Azionamento a distanza magnetica micrometrici Sonde per In situ Mappatura 3D di biofilm batterici Proprietà fisiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire in C due misure delle proprietà fisiche locali di un biofilm batterico su scala micrometrica. Per fare ciò, le particelle magnetiche vengono introdotte in un biofilm in crescita per fungere da sonde che possono essere azionate a distanza senza disturbare le proprietà strutturali del biofilm. Vengono quindi utilizzate pinzette magnetiche dedicate per esercitare una forza definita su ciascuna particella.

Nel film di biofilm, lo spostamento delle particelle indotto dall'attrazione magnetica viene monitorato utilizzando la microscopia video per derivare i parametri viscoelastici locali e fornire la distribuzione spaziale 3D delle proprietà meccaniche del biofilm. Si ottengono risultati che mostrano l'eterogeneità meccanica del biofilm di e coli e forniscono indizi su quali componenti del biofilm supportano le proprietà fisiche del biofilm. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia, la cologia o l'intera biovegetazione, è che riporta la distribuzione spaziale delle proprietà meccaniche in situ senza disturbare la struttura originale del materiale.

Per preparare le particelle magnetiche per questo protocollo, la fiala di riserva del vortex di particelle da 2,8 micrometri per risospenderle. Quindi trasferire 10 microlitri in una provetta da microcentrifuga. Quindi, per lavare le particelle, aggiungere 190 microlitri di terreno minimo e agitare la provetta, posizionarla su un rack magnetico per campioni, attendere la formazione di un pellet e aspirare la soluzione di supernat.

Ripetere questa fase di lavaggio altre due volte e risospendere le perle in 190 microlitri di terreno minimo. Quindi, aggiungere 950 microlitri di M 63 B one con lo 0,4% di glucosio a 50 microlitri della soluzione di perle lavate per regolare la concentrazione di particelle a circa 5 milioni di perle per millilitro. Per preparare il canale, utilizzare un tagliavetro diamantato per tagliare due capillari quadrati in vetro silicato bo lunghi 10 centimetri per ottenere due pezzi lunghi otto centimetri.

Usando il tagliavetro, taglia a metà un vetrino. Quindi, utilizzando una colla cianoacrilica ad azione rapida o una super colla, fissare i due pezzi capillari a due vetrini di vetro come mostrato in questo diagramma. A due centimetri di distanza con una sporgenza di un centimetro su entrambe le estremità, l'autoclave richiede l'intera configurazione e i tubi necessari.

Per un ulteriore collegamento del canale, raccogliere i seguenti materiali sterili sotto una cappa di flusso lanar. Il tubo e i connettori del canale montati, due filtri a bolle pediatriche o trappole. Due pinze, siringhe da 30 millilitri riempite con M 63 B, 1,4% di glucosio e il flacone di scarto.

Collegare i due capillari allo stesso modo. Utilizzando uno dei tubi. Collegare il flacone di scarico a un'estremità capillare.

Quindi, utilizzando i connettori di blocco dell'esca come giunzioni, collegare l'altra estremità del capillare alla trappola per bolle fatta in casa o intrappolarne una e intrappolarne una per intrappolarne due. Quindi collegare la siringa da 30 millilitri M 63 B one alla trappola due. Successivamente riempire l'impianto con M 63 B sterile uno con 0,4% di glucosio.

Installare la siringa sulla pompa a siringa e accendere la pompa a siringa a una velocità di circa cinque millilitri all'ora superiore alle velocità sperimentali. Monitora attentamente ed elimina tutte le bolle nel circuito, se necessario. Scollegare e ricollegare il circuito durante il tentativo di questa procedura.

Fare attenzione a rimuovere eventuali bolle prima e quando si introduce la miscela di particelle cellulari nel tubo, aiuta a posizionare la spazzatura sopra i capillari e questo aiuterà la crescita continua del biofilm. Lasciare che il fluido fluisca attraverso il sistema per 10-15 minuti. Nel frattempo, in una provetta da microcentrifuga, mescolare un millilitro della sospensione batterica a densità ottica 0,5 con un millilitro della soluzione di perle lavate preparata in precedenza.

Interrompere il flusso, ricollegare il tubo, quindi chiudere i clamps. Quindi, riempire una siringa da un millilitro con la miscela di perline batteriche e introdurla nel capillare. Dopo la trappola per bolle fatta in casa, trasferisci l'apparecchio al microscopio lì.

Installare il capillare sul tavolino del microscopio e posizionare il contenitore dei rifiuti a un livello leggermente più alto. Posizionare la pompa a siringa sul piano di lavoro accanto al microscopio. Lasciare riposare l'apparecchio per 15-20 minuti per consentire ai batteri di depositarsi e attaccarsi alla superficie del capillare.

Una volta che i batteri si sono attaccati al capillare, aprire i morsetti e regolare la portata sulla pompa a siringa e avviare il flusso. Nel corso di 24-48 ore, un biofilm si svilupperà sulla superficie del capillare, si concentrerà sul piano inferiore del capillare e avvierà la registrazione in time lapse delle immagini del campione. Di solito una frequenza di acquisizione di due immagini al minuto riporterà adeguatamente la crescita del biofilm.

Questo filmato mostra la fase iniziale del biofilm subito dopo l'iniezione della miscela di particelle cellulari. Nell'acquisizione capillare, la frequenza è di un'immagine al secondo e il filmato viene riprodotto a 10 fotogrammi al secondo. Dopo quattro ore di crescita, le particelle si staccano progressivamente dalla superficie per essere distribuite nel volume del biofilm.

Le frecce blu indicavano gli eventi di distacco. In questo caso, la frequenza di acquisizione è di due immagini al minuto e il filmato viene riprodotto a 15 fotogrammi al secondo. Dopo 20 ore di crescita, una dozzina di particelle distribuite uniformemente su un piano focale.

Questo filmato è stato girato su un piano intermedio, 20 micrometri sopra il fondo del capillare. Sono state acquisite due immagini al minuto. Il filmato viene riprodotto a 15 fotogrammi al secondo.

Una volta che il biofilm seminato con particelle magnetiche cresce manualmente, avvitare le pinzette magnetiche sul tavolino del microscopio. Per garantire che vengano generati i gradienti di campo magnetico appropriati nella zona di osservazione, assicurarsi che le pinzette siano posizionate come mostrato in questo diagramma in cui la regione di misurazione mostrata in rosso si trova a 300 micrometri dai bordi dei poli sinistro destro delle pinzette lungo l'asse Y. La parte inferiore del capillare è posizionata 200 micrometri sotto il fondo delle pinzette.

Per ottenere questo passaggio, utilizzare il controllo del movimento XY del tavolino del microscopio per portare il bordo del polo magnetico sinistro e il bordo sinistro del capillare. Nello stesso campo di osservazione, regolare la posizione dell'asta a 300 micrometri dal bordo del capillare utilizzando il quadrante x del manipolatore di microm sinistro delle pinzette. Eseguire la stessa operazione sul lato destro.

Quindi regolare la posizione delle pinzette lungo l'asse Z rispetto alla parte inferiore del capillare. Innanzitutto, allineare la parte inferiore dei poli con la parte inferiore del capillare e spostare i poli. 200 micrometri in su.

Utilizzando il quadrante Z del micro manipolatore, impostare i parametri del generatore di funzioni su 24 secondi di segnale zero e 16 secondi di quattro ampere. Corrente continua con grilletto. Invia all'otturatore della luce in campo chiaro dopo 20 secondi.

Per la sincronizzazione del segnale, collegare le pinzette al generatore di funzioni tramite l'amplificatore di potenza. Prestare attenzione a collegare correttamente i poli in serie per acquisire curve di scorrimento spazialmente distribuite. Prendi un'origine spaziale, prendi l'origine dell'asse Z nella parte inferiore interna del capillare.

Prendere nota della posizione di controllo Z del microscopio. Quindi individuare l'intersezione degli assi x e Y, che sono definiti rispettivamente dal bordo del capillare e dal bordo dell'espansione polare. Questa è l'origine dell'analisi.

Prendi nota delle coordinate. Tutte le coordinate saranno prese rispetto a questa origine di seguito. Una volta che il biofilm è cresciuto, utilizzando la manopola di controllo della messa a fuoco fine, regolare la posizione verticale del capillare in modo che il primo piano si trovi da quattro a sette micrometri sopra il fondo del capillare.

Questa fetta corrisponde alla fetta di biofilm in cui l'origine del referenziale spaziale si trova nell'angolo in alto a sinistra. Quindi accendere il generatore di corrente e attivare manualmente la sequenza di acquisizione dell'immagine. Per avviare la 42a sequenza di eventi, il flusso di immagini qui acquisito corrisponde a un dato piano e campo XY.

Dopo che la sequenza è stata acquisita, spostare il capillare per acquisire un video del nuovo campo. Continua a ripetere questo processo per ottenere tutti i video necessari per analizzare i dati. Apri le immagini nell'immagine J o in un software di tracciamento delle particelle equivalente per tutte le pile acquisite in tutte le particelle.

Converti le immagini in file di testo tracciando lo spostamento delle particelle. Successivamente, utilizzando un software di trattamento dati, disegnare le curve di spostamento e convertire le curve di spostamento in curve di conformità in cui la conformità totale del materiale JFT è calcolata in funzione del tempo secondo la formula di conformità mostrata qui, Questa formula descrive la relazione tra la sollecitazione applicata e la deformazione del materiale per una particella storica di rossi, o incorporato nel mezzo viscoelastico e non comprimibile come precedentemente stabilito, e i suoi collaboratori Dalla regolazione della curva di conformità dello scorrimento al modello generale di hamburger per i materiali viscoelastici derivare i parametri viscoelastici J zero J uno allo zero all'uno primo per fornire la distribuzione spaziale del viscoelastico Le proprietà delle curve di scorrimento del biofilm sono state raccolte a diverse profondità in un microvolume di biofilm di circa 200 per 200 per 40 micrometri cubi. I risultati tipici sono mostrati qui.

I valori di J zero, la cedevolezza elastica sono dati in funzione dell'asse Z lungo la profondità e dell'asse y lungo una dimensione laterale del biofilm. Ogni punto corrisponde a un cordone per il quale l'analisi della curva di scorrimento ha fornito un valore J zero. I dati rivelano che la compliance locale varia lungo la profondità del biofilm per quasi tre ordini di grandezza.

Inoltre, si è verificata una forte eterogeneità laterale a tutte le altezze del biofilm. I dati forniscono anche la distribuzione dei valori di conformità, che presentano una forma diffusa e asimmetrica. Il confronto di questi risultati con quelli precedentemente ottenuti su altri polimeri biologici suggerisce che le proprietà meccaniche del biofilm sono supportate da gel polimerici altamente reticolati.

Nelle due misurazioni C del biofilm, le proprietà locali sono state eseguite anche in diverse condizioni ambientali, come ad esempio una velocità di flusso inferiore, come si può vedere qui. I valori di conformità di un biofilm cresciuto a 0,1 millilitri all'ora presentano ancora un profilo meccanico altamente eterogeneo. Ma la chiara dipendenza dalla profondità Z della rigidità del biofilm osservata nel biofilm cresciuto a un millilitro all'ora è scomparsa.

Questi risultati dimostrano l'impatto significativo delle condizioni esterne sull'organizzazione del biofilm Guardando il video. Dovresti avere una buona comprensione di come mappare le proprietà del Visco del Biofilm Institute in condizioni di crescita completamente controllate.