Visualizzazione del flusso citoplasmatico durante la guarigione delle ferite a singola cellula nello stentor coeruleus

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare il flusso di citoplasma durante la guarigione delle ferite in una singola cellula. Ciò si ottiene raccogliendo prima cellule di stent o SEIU vive da utilizzare come sistema modello per l'avvolgimento cellulare. Il secondo passo è preparare gli strumenti di vetro per tagliare le celle.

Successivamente, le cellule dello stent sarius vengono aperte su una configurazione personalizzata del microscopio che consente la chirurgia simultanea a basso ingrandimento e l'imaging ad alta risoluzione. Il passo finale consiste nell'eseguire l'analisi computazionale del flusso citoplasmatico utilizzando il software di simmetria velo dell'immagine delle particelle. In definitiva, l'imaging ad alta risoluzione del citoplasma viene utilizzato per mostrare la risposta attiva delle cellule durante la guarigione delle ferite.

Questo metodo può essere utilizzato per affrontare domande chiave sulla guarigione cellulare delle ferite, ad esempio se il citoplasma diventa gelatinoso o meno attorno alla regione di un taglio al fine di prevenire perdite nel mezzo circostante. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di manipolazione delle celle, preparazione degli utensili e taglio sono difficili da apprendere in quanto richiedono destrezza manuale. Per iniziare a ottenere lo stent o le cellule di Sirio da un ponte naturale come descritto dal tartaro o da un fornitore commerciale, aggiungere 300 millilitri di stent modificato o terreno adattato da ricette con tartaro e deterrente come descritto nel protocollo di testo allegato.

Mantieni le colture coltivandole al buio a 20 gradi Celsius. Successivamente, coltiva colture di alghe chlamydomonas Rhine Hardy in terreno fosfato di tris acetato. Utilizzando i metodi di coltura standard prima dell'alimentazione, lavare le cellule di clamidomonas facendole girare delicatamente verso il basso, rimuovendo il surnatante e sospendendole nello stent o nel terreno modificato.

Alimenta lo stent da 300 millilitri o le colture di sarius con circa 30 milioni di cellule chm due o tre volte alla settimana quando necessario. Raccogliere lo stent o le cellule per l'intervento chirurgico. Per iniziare, agitare delicatamente la coltura facendo gorgogliare aria attraverso la punta di una pipetta fino a quando le cellule iniziano a staccarsi e a nuotare liberamente.

Quindi catturare le cellule natatorie utilizzando una pipetta da un millilitro dotata di una punta a foro largo per evitare di tranciare le cellule. Una volta raccolte, lasciare che le cellule si depositino. Quindi pipettare lentamente il terreno sopra di essi e aggiungere uno stent o un terreno fresco modificato.

Preparare gli aghi di vetro usati per tagliare le cellule dello stent tenendo due aste di vetro per mescolare in abbondanza e bruciare fino a quando le estremità iniziano a sciogliersi. Quindi toccare le estremità delle due aste fino a quando il vetro fuso non si fonde. Una volta fusi, toglieteli dal fuoco e lasciateli raffreddare per uno o due secondi.

Quindi separali lentamente per fare una rottura netta. Idealmente, questo produrrà un ago lungo circa uno o due centimetri con una punta sottile all'estremità. Se l'ago risultante non è ottimale, rompere la punta nella vita di vetro e riutilizzare le aste.

Quindi, usa un timbro di gomma quadrato rivestito di vaselina per preparare una camera quadrata con pareti di vaselina premendola in un vetrino di vetro. Quindi aggiungere 100 microlitri di stent modificato o terreno contenente il 2% di metilcellulosa al quadrato di vaselina. Posizionare il vetrino coprioggetto preparato in un adattatore di plastica, quindi aggiungere le celle dello stent lavate al vetrino coprioggetti.

Infine, disporre le cellule nella metilcellulosa in modo che siano uniformemente distanziate e siano spinte abbastanza vicino alla superficie del vetrino coprioggetti per essere a fuoco durante l'imaging. Per iniziare, posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio invertito. Quindi rimuovere il corpo del microscopio da dissezione dal suo supporto e determinare la posizione approssimativa in cui dovrà essere posizionato per visualizzare il vetrino a basso ingrandimento dall'alto.

Quindi, costruisci un microscopio a due piani aggiungendo una scatola di cartone con la spaziatura desiderata tra l'oculare del microscopio invertito e il cannocchiale da dissezione. Fissare la scatola in posizione con del nastro adesivo da laboratorio in modo che possa essere facilmente rimossa Al termine dell'esperimento, assicurarsi che il campione sia nel campo visivo e a fuoco senza dover spostare l'oscilloscopio da dissezione Dopo averlo collegato, tenere l'endoscopio da dissezione contro la scatola e fissarlo alla scatola con del nastro adesivo da laboratorio. Quindi, impostare il microscopio invertito utilizzando l'ottica DIC posizionando un obiettivo ad aria 20x.

Inoltre, assicurati di utilizzare un condensatore DIC a lunga distanza di lavoro per fornire spazio sufficiente per eseguire la microchirurgia dall'alto. Quindi metti a fuoco le cellule con il microscopio invertito con tutto preparato e a fuoco da entrambi i lati. Inizia ad acquisire immagini a una frequenza di fotogrammi di due immagini al secondo, utilizzando una fotocamera CCD 12 12 x 5.

Quindi tagliare la cella usando l'ago di vetro. Cattura il modello di flusso citoplasmatico iniziale e osserva tutte le fasi del processo di ferita e guarigione delle ferite. Terminare l'acquisizione quando la cellula ha ripreso l'aspetto normale o ha ripreso la motilità attiva.

Per iniziare, scarica PIV lab, un pacchetto MATLAB per misurare il flusso citoplasmatico utilizzando la simmetria veloc dell'immagine delle particelle. Quindi, carica lo stack di immagini TIFF per ogni sequenza video nel programma di simmetria veloc dell'immagine particellare all'interno del manuale MATLAB. Generare manualmente una maschera per ogni pila di immagini per mascherare le regioni dei dati grezzi al di fuori del corpo dello stent.

Quindi imposta PIV lab per utilizzare l'impostazione della trasformata di Fourier veloce e una dimensione del contenitore di 64 per 64 pixel, che suddividerà i pixel in ogni fotogramma in pixel quadrati più grandi. Eseguire quindi PIV lab per calcolare le correlazioni incrociate tra i pixel in ogni fotogramma con i pixel vicini. Nel fotogramma successivo, questo produrrà un vettore di flusso dipendente dal tempo centrato su ogni pixel di curvatura, che ha la stessa risoluzione temporale dei dati grezzi.

Quindi calcola le medie temporali dell'output del campo vettoriale risultante per confrontare i dati presi con lo stent prima del taglio e durante la guarigione della ferita. Inoltre, calcola gli istogrammi delle velocità del flusso per studiare l'intensità del flusso e la variazione della velocità in un dato pixel nel tempo per studiare le fluttuazioni del flusso. Quando si esegue l'imaging delle sequenze con lo stent o la cellula tagliati a metà, calcolare il flusso totale del citoplasma nel corpo cellulare vero e proprio moltiplicando la velocità media del flusso per l'area della sezione trasversale della base della bolla del citoplasma extracellulare.

Qui viene mostrata l'imaging dal vivo di uno stent o di una cellula mentre viene tagliata e disgregata con un ago di vetro. Dopo il taglio, una notevole quantità di citoplasma è stata estratta dal corpo cellulare principale, ma rifluisce rapidamente nella cellula. Seguendo questa procedura, possono essere aggiunti inibitori chimici per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali componenti del citoscheletro potrebbero contribuire al movimento citoplasmatico durante la guarigione dello stent o della ferita.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare gli strumenti per il taglio dello stent sulle nostre cellule e di come visualizzare il flusso citoplasmatico durante il processo di taglio e guarigione della ferita all'interno della singola cellula gigante.