Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l'idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di analizzare la flessibilità di conferma nelle proteine e i loro cambiamenti in risposta all'ambiente, al legame con il ligando o alle interazioni proteiche proteiche. Ciò si ottiene preincubando la proteina di interesse in diverse condizioni che si sospetta influenzino la conferma della proteina, come il legame del ligando. La miscela di reazione viene quindi diluita in ossido di deuterio, incubata per diversi intervalli di tempo e successivamente analizzata mediante spettrometria di massa con cromatografia liquida per determinare il grado di incorporazione del deutero nella spina dorsale del peptide.

Gruppi ammidici, poiché le aree protette hanno una ridotta incorporazione di deutero, confrontando gli spettri peptidici dell'esperimento in assenza e presenza di un partner di legame rivela uno spostamento dell'OID degli spettri dovuto alla differenza di peso tra protone e deuterone. Le regioni che mostrano una protezione prominente dopo l'aggiunta di un partner di legame sono potenziali siti di legame. A seconda della copertura della sequenza e della disponibilità di peptidi sovrapposti, i siti di legame possono essere ristretti a pochi amminoacidi.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ripiegamento delle proteine e della dinamica delle proteine, come ad esempio come le proteine si ripiegano, come si dispiegano, come reagiscono a impatti fisici e chimici come l'aumento della temperatura o i metalli pesanti. In che modo il legame simile e le interazioni proteina-proteina possono influenzare la conferma di una proteina. È anche molto importante per lo sviluppo di farmaci proteici per la verifica del corretto ripiegamento e per il controllo generale della qualità.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono incontrare diverse difficoltà. Se la proteina, ad esempio, non è ben digerita dalla pepsina, la copertura della sequenza sarà bassa. Se la proteina è molto incline all'aggregazione, può aggregarsi durante l'incubazione o dopo l'aggiunta del tampone di estinzione e risulterà in basse intensità del segnale nello spettrometro di massa.

In questa dimostrazione, studieremo il legame del chaperone molecolare del lievito, HP 90 al suo chaperone cos Sty one utilizzando la spettrometria di massa a scambio di idrogeno STY one si lega a HP 90 e facilita il legame con il cliente mediante l'inibizione dell'attività degli ABA di HB ninety. Iniziare questa procedura con la preparazione di tamponi, campioni e perline come descritto nel protocollo di testo. Per preparare le colonne per lo scambio di idrogeno ammidico, svitare un lato della colonna di protezione e rimuovere saldamente il filtro.

Avvitare l'imbuto di imballaggio sull'estremità aperta della colonna. Utilizzare un adattatore da 16 pollici per collegare una siringa vuota da cinque millilitri all'uscita inferiore della colonna. Assicurarsi di fissarlo a tenuta di gas alla colonna di protezione.

Applicare alcune gocce di materiale per perline di liquame sulla parte superiore dell'imbuto. Tirare lo stantuffo della siringa per aspirare il liquame attraverso l'imbuto nella colonna di protezione. Applicare altro materiale per perline di liquame sull'imbuto e continuare la procedura fino a quando la colonna di protezione non è completamente riempita con materiale per perline.

Quindi rimuovere l'imbuto prima di posizionare saldamente il filtro e l'anello del filtro sull'estremità aperta. Avvitare il tappo della colonna sulla colonna di protezione e rimuovere la siringa dall'altro lato. Chiudere entrambe le estremità delle colonne di protezione con i tappi.

Per evitare l'essiccazione del materiale della colonna, è necessario impostare il sistema per la spettrometria di massa a scambio di idrogeno. Per prima cosa collegare la colonna trappola alla cromatografia liquida ad alte prestazioni o al sistema HPLC. Equilibrare la colonna impostando la portata della pompa A a 0,4 millilitri al minuto con lo 0,1% di acido formico come solvente.

Dopo aver calibrato lo spettrometro di massa, collegare l'uscita dell'HPLC alla sorgente dello spettrometro di massa. Per determinare prima i peptidi peptici, collegare al sistema la colonna Pepin e poi la colonna analitica. Imposta i parametri per la cromatografia e la spettrometria di massa nel software di controllo scegliendo il tipo di gradiente e il metodo di spettrometria di massa.

Scegliere un gradiente lungo per garantire una buona risoluzione cromatografica. Abilitare gli spettri di massa tandem sullo spettrometro di massa. Preparare da 100 a 200 pomo di proteina da shock termico 90 o HSP 90 in 100 microlitri di tampone H due L.

Aggiungere 100 microlitri di tampone di quench e mescolare pipettando su e giù. Iniettare il campione da 200 microlitri nella porta di iniezione della valvola di iniezione con una siringa Hamilton. Portare la valvola di iniezione in posizione di iniezione e avviare il programma cromatografico.

Successivamente, identificare i peptidi peptici della proteina da shock termico 90 cercando in un database i peptidi risultanti. Ridurre la temperatura del sistema a zero gradi Celsius aggiungendo acqua ghiacciata. Ripetere questo passaggio senza spettrometria di massa tandem e con il gradiente che verrà utilizzato per l'esperimento di scambio di idrogeno vero e proprio.

Per la proteina da shock termico 90 e STI one, utilizzare un gradiente di 10 minuti dal 90% di solvente, un 10% di solvente B al 45% di solvente, un 55% di solvente B, determinare i tempi di ritenzione dei peptidi identificati nel gradiente utilizzato e creare un elenco comprendente la sequenza peptidica, la carica peptidica, lo stato e il tempo di ritenzione. Questo sarà utilizzato per identificare ciascun peptide dopo esperimenti di scambio di idrogeno. Per identificare le interfacce di interazione proteina-proteina, è necessario impostare prima il metodo della spettrometria di massa e gradiente.

Nel software di controllo, utilizzare un gradiente lineare di 10 minuti dal 90% di solvente, dal 10% di solvente B al 45% di solvente. Un solvente B carica al 55% un metodo di spettrometria di massa ottimizzato per il rilevamento tra 300 e 1.500 rapporti massa/carica, anche se la maggior parte dei peptidi sarà inferiore al rapporto massa/carica di 1000. Impostare la valvola di iniezione in posizione di carico e la valvola a sei vie.

In posizione di carico e dissalazione, impostare la portata della pompa di carico su 0,4 millilitri al minuto. Dopo aver eseguito il riferimento invariato e il campione di controllo al 100% come descritto nel protocollo di testo, preparare da 20 a 100 pico mole di proteina da shock termico 90 in un volume da uno a cinque microlitri. Aggiungere un tampone di ossido di deuterio regolato alla temperatura per portare il volume del campione fino a 100 microlitri e incubare per l'esatto periodo di tempo precedentemente definito come descritto nel protocollo di testo.

Quando si determina l'intervallo dinamico di scambio, aggiungere 100 microlitri di ghiaccio freddo, spegnere il tampone e pipettare su e giù due volte, iniettare rapidamente i 200 microlitri nella valvola di iniezione dell'HPLC. Portare la valvola di iniezione in posizione di iniezione e avviare immediatamente il programma cromatografico. Dopo due minuti, portare la valvola a sei vie dalla posizione di carico di desalinizzazione alla posizione di eluizione.

Fallo per ogni proteina individualmente per determinare l'incorporazione del deuterone in ciascun peptide in assenza della proteina interagente per determinare la superficie di interazione mescolare la proteina da shock termico 90 con un eccesso almeno doppio di STI uno per spostare l'equilibrio allo stato legato, incubato alla temperatura desiderata fino a quando la formazione del complesso non è all'equilibrio. Dopo l'incubazione, aggiungere un tampone di ossido di deuterio regolato alla temperatura per portare il volume del campione fino a 100 microlitri e incubare per un periodo di tempo esattamente definito. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di estinzione ghiacciato e pipettare su e giù due volte, iniettare rapidamente la proteina e correre come prima.

Analizza i dati acquisiti con un software adatto e utilizza i tempi di ritenzione determinati per trovare ogni peptide nell'analisi. Calcolare l'OID della distribuzione isotopica per la proteina immodificata e per gli esperimenti di scambio idrogeno, confrontare l'incorporazione di deutero della sola proteina bersaglio e con l'eccesso del partner di legame. Questo può essere fatto automaticamente con software commerciali o manualmente con il programma di fogli di calcolo M, l'interazione diretta proteina proteina tra HS P 90 e STI one è stata testata confrontando gli spettri peptidici STI one in assenza e presenza HS P 90 dopo la marcatura dell'ossido di deuterio.

Il grafico delle differenze risultante rivela che la maggior parte dei peptidi nel TPR 2 A e nel TPR 2 B mostrano una forte protezione in presenza di HS P 90, indicando che queste regioni interagiscono con HS P 90. La protezione in TPR due A può essere facilmente razionalizzata dalla struttura cristallina di STY uno TPR due A TPR due B in complesso con un peptide HS P 90, che è colorato in base al numero di protoni amiloidi protetti dall'incorporazione di DEUTERO. Una protezione così chiara nelle interazioni proteina-proteina non è sempre osservata.

La protezione in HSP 90 in presenza di IST non è così pronunciata e non localizzata come in IST. Tutti i peptidi mostrano una protezione leggermente aumentata dall'incorporazione del deutero. Qui è mostrata una rappresentazione a fumetti del lievito HS P 90 colorato in base al numero di protoni amli protetti dall'incorporazione del deuterone, STY uno stabilizza HS P 90 a livello globale poiché nessuna regione della proteina mostra più flessibilità nella sua presenza.

Non è chiaro se questa ridotta incorporazione di deuterone derivi dall'interazione diretta con l'orzaiolo o da effetti allosterici. Alla conferma della marcatura continua HSP 90, lo scambio di idrogeno e la spettrometria di massa sono stati utilizzati per studiare la dinamica di diverse regioni proteiche. Qui sono mostrati gli spettri dei peptidi da 43 a 62 dal dominio di legame nucleotidico di HSP 90.

In presenza e in assenza di STI one, gli spettri peptidici mostrano un'incorporazione di deuterio dipendente dal tempo che aumenta con l'incubazione più lunga. Il grado di protezione cambia durante il tempo di incubazione, mostrando una differenza maggiore nei momenti di incubazione più brevi e tassi di cambio quasi simili nel punto temporale più lungo. Ciò suggerisce un grado inferiore di stabilizzazione o una regione di interazioni dinamiche con frequenti dissociazioni e dissociazioni.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere le condizioni meticolosamente costanti e di avere tutto pronto prima di iniziare la reazione di scambio. Seguendo questa procedura, altri metodi possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive come la posizione dei siti di interazione nei complessi proteici.