FtsZ polimerizzazione saggi: protocolli semplici e considerazioni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di determinare le condizioni adatte per studiare FTSZ, polimerizzazione e attività utilizzando semplici saggi e attrezzature. Ciò si ottiene eseguendo saggi di sedimentazione polimerica FDSC in varie condizioni per trovare le condizioni adatte in cui FDSZ polimerizza. In una seconda fase, eseguiamo saggi di diffusione della luce per studiare la polimerizzazione FDSZ in tempo reale.

Successivamente, eseguiamo saggi di idrolisi GTP per determinare l'attività g gtpa associata alla polimerizzazione di FT SC. Si ottengono risultati che mostrano quali condizioni sono più adatte per lo studio della FTSC di una specifica fonte batterica in base alla sedimentazione, alla diffusione della luce e all'idrolisi del GTP. Le tecniche qui mostrate sono facili da eseguire in qualsiasi laboratorio e forniranno una rapida idea delle capacità di polimerizzazione di specifici FT a z. Scopriamo che la scelta del giusto tampone è particolarmente importante quando si lavora con FTAZ in presenza di altre proteine, dimostrando che la tecnica sarà EVA crawl, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per iniziare, aggiungere cinque microlitri di cloruro di magnesio da 100 millimolari e 12 micromolari di proteine batteriche, FDSC e/o SEP F in uno dei tamponi di polimerizzazione scelti che hanno vari valori di pH e composizioni come descritto nel protocollo di testo allegato. Successivamente, posizionare le provette in un incubatore con funzione di agitazione e incubare i campioni per due minuti a 30 gradi Celsius e 300 giri/min. Una volta che i tubi sono stati accuratamente miscelati, iniziare la polimerizzazione aggiungendo un microlitro di miscela GTP o GDP da una soluzione madre da 100 millimolari in modo che la concentrazione finale sia di due millimolari.

Quindi riposizionare i campioni nell'incubatore di agitazione per altri 20 minuti. Quindi, far girare i tubi a temperatura ambiente per 15 minuti a 20.000 giri/min utilizzando un rotore TLA 55 o un equivalente 24.600 Gs se si utilizza qualcos'altro. Una volta terminata la centrifuga, trasferire i surnatanti in provette pulite e conservare i pellet per dopo.

Prelevare 20 microlitri di surnatanti trasferiti e mescolarli in una provetta separata con 20 microlitri di tampone campione due volte concentrato. Fissare i tappi e far bollire i campioni per 10 minuti a 98 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di tampone campione due volte concentrato a ciascuna frazione di pellet precedentemente messa da parte e sospendere i polimeri facendo bollire i campioni per 10 minuti a 98 gradi Celsius.

Una volta che i campioni hanno terminato l'ebollizione, aggiungere altri 50 microlitri di acqua demineralizzata alle provette contenenti i pellet. Quindi, caricare 10 microlitri di surnatanti e pellet da ciascun campione fianco a fianco su un gel di pagina SDS al 10% ed eseguire il gel a 150 volt. Una volta completato il gel, rimuovere il gel e macchiarlo con kumasi blu brillante G two 50.

Quindi visualizza il gel e quantifica la proteina utilizzando la citometria come descritto nel protocollo di testo allegato. Per prima cosa accendi uno spettrometro fluorescente e lascia che la lampada si riscaldi per diversi minuti per evitare fluttuazioni termiche. Inoltre, accendi un bagnomaria circolante e imposta la temperatura dell'acqua a 30 gradi Celsius per mantenere la camera di circolazione a una temperatura costante.

Man mano che il sistema si riscalda, definire i parametri operativi dello spettrometro. Impostare l'alta tensione del rivelatore a 300 volt e le lunghezze d'onda di emissione ed eccitazione a 350 nanometri con una larghezza di fenditura di quattro nanometri. Quindi programmare il protocollo di acquisizione dati scegliendo un'acquisizione basata sul tempo con una durata di 3.600 secondi.

Pulire accuratamente un vete a fluorescenza da 200 microlitri con una lunghezza del percorso di un centimetro forcicandolo in una soluzione detergente a bagnomaria per cinque minuti. Successivamente, preparare 294 microlitri di una miscela master per ciascuno dei nove tamponi di polimerizzazione descritti nel protocollo di testo allegato, ciascuno con 10 millimolari di cloruro di magnesio e 12 micromolari FDSE come concentrazioni finali calcolate per 300 microlitri. Quindi agitare brevemente le miscele trasferiscono 196 microlitri del primo tampone di polimerizzazione al veterinario.

Posizionarlo nello spettrometro e incubare per due minuti per portare la temperatura del campione fino a 30 gradi Celsius. Dopo due minuti, avviare l'acquisizione dei dati e attendere 90 secondi per verificare che il segnale sia stabile. Quindi aggiungere quattro microlitri di 100 millimolari GTP o GDP.

Mescolare il campione e continuare l'acquisizione dei dati per un'ora intera. Ripetere questi passaggi per ogni buffer elencato. Preparare 1,5 millilitri di GTP due millimolari in un tampone di polimerizzazione scelto.

Preparare anche una diluizione standard del fosfato nell'intervallo da zero a 40 micromolari nello stesso tampone. Quindi, preparare il reagente di lavoro verde malachite come descritto nel kit di biodosaggi. Quindi comporre quattro master mix con un volume totale di 360 microlitri ciascuno: il master mix uno contiene FDSZ derivato da B subtilis e il master mix due contiene FDSE derivato da e coli.

Le master mix tre e quattro sono utilizzate come controlli e contengono EDTA al posto del cloruro di magnesio. Pipettare successivamente aliquote da 20 microlitri delle miscele master e degli standard di fosfato. Nella piastra A-Q-P-C-R a 96 pozzetti in modo che ci siano 16 pozzetti per ogni miscela master e gli standard di fosfato disposti come mostrato qui.

Pipettare 180 microlitri di GTP da due millimolari fino all'ultima corsia della piastra. Quindi posizionare la piastra in una macchina per PCR. Eseguire un programma con un singolo ciclo impostato a 30 gradi Celsius per 40 minuti.

In una seconda pipetta a piastra da 96 pozzetti, aliquote da 20 microlitri del reagente di lavoro verde malachite in pozzetti, da uno a H 10. Quindi a 60 microlitri del tampone di polimerizzazione dell'esperimento si afferma che da A uno a H otto, quindi a 20 microlitri della soluzione di GTP a due millimolari nei pozzetti in ciascuna corsia della piastra. Uno agli intervalli predeterminati, come mostrato qui, per esaminare la reazione in vari punti temporali.

Versare le miscele su e giù per mescolarle dopo 30 minuti, iniziando dalla corsia uno nella piastra uno, trasferire 20 microlitri dalla corsia uno della piastra uno nella corsia uno della piastra due e pipettare su e giù per mescolare. Questo è il punto di partenza dello sviluppo del colore verde malachite per la reazione di 30 minuti dopo 30 minuti e mezzo, trasferire 20 microlitri dalla corsia due della piastra uno alla corsia due della piastra due e mescolare. Questo è il punto di partenza dello sviluppo del colore verde malachite per la reazione di 20 minuti.

Ripetere questi passaggi con le restanti corsie da tre a sette a intervalli di 32 dopo 33 minuti e mezzo a 20 microlitri di GTP per raggiungere la corsia otto sulla piastra uno e mescolare. Quindi trasferire 20 microlitri nella corsia otto sulla seconda piastra e mescolare. Questo rappresenta la reazione al minuto zero ed è il punto di partenza per lo sviluppo del colore verde malachite.

Dopo 34 minuti, aggiungere 80 microlitri dalla corsia nove della piastra uno contenente lo standard di fosfato alla corsia nove della piastra due e mescolare dopo 34 minuti e mezzo, trasferire 80 microlitri dal secondo standard di fosfato nella corsia 10 della prima piastra alla corsia 10 della piastra due e mescolare. Quindi rimuovere tutte le bolle d'aria dai campioni e incubare la piastra a temperatura ambiente per altri 25 minuti e mezzo. Dopo l'incubazione.

Posizionare la piastra in un lettore di piastre a 96 pozzetti a partire da 60 minuti dall'inizio dell'esperimento. Misurare la lastra a 630 nanometri ogni 30 secondi per cinque minuti in modo da prendere 10 punti temporali. La prima misura della lastra corrisponderà alla corsia uno, la seconda alla corsia due, e in modo che ogni corsia abbia avuto esattamente lo stesso tempo per lo sviluppo del colore verde malachite.

Successivamente, calcolare il fosfato libero in ogni campione utilizzando la curva di calibrazione standard del fosfato e tracciare i dati come rilascio di fosfato nel tempo. Quindi calcolare l'attività di idrolisi F-D-S-Z-G-T-P dall'intervallo lineare della curva. Qui sono mostrate le percentuali di SEP F e FDSZ nei pellet dei campioni.

FDSZ è stato recuperato nel pellet al di sopra dei livelli di fondo solo quando nel campione erano presenti anche SEP F e GTP. L'esatta stechiometria di SEPPE e FDSZ in questi tubuli non è nota, ma questi risultati suggeriscono che c'è più seppe presente che FDSZ. La diffusione della luce di FDSZ da B subtilis ed E coli è mostrata qui, assemblata in presenza di due millimolari di GTP nel tampone di cloruro di potassio da 50 millimolari.

F-D-S-E-B-S fornisce un segnale di diffusione della luce da 20 a 40 volte superiore rispetto a FDSC EC a seconda del pH tampone. È interessante notare che l'aumento della concentrazione di cloruro di potassio nel tampone non ha influenzato significativamente il segnale di diffusione della luce di F-D-S-Z-E-C, ma il segnale di F-T-S-Z-B-S è diminuito di circa 80 volte a pH 7,5, 30 volte a pH 6,8 e 45 volte a pH 6,5 in 300 millimolari di cloruro di potassio rispetto ai tamponi con 50 millimolari di cloruro di potassio. L'attività di idrolisi del GTP di FDSZ è stata misurata in diverse condizioni tampone utilizzando un saggio colorimetrico per il fosfato libero.

È stato riscontrato che l'attività GTPS di FT SZ aumenta con l'aumentare della concentrazione di cloruro di potassio in ciascuna delle diverse condizioni di pH. A 50 millimolari di cloruro di potassio, l'attività del gtpa era ridotta a causa del raggruppamento dei filamenti F-D-S-Z-B-S a 50 millimolari. Il cloruro di potassio FDSZ EEC aveva un'attività GTPS da tre a sei volte superiore rispetto a F-D-S-Z-B-S a causa del più rapido smontaggio dei polimeri FDSC EEC.

Infine, la differenza nell'attività di idrolisi del GTP tra F-D-S-Z-B-S e F-D-S-Z-E-C è stata ridotta a 300 millimolari di cloruro di potassio, probabilmente a causa del ridotto raggruppamento dei filamenti F-D-S-Z-B-S. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metalli come l'elettromicroscopia per rispondere a ulteriori domande relative alla struttura dei polimeri fts nel campione.