Metodi per studiare i meccanismi d'azione di farmaci antipsicotici in
4 febbraio 2014
Approcci per testare gli effetti dei farmaci antipsicotici (APD) in Caenorhabditis elegans sono dimostrati. I dosaggi sono descritti per testare gli effetti della droga sullo sviluppo e la redditività e sulla faringe velocità di pompaggio. Questi metodi sono applicabili per esperimenti di farmacogenetica con classi di farmaci diversi da APD anche.
L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare gli effetti dei farmaci antipsicotici sullo sviluppo e sul pompaggio faringeo dell'elgano marino. Ciò si ottiene facendo crescere prima una popolazione di nematodi adulti e da essi generando una popolazione sincronizzata di animali. Il passo successivo consiste nel trasferire ovuli sincronizzati o adulti su piastre di analisi con farmaci.
Il passo finale consiste nell'osservare e valutare gli effetti dei farmaci sui vermi. In definitiva, i risultati possono dimostrare che i farmaci antipsicotici ritardano lo sviluppo e inibiscono il pompaggio faringeo negli animali esposti al farmaco. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi d'azione dei farmaci antipsicotici, può anche essere applicato per studiare altre piccole molecole e persino grandi molecole come i lipidi Avere pronto un farmaco di interesse con una concentrazione di lavoro nota.
Iniziare caricando una piastra a 12 pozzetti con due millilitri di NGM, terreno per pozzetto. Mettere da parte la piastra per farla indurire a temperatura ambiente. Quindi, raccogli una colonia di batteri OP 50 e trasferiscila in una bottiglia da 50 millilitri di coltura LB.
I batteri durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 220 giri/min il giorno successivo in ogni pozzetto della piastra preparata. A 20 microlitri di coltura batterica, impostare la piastra per incubare per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Caricare ogni pozzo seduto con 80 microlitri di farmaco di interesse alla concentrazione di lavoro.
In questo caso, il farmaco è la C Clozapina. Assicurati di agitare la soluzione prima di assumere aliquote. Agitare la soluzione per distribuirla uniformemente nel pozzetto e lasciarla assorbire a temperatura ambiente con il coperchio della piastra tolto.
Quindi procedere con il test o conservare la piastra a 20 gradi Celsius durante la notte e iniziare il test il giorno successivo. Inizia raccogliendo le uova dal genotipo di interesse. Inizia con una popolazione di vermi con molti adulti GR.
Lavare via i vermi in un piatto di 3,5 centimetri utilizzando un tampone M nine. Quindi farli girare in un tubo da 15 millilitri a 2000 giri/min per un minuto. Rimuovere il surnatante tramite aspirazione e sostituirlo con cinque millilitri di candeggina.
Quindi interrompi delicatamente gli adulti capovolgendo il tubo e attendi che gli animali inizino a dissolversi continuamente. Osservare i vermi che si dissolvono sotto il cannocchiale. Quando circa la metà dei vermi si è sciolta.
Dopo circa cinque minuti, centrifugare il tubo per raccogliere gli ovuli, aspirare il surnatante e sostituirlo rapidamente con un tampone M nine. Quindi girare di nuovo il tubo verso il basso come prima e rimuovere tutto tranne circa 100 microlitri del surnatante M nine. Per sospendere le uova, far vorticare il tubo.
Quindi trasferire due microlitri di sospensione su una piastra NGM e contare il numero di ovuli trasferiti. Quindi caricare la piastra trattata con il farmaco con 30-35 uova per pozzetto e incubare la piastra a 20 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, segna il numero di uova schiuse.
Se in uno sono presenti più di 25 vermi, rimuovere bene i vermi in eccesso. Riportare i vermi sulla piastra nell'incubatrice per un'osservazione successiva a intervalli di 24 ore ogni giorno, valutare lo stadio di sviluppo dei vermi nei pozzetti in base alle dimensioni dei vermi e alla forma delle loro vulve. Gli effetti robusti si osservano solitamente il terzo e il quarto giorno.
L'esperimento dovrebbe durare circa una settimana. Per questo protocollo, aver preparato le piastre per i test antidroga come precedentemente descritto il giorno prima, avviando il test. Scegli 50 L di animali a quattro stadi per ogni genotipo dell'esperimento.
Trasferirli su piastre NGM e incubare le piastre per 24 ore a 20 gradi Celsius. Il giorno successivo, ogni 15-20 minuti, caricare un pozzetto di test con 10 animali dopo che un gruppo è stato esposto al farmaco per mezz'ora. Inizia a osservare il loro pompaggio faringeo al microscopio da dissezione.
Per prima cosa, trova un verme, quindi conta le sue pompe faringee per 20 secondi. Una volta segnato, raccogli il verme dal piatto. Segna tutti i vermi nel pozzo allo stesso modo.
I risultati attesi dalla conduzione del ritardo sperimentale. Il test di letalità con controlli wild type dovrebbe mostrare che, a differenza del tipico tasso di crescita fino allo stadio grave di adulto, gli animali esposti alla clozapina c sono ancora negli stadi larvali giovani o sono mutanti morti che testano su diverse concentrazioni di clozapina hanno rivelato mutanti soppressori come mute one e mutanti enhancer come MU due. Universalmente, la letalità del mute one era inferiore a quella del tipo selvatico, e la letalità del MU 2 era più alta del previsto rispetto al controllo che gli animali muti sopravvissuti sono più in grado di sviluppare, mentre i due sopravvissuti muti sono più ritardati.
Ulteriori esami hanno rivelato che l'esposizione alla clozapina ha ridotto i tassi di pompaggio faringeo in modo dipendente dalla concentrazione. Tuttavia, il tasso diminuito di mute one era inferiore a quello di wild type, mentre il tasso diminuito di mute two era maggiore di quello di wild type. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il test dei farmaci antipsicotici su piccola scala.
Il messaggio può anche essere ingrandito per condurre uno screening genetico su larga scala.
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Panoramica
Questo articolo illustra approcci per testare gli effetti dei farmaci antipsicotici (APDs) in Caenorhabditis elegans. I metodi includono saggi per valutare gli effetti dei farmaci sullo sviluppo, sulla vitalità e sulla frequenza del pompaggio faringeo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Farmacologia
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Caenorhabditis elegans è un organismo modello utilizzato per lo studio degli effetti dei farmaci.
- I farmaci antipsicotici possono influenzare i processi di sviluppo.
- Il pompaggio faringeo è un comportamento fondamentale per valutare l'impatto dei farmaci.
- Esperimenti di farmacogenetica possono essere condotti utilizzando questi metodi.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti dei farmaci antipsicotici sullo sviluppo dei nematodi.
- Valutare l'impatto di questi farmaci sulle frequenze di pompaggio faringeo.
- Fornire informazioni sui meccanismi d'azione degli APD.
Metodi Utilizzati
- Coltivare una popolazione di Caenorhabditis elegans adulti.
- Generare una popolazione sincronizzata a partire da nematodi adulti.
- Trasferire uova sincronizzate o adulti su piastre per saggio contenenti farmaci.
- Osservare e valutare gli effetti dei farmaci sullo sviluppo e sul comportamento.
Risultati principali
- I farmaci antipsicotici ritardano lo sviluppo nei nematodi esposti.
- Il pompaggio faringeo è inibito negli animali trattati con farmaci.
- I risultati possono contribuire alla comprensione dei meccanismi d'azione dei farmaci.
- I metodi sono applicabili ad altre molecole piccole e grandi.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un quadro per testare gli effetti dei farmaci in C. elegans.
- Le informazioni ottenute possono estendersi a vari studi farmacologici.
- Questi metodi possono essere adattati per applicazioni più ampie oltre ai farmaci antipsicotici.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Gli studi sui meccanismi d'azione dei farmaci antipsicotici in C. elegans permettono una riduzione precoce dei rischi associati ai bersagli, collegando gli esiti fenotipici a percorsi neuromolecolari. I saggi sullo sviluppo e sul pompaggio faringeo forniscono letture quantitative e scalabili per l'analisi del meccanismo d'azione nella biologia della scoperta. Questo approccio sostiene una maggiore affidabilità predittiva nella validazione dei bersagli e nella selezione del portafoglio per indicazioni neuropsichiatriche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verificare ipotesi terapeutiche collegando l'esposizione ad antipsicotici a fenotipi di ritardo dello sviluppo e di inibizione faringea.
- Valore operativo: Consentire la validazione funzionale di bersagli mediante schermate genetiche di soppressori e potenziatori per identificare modificatori della risposta al farmaco.
- Valore predittivo: Supportare la riduzione del rischio meccanicistico rivelando effetti dipendenti dalla concentrazione su output neuromuscolari conservati.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Preparare sistemi biologici validati per analisi successive mediante flussi di lavoro di preparazione di embrioni sincronizzati e adulti in stadi definiti.
- Valore operativo: Affrontare la standardizzazione dei saggi attraverso protocolli di valutazione giornaliera dello sviluppo e conteggio del pompaggio faringeo in 20 secondi.
- Valore di scalabilità: Evidenziare la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma per testare molecole piccole e grandi oltre gli antipsicotici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Discutere la rilevanza per le malattie attraverso geni conservati nella sintesi dei neurotrasmettitori e nella funzione sinaptica nel genoma di C. elegans.
- Continuità preclinica: Descrivere la continuità dalla scoperta alla validazione fenotipica in un sistema a organismo intero rilevante per la malattia.
- Avanzamento basato sul rischio: Affrontare decisioni meccanicistiche di proseguimento o interruzione dello sviluppo utilizzando la letalità nello sviluppo e la soppressione della frequenza di pompaggio come biomarcatori di efficacia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo posiziona gli studi sui meccanismi degli antipsicotici nelle fasi iniziali della scoperta, fino all'identificazione del composto guida, sostenendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi in neurofarmacologia.
- Biologia della Scoperta: Spiegare come il metodo supporti la verifica delle ipotesi mediante la definizione delle fasi di sviluppo e la quantificazione del pompaggio faringeo.
- Screening: Descrivere la prontezza del saggio attraverso il trasferimento sincronizzato di uova su piastre contenenti farmaci e la valutazione fenotipica giornaliera.
- Analisi: Evidenziare gli output quantitativi, inclusa la valutazione delle fasi di sviluppo e il numero di pompati faringei per unità di tempo, utili per il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca Translazionale: Collegare il metodo alla continuità preclinica sfruttando fenotipi neuromuscolari conservati, predittivi del meccanismo d'azione dei farmaci.
- Riutilizzo Aziendale: Presentare il metodo come una capacità riutilizzabile per studi sul meccanismo d'azione in diversi ambiti terapeutici, mediante schermate genetiche e chimiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile della validazione dell'obiettivo attraverso l'ancoraggio fenotipico degli effetti antipsicotici alla funzione neuromuscolare.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante popolazioni sincronizzate e intervalli di valutazione definiti per lo sviluppo e il comportamento.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui riducendo l'ambiguità meccanicistica nella fase iniziale di screening antipsicotico.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio, utilizzando il ritardo dello sviluppo e l'inibizione faringea come endpoint biomarcatori traslabili.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza specifica nella coltura di nematodi, nella sincronizzazione e nella valutazione fenotipica mediante microscopia stereoscopica.
- Le attrezzature necessarie includono incubatrici, microscopi e sistemi di somministrazione di farmaci per saggi in piastre a 12 pozzetti.
- La standardizzazione tra gruppi di lavoro richiede protocolli condivisi per la preparazione delle uova, la distribuzione dei farmaci e i criteri di classificazione dello stadio di sviluppo.
- Le considerazioni per l'adattamento tra diversi sistemi modello includono la conservazione dei bersagli dei neurotrasmettitori e l'adeguamento dei saggi a formati ad alto rendimento.
- I limiti pratici includono la durata del saggio di circa una settimana e la sensibilità alla qualità del prato batterico, che influisce sulla salute dei vermi.
