Stabilire la concentrazione battericida minima di un agente antimicrobico per cellule planctoniche (MBC-P) e cellule biofilm (MBC-B)
2 gennaio 2014
Questo protocollo consente un confronto diretto tra resistenza planctonica e biofilm per un ceppo batterico che può formare un biofilm in vitro utilizzando una piastra microtitere a 96 pozzoli. I batteri planctonici o biofilm sono esposti a diluizioni seriali dell'agente antimicrobico di scelta. La vitalità è dimostrata dalla crescita sulle piastre di agar.
Questa procedura confronta direttamente la resistenza al planctonico e al biofilm per un ceppo batterico che può formare un biofilm. Innanzitutto, stabilire un biofilm, reintegrare il terreno e applicare la diluizione seriale dell'agente antimicrobico scelto. Quindi lasciare che le cellule si riprendano in un terreno fresco.
Ora test per la vitalità delle cellule mediante placcatura su coclea LB. In definitiva, la determinazione della concentrazione battericida minima di cellule planctoniche e di biofilm viene utilizzata per mostrare l'aumento della resistenza che deriva dalla crescita in un biofilm. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché contaminano i pozzi adiacenti o non riescono a lasciare che i rebbi del dispositivo a più punte si raffreddino abbastanza da non uccidere i batteri.
La coltura, il ceppo di batteri di tipo selvatico e mutante per 16 ore in un terreno ricco a 37 gradi Celsius, diluisce le colture sature durante la notte in un terreno fresco come M 63, terreno minimo, integrato con magnesio, solfato e arginina. Poi Eloqua. 100 microlitri per pozzetto.
Assegnando 24 pozzetti per ogni ceppo, incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius. Quindi, preparare 10 soluzioni stock di una serie di diluizione di antibiotici per sette pozzetti e conservare in ghiaccio. Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere il surnatante esaurito che contiene cellule planctoniche.
Quindi aggiungere 90 microlitri di M 63 a tutti i pozzetti e aggiungere 10 microlitri della soluzione madre antibiotica appropriata al controllo senza antibiotici. Bene, per ogni replica e varietà, aggiungi 10 microlitri di acqua. Incubare la piastra per microtitolazione per 24 ore a 37 gradi Celsius.
Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere il surnatante esaurito che contiene cellule planctoniche. Aggiungere 115 microlitri di M 63 a tutti i pozzetti e continuare a far crescere le colture per 24 ore. A 37 gradi Celsius.
Etichettare una libbra di piastra della coclea per metà 96. Piastra per microtitolazione per sterilizzare il dispositivo a più punte, immergerlo in etanolo al 100% e passare i rebbi sulla fiamma libera di un bruciatore bunsen. Lasciate raffreddare leggermente i rebbi.
Utilizzando le punte dei rebbi. Trasferire la coltura planctonica da ciascun pozzetto della piastra per microtitolazione alla superficie di una piastra a coclea LB. Posizionare le piastre della coclea LB a 37 gradi Celsius per 16 ore.
Quindi determinare visivamente il limite per la crescita batterica come la concentrazione battericida minima della coltura antibiotica, il tipo selvatico e il ceppo mutante di batteri per 16 ore in un terreno ricco a 37 gradi Celsius, diluire le colture notturne sature da uno a 100 in terreno fresco per i saggi di resistenza agli antibiotici a ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Aggiungere 90 microlitri di diluizione batterica. Ora per esporre le cellule planctoniche ad un gradiente di concentrazione di antibiotico.
Inizia con 10 soluzioni stock di una serie di diluizioni di antibiotici come la tobramicina micina. Aggiungere 10 microlitri di gambi antibiotici come da disegno sperimentale. Quindi aggiungere 10 microlitri di acqua ai pozzetti di controllo senza antibiotici per ogni replica e ceppo.
Incubare la piastra per microtitolazione per 24 ore a 37 gradi Celsius per individuare le cellule vive. Inizia etichettando una piastra a coclea LB per ciascuna metà di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Sterilizzare il dispositivo a più punte fiammando con etanolo al 100%.
Ripeti una volta. Quindi, utilizzando il dispositivo a più punte, trasferire circa tre microlitri di coltura planctonica da ciascun pozzetto della piastra per microtitolazione alla superficie di una piastra a coclea LB. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16 ore.
Quindi determinare la concentrazione battericida minima dell'antibiotico identificando a occhio il cutoff per la crescita batterica. In questo esperimento, i due diversi saggi di concentrazione minima BATTERICIDA sono stati utilizzati per confrontare la sensibilità del PA 14 wild type con un ceppo mutante privo di resistenza agli antibiotici. Gene NDVB.
Qui, sono state misurate le concentrazioni battericide minime dell'antibiotico tobramicina per il biofilm. L'MBCB per PA 14 è di 100 microgrammi per millilitro rispetto a 12,5 microgrammi per millilitro per il mutante. Al contrario, le concentrazioni battericide minime di tobramicina per le cellule planctoniche erano di otto microgrammi per millilitro sia per PA 14 wild type che per mutante.
Una volta padroneggiato, l'NBCB può essere svolto in circa un'ora, suddiviso in cinque giorni.
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Panoramica
Questo protocollo consente un confronto diretto tra la resistenza planctonica e quella in biofilm per un ceppo batterico in grado di formare un biofilm in vitro, utilizzando una piastra microtitolatrice a 96 pozzetti. La vitalità dei batteri planctonici o in biofilm viene valutata dopo l'esposizione a diluizioni seriali di un agente antimicrobico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Resistenza agli antimicrobici
- Ricerca sui biofilm
Sfondo
- I biofilm sono comunità di batteri che mostrano un'aumentata resistenza agli agenti antimicrobici.
- Comprendere le differenze di resistenza tra lo stato planctonico e quello di biofilm è fondamentale per strategie di trattamento efficaci.
- Questo studio utilizza una piastra microtitolatrice a 96 pozzetti per un confronto efficiente.
- La contaminazione e gli errori procedurali sono sfide comuni per i nuovi ricercatori in questo campo.
Scopo dello studio
- Confrontare la resistenza di batteri planctonici e batteri in biofilm agli agenti antimicrobici.
- Determinare la concentrazione battericida minima per entrambi gli stati.
- Evidenziare l'aumento della resistenza conferito dalla crescita in biofilm.
Metodi Utilizzati
- Formazione di un biofilm in una piastra microtitolata a 96 pozzetti.
- Applicazione di diluizioni seriali dell'agente antimicrobico.
- Ripristino delle cellule in mezzo fresco dopo il trattamento.
- Valutazione della vitalità mediante semina su agar LB.
Risultati principali
- Dimostrate differenze nei livelli di resistenza tra batteri planctonici e batteri in biofilm.
- Identificata la concentrazione battericida minima per entrambi gli stati batterici.
- Forniti approfondimenti sui meccanismi di resistenza associata ai biofilm.
Conclusioni
- La crescita del biofilm aumenta significativamente la resistenza batterica agli agenti antimicrobici.
- Comprendere queste differenze è essenziale per sviluppare strategie di trattamento efficaci.
- La ricerca futura dovrebbe concentrarsi sul superamento della resistenza associata ai biofilm.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione diretta delle concentrazioni battericide minime per entrambi gli stati batterici planctonico e a biofilm permette una riduzione del rischio meccanicistica nella scoperta di agenti antimicrobici. Questo approccio chiarisce i profili di resistenza in un punto critico di svolta, supportando la previsione dell'efficacia nei portafogli di antiinfettivi nelle fasi iniziali. Dati comparativi di MBC-P e MBC-B informano la validazione degli obiettivi e guidano la priorizzazione dei composti per infezioni associate a biofilm.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi diretta dell'efficacia antimicrobica contro fenotipi batterici distinti.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio quantificando gli spostamenti della resistenza tra stati planctonici e a biofilm.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico per i candidati farmaci anti-biofilm.
- Fornisce dati utilizzabili per la selezione del portafoglio sulla base delle soglie di resistenza.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce saggi validati e riproducibili basati su microtiter per forme planctoniche e a biofilm.
- Fornisce risultati quantitativi di CMB adatti a flussi di lavoro di screening ad alto rendimento.
- Consente la standardizzazione dei test antimicrobici su librerie di composti.
- Permette una valutazione affidabile della potenza dei composti in modelli batterici rilevanti per le malattie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati di resistenza in vitro con modelli traslazionali di infezioni associate a biofilm.
- Fornisce continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica di agenti anti-biofilm.
- Informa le decisioni di avanzamento con valutazione del rischio per composti mirati a infezioni persistenti.
- Incrementa il valore predittivo per la traslazione clinica in contesti di malattie correlate ai biofilm.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, collegando la validazione degli obiettivi guidata da ipotesi con risultati quantitativi di screening.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di resistenza e sulla protezione mediata dai biofilm.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili di CMB per entrambi gli stati batterici, consentendo una classificazione robusta dei composti.
- Analisi: Offre risultati chiari per il confronto statistico dell'efficacia antimicrobica in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i profili di resistenza in vitro a modelli preclinici di infezione persistente.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma saggistica standardizzata e scalabile per programmi continuativi di R&S anti-infettivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nello sviluppo di agenti antimicrobici.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi tra i diversi gruppi di ricerca.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale riguardo al proseguimento o meno dello sviluppo e l'allocazione del capitale per i candidati anti-biofilm.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di composti con profili di resistenza differenziati, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche in tecniche sterili e saggi basati su microtiter.
- Richiede l'accesso a strumentazione microbiologica standard e infrastrutture analitiche.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i team per minimizzare contaminazioni ed errori procedurali.
- Adattabile a diverse ceppi batterici capaci di formare biofilm in vitro.
- Dipende da un'accurata manipolazione per evitare contaminazioni tra pozzetti e garantire la fedeltà del saggio.
