Utilizzo di Caenorhabditis elegans come sistema modello per studiare l'omeostasi proteica in un organismo multicellulare

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti nel metazoo geneticamente trattabile CENO R elegance è quello di monitorare il misfolding delle proteine a tre livelli, l'organismo, le cellule e le proteine. I fenotipi comportamentali, come la motilità o la termoresistenza, funzionano come letture dei cambiamenti nell'omeostasi delle proteine a livello dell'organismo, sensibili alla temperatura o che si verificano naturalmente. Le proteine meta-stabili vengono utilizzate per seguire la localizzazione delle proteine mis, che può essere associata al misfolding delle proteine.

Un saggio di digestione parziale ex vivo monitora direttamente la stabilità delle proteine. I risultati possono mostrare cambiamenti nella capacità di proteostasi a diverse temperature di coltivazione in base al test di termoresistenza, alla microscopia a immunofluorescenza e all'analisi del sangue occidentale. Queste procedure saranno dimostrate da studenti laureati nel mio laboratorio.

Il test comportamentale sarà dimostrato da ish ido e Shai dimostrerà l'immuno colorazione e ANA flunking e sheron dimostreranno la digestione parziale. Questo protocollo per la misurazione della tolleranza alla temperatura è accompagnato da fasi preparatorie per la sincronizzazione degli animali e da un test del movimento. Entrambi sono descritti nel protocollo di testo, inizia raccogliendo repliche contenenti almeno 20 animali sincronizzati.

In 24, ben suonato pozzetti contenenti 450 microlitri di tampone per lo shock termico. Integrare ogni pozzetto con nove microlitri di citossina. Ora trasferisci la piastra in un bagno riscaldato.

Lo shock termico, la temperatura e la durata dipendono fortemente dalle condizioni di crescita. In particolare, la temperatura di coltivazione segna la sopravvivenza dell'animale monitorando il suo assorbimento della matrice. Utilizzando uno stereoscopio fluorescente con filtro TXR, gli animali che prendono il dado sono morti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le vacche, la tolleranza mediante punteggio manuale è l'uso della lettura visiva della mortalità degli animali, che rende questo saggio molto più veloce e riproducibile. Nella fase richiesta, trasferire almeno 30 animali in una provetta da microcentrifuga contenente tampone M nine. Lavare gli animali alcune volte con M nove eseguendo brevi passaggi di centrifugazione a bassa velocità e Resus sospendendoli in M nove.

Quindi posizionare i tubi sul ghiaccio per qualche minuto per raffreddarli. Una volta raffreddate, rimuovere il liquido in eccesso e incubare le provette. In 500 microlitri di ghiaccio freddo, aldeide 4%PARAFORM.

Il tempo di incubazione deve essere calibrato per ogni proteina esaminata e dovrebbe essere di circa cinque-30 minuti a temperatura ambiente. Ora, lavare gli animali fissati tre volte con PBS tween a pH 7,2 mediante centrifugazione. Le centrifugazioni vengono sempre eseguite a 3000 giri/min per uno o due minuti, se non diversamente specificato.

Nella cappa, rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di soluzione di mercaptoetanolo a fascio. Quindi incubare gli animali a 37 gradi Celsius durante la notte con un leggero dondolio il giorno successivo nel cappuccio. Lavare gli animali tre volte con PBST per centrifugazione e Resus.

Terminare il lavaggio con 50-100 microlitri di PBST e rimuovere la maggior parte di questo PBST dopo un'altra centrifugazione. Successivamente, aggiungere da 100 a 150 microlitri di soluzione di collagenasi e incubare gli animali a 37 gradi Celsius con una forte agitazione. Utilizzare un miscelatore termico o un'incubatrice a scuotimento.

Dopo cinque minuti, iniziare a effettuare controlli periodici sotto uno stereomicroscopio. Quando un quinto degli animali è rotto, fermare la reazione posizionando il tubo sul ghiaccio. Questo passaggio è altamente sensibile.

La durata del trattamento dipende dalle condizioni di fissazione e può variare notevolmente da un ceppo all'altro. Un'incubazione prolungata potrebbe portare alla completa degradazione degli animali. Le condizioni devono essere calibrate prima di ogni lotto di enzimi e la degradazione deve essere monitorata attentamente.

Quindi, lava gli animali due volte in PBST. Raccogliere gli animali mediante centrifugazione e rimuovere la maggior parte del PBST. Quindi aggiungere un millilitro di una soluzione BA seguita da incubazione con un leggero dondolo per un'ora a temperatura ambiente, raccogliere gli animali mediante centrifugazione e risospenderli in 200 microlitri di un b, A.Ora aggiungere l'anticorpo primario e iniziare un'incubazione notturna con un leggero dondolo a temperatura ambiente.

Questi parametri devono essere calibrati. Successivamente, lavare gli animali mediante centrifugazione. Risospenderli in un millilitro di b, A e incubarli mescolandoli delicatamente per 15 minuti a un'ora a temperatura ambiente.

A questo punto, è possibile aggiungere un'aggiunta opzionale di colorante fluorescente. Successivamente, ripetere il lavaggio con tampone BA altre tre volte e terminare i lavaggi con Resus sospendendo 100 microlitri di BA con l'anticorpo secondario appropriato marcato in fluorescenza a una diluizione da uno a 100. Incubare i campioni con oscillazione per diverse ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce per eliminare il secondario.

Eseguire tre lavaggi con a, b, a. Quindi montare gli animali sui vetrini prima con Resus, sospendendoli in 10 microlitri di a b, a, e poi utilizzando una pipetta a foro largo per trasferire uno o due microlitri di campione su ciascun vetrino, aggiungere un volume uguale di terreno di montaggio e coprire il vetrino. Sigillare delicatamente il vetrino con lo smalto per unghie.

I vetrini possono essere conservati a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per periodi prolungati. In genere, le persone che non conoscono questo protocollo avranno difficoltà perché il protocollo è lungo e include molti passaggi che possono influire sulla sua efficienza, rendendo difficile la risoluzione dei problemi. Inizia raccogliendo gli animali da piastre di circa 1560 millimetri in uno o due millilitri di tampone M nove.

Gli animali non devono essere sovraffollati. Lavare gli animali alcune volte con tampone M nine centrifugando e sospendendo nuovamente gli animali. Dopo la centrifuga finale, sospendere nuovamente gli animali in 100 microlitri di tampone M nine.

Quindi congelare gli animali e, utilizzando un pestello e un trapano refrigerati, macinare il campione mentre è in ghiaccio. Spesso si ferma per controllare se gli animali sono sufficientemente macinati. Una volta che gli animali sono completamente schiacciati, stimare il volume dell'estratto di vermi.

Quindi aggiungere un volume uguale di due soluzioni di lisi di vermi e incubare il campione su ghiaccio per 15 minuti. Quindi, rimuovere i detriti mediante un ciclo di centrifugazione raffreddato e trasferire il surnatante in una provetta per microfughe pulita. Dopo un test di Bradford, diluire il campione a 3-3,5 milligrammi di proteine per millilitro.

Quindi aggiungere la soluzione di tripsina mimetica raffreddata appena preparata in un rapporto da uno a 1200. A questo punto, impostare il campione in incubazione per un'ora. Durante l'incubazione, prelevare periodicamente aliquote da 20 microlitri e mescolarle immediatamente con il tampone SDS, seguito da cinque minuti a 96 gradi Celsius.

Esaurisci i campioni e segui con un'analisi del sangue occidentale per determinare la stabilità relativa della proteina. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non aggiungere cocktail di inibitori della proteasi al campione digestato e invece manterremo rapidamente e i campioni sul ghiaccio. La mutazione E 781 K ts nel chaperone muscolare su 45 influenza fortemente il ripiegamento e l'assemblaggio della miosina e quindi influenza la motilità animale.

Quando questi mutanti sono stati cresciuti a temperature superiori a 20 gradi Celsius, sono stati completamente paralizzati, ma non a 15 gradi Celsius. Quando gli animali selvatici allevati a 25 gradi Celsius sono stati sottoposti a uno shock termico prolungato, la maggior parte è sopravvissuta. Mentre solo il 30% è sopravvissuto se allevato a 15-20 gradi Celsius per monitorare i modificatori efficaci sulla risposta allo shock termico, le condizioni di stress di controllo sono state elevate a un tasso di sopravvivenza del 70% per gli animali di tipo selvatico.

Gli animali sono stati esposti a uno shock termico di 37 gradi Celsius per sei ore. Il primo giorno dell'età adulta, la sopravvivenza è stata valutata con il test di captazione dell'arancio citato. Gli animali morti sono indicati da frecce bianche e gli animali vivi da frecce gialle.

La localizzazione di diverse proteine meta-stabili è stata visualizzata utilizzando anticorpi specifici. Ad esempio, i parametri sono localizzati in modo errato in assemblaggi policristallini invece che in sarcomeri muscolari in condizioni restrittive. Allo stesso modo, la miosina TS forma filamenti disorganizzati invece delle strutture filamentose altamente ordinate alla temperatura restrittiva.

Animali che esprimono varie proteine mutanti TS co-espresse con myo three. La GFP ha mostrato un rapido deterioramento nell'organizzazione del miofilamento, come rilevato dal monitoraggio delle variazioni della GFP nella miosina, la conferma può riflettere i cambiamenti nella capacità di ripiegamento delle cellule muscolari. Il modello di frammentazione proteolitica della catena pesante della miosina, co-espresso con UNC 45 Ts, mostra caratteristiche distinte rispetto al profilo di digestione della miosina da animali selvatici, a sostegno dell'affermazione che il ripiegamento della miosina è influenzato da UNC 45.

Perdita di funzionalità. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione della proteostasi nell'eleganza del mare, può essere applicato anche in altri sistemi come diversi organismi modello.