Azionamento a distanza magnetica micrometrici Sonde per

L'obiettivo generale del seguente esperimento è effettuare in C due misurazioni delle proprietà fisiche locali di un biofilm batterico alla scala micrometrica. A tal fine, particelle magnetiche vengono introdotte in un biofilm in crescita per fungere da sonde che possono essere attivate a distanza senza alterare le proprietà strutturali del biofilm. Successivamente, delle pinzette magnetiche dedicate vengono utilizzate per esercitare una forza definita su ciascuna particella.

Incorporata nel film di biofilm, la displasia delle particelle indotta dallo stiramento magnetico viene monitorata mediante microscopia video per ricavare i parametri viscoelastici locali e fornire la distribuzione spaziale tridimensionale delle proprietà meccaniche del biofilm. I risultati ottenuti evidenziano l'eterogeneità meccanica del biofilm di e coli e forniscono indicazioni sui componenti del biofilm che ne sostengono le proprietà fisiche. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia, la cologia o l'analisi globale della biovegetazione, consiste nella capacità di rilevare la distribuzione spaziale delle proprietà meccaniche in situ, senza alterare la struttura originale del materiale.

Per preparare le particelle magnetiche per questo protocollo, vortexare il flacone stock di particelle da 2,8 micrometri per risospendere il pellet. Trasferire quindi 10 microlitri in una provetta da microcentrifuga. Per lavare le particelle, aggiungere 190 microlitri di mezzo minimo, agitare delicatamente la provetta, posizionarla su un supporto magnetico, attendere la formazione del pellet e aspirare la soluzione sovrastante.

Ripetere questo passaggio di lavaggio altre due volte e risospendere le perline in 190 microlitri di mezzo minimo. Successivamente, aggiungere 950 microlitri di M 63 B uno con glucosio 0,4% a 50 microlitri della soluzione di perline lavate per regolare la concentrazione delle particelle a circa 5 milioni di perline per millilitro. Per preparare il canale, utilizzare un tagliavetro al diamante per tagliare due capillari quadrati in vetro borosilicato lunghi 10 centimetri, ottenendo due pezzi lunghi otto centimetri.

Utilizzando il tagliavetro, tagliare un vetrino in due parti. Successivamente, con una colla cianoacrilica ad azione rapida o colla istantanea, fissare i due pezzi di capillare a due pezzi di vetrino come mostrato in questo diagramma. Posizionarli a due centimetri di distanza con un’estremità sporgente di un centimetro su entrambe le estremità, quindi sottoporre l’intero apparato e i tubi necessari all’autoclavaggio.

Per il collegamento ulteriore del canale, raccogliere i seguenti materiali sterili sotto una cappa a flusso laminare: il tubo del canale montato e i connettori, due filtri o trappole pediatriche per bolle d'aria, due pinze, siringhe da 30 millilitri riempite con M 63 B, 1,4% di glucosio e la bottiglia per i rifiuti.

Collegare le due capillari nello stesso modo, utilizzando uno dei tubi. Collegare la bottiglia degli scarti a uno dei capillari.

Quindi, utilizzando connettori a bloccaggio rapido come giunzioni, collegare l’altra estremità del capillare al trappolabolle fatto in casa o dal trappolabolle uno al trappolabolle due. Successivamente, collegare la siringa da 30 millilitri di M 63 B uno al trappolabolle due. A seguire, riempire l’apparato con M 63 B uno sterile contenente glucosio allo 0,4%.

Installare la siringa sulla pompa per siringa e accendere la pompa per siringa a una velocità di circa cinque millilitri all'ora superiore alle velocità sperimentali. Tenere attentamente sotto controllo ed eliminare tutte le bolle nel circuito, se necessario. Scollegare e ricollegare il circuito durante il tentativo di questa procedura.

È fondamentale rimuovere eventuali bolle prima e durante l'introduzione della miscela di particelle cellulari nel tubo; posizionare il contenitore dei rifiuti al di sopra delle capillari aiuta a favorire una crescita continua del biofilm. Lasciare scorrere il mezzo attraverso il sistema per 10-15 minuti. Nel frattempo, in un tubo da microcentrifuga, mescolare un millilitro della sospensione batterica a densità ottica 0,5 con un millilitro della soluzione di perline lavate preparata in precedenza.

Spegnere il flusso, riattaccare il tubo e quindi chiudere le pinze. Successivamente, riempire una siringa da un millilitro con la miscela di perline batteriche e introdurla nel capillare. Dopo la trappola per bollicelle fatta in casa, trasferire l'apparato sul microscopio in quel punto.

Installare il capillare sullo stativo del microscopio e posizionare il contenitore dei rifiuti a un livello leggermente più alto. Collocare la pompa a siringa sul piano di lavoro accanto al microscopio. Lasciare l'apparato in posizione per 15-20 minuti, consentendo ai batteri di depositarsi e attaccarsi alla superficie del capillare.

Una volta che i batteri si sono attaccati al capillare, aprire le pinze e regolare la portata sulla pompa per siringa, quindi avviare il flusso. Nel corso di 24-48 ore, si svilupperà un biofilm sulla superficie del capillare; focalizzare il piano inferiore del capillare e iniziare la registrazione in time lapse delle immagini del campione. Solitamente, una frequenza di acquisizione di due immagini al minuto descrive adeguatamente la crescita del biofilm.

Questo filmato mostra la fase iniziale del biofilm subito dopo l'iniezione della miscela di cellule e particelle. Nell'acquisizione capillare, la frequenza è di un'immagine al secondo, e il filmato viene riprodotto a 10 fotogrammi al secondo. Dopo quattro ore di crescita, le particelle si sono progressivamente staccate dalla superficie per distribuirsi nel volume del biofilm.

Le frecce blu indicano gli eventi di distacco. In questo caso, la frequenza di acquisizione è di due immagini al minuto, e il filmato viene riprodotto a 15 fotogrammi al secondo. Dopo 20 ore di crescita, una dozzina di particelle distribuite uniformemente possono essere monitorate in un piano focale.

Questo filmato è stato ripreso in un piano intermedio, a 20 micrometri sopra il fondo del capillare. Sono state acquisite due immagini al minuto. Il filmato viene riprodotto a 15 fotogrammi al secondo.

Una volta che il biofilm seminato con particelle magnetiche inizia a crescere manualmente, avvitare le pinze magnetiche sullo stadio del microscopio. Per garantire che nel campo di osservazione vengano generati gradienti di campo magnetico adeguati, posizionare le pinze come mostrato in questo diagramma, in cui la regione di misura indicata in rosso si trova a 300 micrometri dai bordi dei poli sinistro e destro delle pinze lungo l'asse Y. Il fondo del capillare viene posizionato a 200 micrometri al di sotto del fondo delle pinze.

Per eseguire questo passaggio, utilizzare il controllo del movimento XY della piastra del microscopio per allineare il bordo del polo magnetico sinistro con il bordo sinistro del capillare. Nello stesso campo di osservazione, regolare la posizione del polo a 300 micrometri dal bordo del capillare utilizzando la manopola x del micromanipolatore sinistro delle pinzette. Eseguire la stessa operazione sul lato destro.

Quindi regolare la posizione delle pinzette lungo l'asse Z rispetto al fondo del capillare. Innanzitutto, allineare la base dei poli con il fondo del capillare e spostare i poli di 200 micrometri verso l'alto.

Utilizzando la manopola Z del micromanipolatore, impostare i parametri del generatore di funzioni su 24 secondi di segnale nullo e 16 secondi di quattro ampere. Corrente continua con un impulso di attivazione. Inviare al diaframma della luce in campo chiaro dopo 20 secondi.

Per la sincronizzazione del segnale, collegare la pinzetta al generatore di funzione tramite l'amplificatore di potenza. Prestare attenzione a collegare correttamente i poli in serie per acquisire curve di fluage distribuite spazialmente. Stabilire un'origine spaziale, posizionando l'origine dell'asse Z all'interno del fondo del capillare.

Prendere nota della posizione di controllo Z del microscopio. Quindi individuare l'intersezione degli assi x e Y, definiti rispettivamente dal bordo della capillare e dal bordo del pezzo polare. Questo è l'origine dell'analisi.

Prendere nota delle coordinate. Tutte le coordinate saranno riferite a questo punto di origine nel seguito. Una volta che il biofilm si è sviluppato, utilizzare la manopola del comando di messa a fuoco fine per regolare la posizione verticale del capillare in modo che il primo piano si trovi da quattro a sette micrometri al di sopra del fondo del capillare.

Questa sezione corrisponde alla sezione del biofilm in cui l'origine del riferimento spaziale è posizionata nell'angolo in alto a sinistra. Quindi accendere il generatore di corrente e attivare manualmente la sequenza di acquisizione delle immagini. Per avviare la 42a sequenza di eventi, il flusso di immagini acquisito qui corrisponde a un piano e a un campo XY specifici.

Dopo aver acquisito la sequenza, spostare il capillare per catturare un video del nuovo campo. Continuare a ripetere questo processo per ottenere tutti i video necessari per analizzare i dati. Aprire le immagini in ImageJ o in un software equivalente per il tracciamento delle particelle, per tutti gli stack acquisiti e per tutte le particelle.

Convertire le immagini in file di testo rilevando lo spostamento delle particelle. Successivamente, utilizzando un software di elaborazione dati, tracciare le curve di spostamento e convertire le curve di spostamento in curve di cedevolezza, nelle quali la cedevolezza totale del materiale JFT viene calcolata in funzione del tempo secondo la formula di cedevolezza mostrata qui. Questa formula descrive la relazione tra lo sforzo applicato e la deformazione del materiale per una particella storica di rossi, o incorporata in un mezzo viscoelastico e incomprimibile, come precedentemente stabilito, e dai suoi collaboratori. Dall'adattamento della curva di cedevolezza al modello generale di Burgers per materiali viscoelastici, ricavare i parametri viscoelastici J zero, J uno, eta zero, eta uno primo, per fornire la distribuzione spaziale delle proprietà viscoelastiche del biofilm. Le curve di cedevolezza sono state raccolte a diverse profondità in un microvolume di biofilm di circa 200 per 200 per 40 micrometri cubi. I risultati tipici sono mostrati qui.

I valori di J zero, la compliance elastica, sono riportati in funzione dell'asse Z lungo la profondità e dell'asse y lungo una dimensione laterale del biofilm. Ogni punto corrisponde a un microsfera per la quale l'analisi della curva di fluage ha fornito un valore di J zero. I dati mostrano che la compliance locale varia con la profondità del biofilm di quasi tre ordini di grandezza.

Inoltre, si è verificata una forte eterogeneità laterale a tutte le altezze del biofilm. I dati forniscono anche la distribuzione dei valori di compliance, che mostrano una forma ampia e asimmetrica. Il confronto di questi risultati con quelli ottenuti in precedenza su altri polimeri biologici suggerisce che le proprietà meccaniche del biofilm siano sostenute da gel polimerici altamente reticolati.

In C sono state effettuate due misurazioni del biofilm, nonché analisi delle proprietà locali in diverse condizioni ambientali, come ad esempio una portata ridotta, come mostrato qui. I valori di complianza di un biofilm coltivato a 0,1 millilitro all'ora mostrano ancora un profilo meccanico altamente eterogeneo. Tuttavia, la chiara dipendenza della rigidità del biofilm dalla profondità Z, osservata nel biofilm coltivato a un millilitro all'ora, è scomparsa.

Questi risultati dimostrano l'importante impatto delle condizioni esterne sull'organizzazione del biofilm Guardando il video. Dovresti avere una buona comprensione di come mappare le proprietà viscoelastiche del Biofilm Institute in condizioni di crescita completamente controllate.