raccolta non deve superare i due millilitri.

Successivamente, equilibrare una colonna cidex G 25 PD 10 con 30 millilitri di PBS. Caricare la sospensione virale sulla colonna e scartare il flusso attraverso l'eluizione con 500 microlitri di frazioni di PBS raccogliere le frazioni da cinque a sette, che di solito contengono le due particelle cav dissalate. Il virus contenente frazioni può essere facilmente identificato perché ci sono benedetto dal profumo.

Infine, aggiungere 150 microlitri di glicerolo agli 1,5 millilitri di sospensione CAV due e conservare in Eloqua a meno 80 gradi Celsius per titolare il cav due mediante diluizione finale, scongelare un'aliquota di virus purificato su ghiaccio ed eseguire una diluizione seriale di dieci volte che va da 10 a meno due a 10 a meno 12 in DMEM libero sierico. Aggiungere 50 microlitri di ciascuna diluizione virale in cinque pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 1,5 volte 10 al quarto DKE, una cellula per ciascun pozzetto, incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per cinque giorni al quinto giorno. Monitorare l'aspetto del CPE post-infezione mediante osservazione microscopica.

I titoli infettivi sono determinati come dosi infettive mediane di colture tissutali utilizzando il metodo statistico read and men prima della produzione di vettori virali. Un genoma CAV ricombinante con una cassetta di espressione per il transgene è costruito utilizzando tecniche standard di biologia molecolare. In primo luogo, il gene di interesse viene clonato in un plasmide shuttle come cassetta di espressione con un promotore precoce del citomegalovirus e un segnale di poliadenilazione affiancato da due sequenze genomiche derivate da due CAV che rappresentano le sequenze bersaglio di ricombinazione a monte e a valle.

In una seconda fase, la cassetta di espressione viene inserita dal plasmide navetta nel genoma CAV due mediante ricombinazione omologa. L'inserimento della cassetta di espressione GOI porterà alla delezione dell'EA e di parte del gene E one B nel genoma ricombinante. Una volta ottenuto il plasmide genomico ricombinante, le particelle virali vengono prodotte utilizzando CAV due cellule E uno a complemento delle cellule DKE 1.

Un chiaro effetto citopatico dovuto alla grande quantità di particelle virali prodotte nelle cellule infette può essere facilmente visualizzato dalla microscopia in campo chiaro o dall'espressione transgenica. Questo esempio è di A GFP che esprime CAV a due vettori. Dopo diversi cicli di amplificazione virale utilizzando cellule DKE one fresche, le particelle virali vengono purificate mediante ultracentrifugazione su gradienti di cloruro di cesio.

Le particelle virali concentrate appaiono come due bande opalescenti all'interno del gradiente di cesio. La banda inferiore corrisponde al cav due ricombinante maturo che dovrebbe essere raccolto. Mentre la fascia superiore contiene particelle vuote non infettive che dovrebbero essere evitate.

Il secondo vettore ricombinante del vitello risultante può essere utilizzato per trasdurre quasi tutti i tipi di cellule in un'ampia varietà di specie, sia in vitro che in vivo. Di seguito è mostrato un esempio applicativo in cui la GFP che esprime CAV due è stata iniettata da stereo taxii in diverse aree del sistema nervoso centrale del topo. Poiché questo protocollo produce titoli elevati e azioni virali pure e pure, l'iniezione di un solo microlitro di GFP diluito PBS che esprime il vettore CAV due nel giro dentato o DG porta a una trasduzione neuronale dal 40 al 50%.

Inoltre, a causa della capacità di C due di essere trasportato retrogrado negli assoni iniezione di due microlitri di PBS diluito GFP che esprime CAV due vettore nello striato consente la trasduzione di quasi l'80% dei neuroni di nigro stri AAL nei subs, nigra pars compacta Dopo i suoi sviluppi. Queste tecniche aprono la strada ai ricercatori nel campo della vaccinologia o delle neuroscienze per esplorare nuovi antigeni e la funzione genica nel cervello in molti modelli animali diversi. Quindi non dimenticare che lavorare con CAF due vettori derivati può essere estremamente pericoloso e precauzionale, come adeguate misure di contenimento e gestione dei rifiuti, compresi i dispositivi di protezione individuale e il lavoro in cappe a flusso laminare in BSL due laboratori dovrebbero sempre essere presi durante l'esecuzione di questa procedura.