Name: Generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Scopri come generare rapidamente amiloide da proteine native in vitro utilizzando tampone MES e incubazione a temperature elevate. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di misfolding proteico e le malattie associate.

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Questo lavoro è supportato da sovvenzioni a W.C. dal National Institutes of Health Grant AI074809 e dal programma di sovvenzioni per la ricerca istituzionale del M. D. Anderson Cancer Center dell'Università del Texas.

1. Prepara il buffer MES
<ol>
	<li>Utilizzare il tampone MES (acido 0,1 M 2-(N-morfolino)etansolfonico e 0,9 M NaCl) per preparare sia oligomeri di sola proteina amiloide che oligomeri proteici solubili stabilizzati. Pesa 1,95 g di MES e 5,27 g di NaCl. Aggiungere H2O e regolare il pH a 4,7. Portare il volume finale a 100 ml. Conservare a 4º C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>
2. Prepara l'amiloide di sole proteine direttamente dalle proteine native
<ol>
	<li>Pesare la proteina di scelta (qualsiasi proteina o peptide nativo) e ricostituirla a 10 mg/ml in tampone MES.</li>
	<li>Incubare a 65 ºC in bagnomaria per 4 ore. Alla fine del periodo, il precipitato bianco è visibile in soluzione.</li>
	<li>Neutralizzare il campione con il 10% (v/v) di Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Dializzare la proteina in una cassetta per dialisi durante la notte per passare al tampone desiderato per ulteriori analisi.</li>
	<li>Un campione di controllo di proteina nativa può essere preparato seguendo i passaggi 2.1, 2.3 e 2.4 senza precipitazione di calore (passaggio 2.2).</li>
</ol>
3. Prepara l'amiloide ibrida da oligomeri solubili stabilizzati di proteine native
<ol>
	<li>Preparare oligomeri proteici solubili stabilizzati
	<ol>
		<li>Pesare la proteina di scelta e ricostituirla a 10 mg/ml in tampone MES. Lasciare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Pesare l'1-etil-3-[3-dimetilamminopropil]carbodiimmide cloridrato (EDC) e preparare una nuova scorta di 20 mg/ml in tampone MES.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni proteiche e EDC in un rapporto di 2:5 (v/v), cioè 2 mg di proteine per ogni 10 mg di EDC.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.</li>
		<li>Neutralizzare il campione con il 10% (v/v) di Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Dializzare la proteina in una cassetta per dialisi durante la notte per passare al tampone desiderato per ulteriori analisi.</li>
		<li>Conservare l'oligomero proteico solubile stabilizzato a 4 ºC fino a 4 settimane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare amiloidi ibride da oligomero proteico solubile stabilizzato.
	<ol>
		<li>Per preparare l'amiloide contenente DNA, mescolare il DNA e l'oligomero proteico solubile stabilizzato in rapporto 1:1 (p/p). Lasciare agire a 4 ºC per almeno 2 ore. Durante questo periodo, il precipitato insolubile è visibile in soluzione quando la concentrazione proteica iniziale è pari o superiore a 0,5 mg/ml.</li>
		<li>Per preparare l'amiloide contenente RNA, mescolare l'RNA e l'oligomero proteico solubile stabilizzato in rapporto 1:1 (p/p). Lasciare agire a 4 ºC per almeno 2 ore. Durante questo periodo, il precipitato insolubile è visibile in soluzione quando la concentrazione proteica iniziale è pari o superiore a 0,5 mg/ml.</li>
		<li>Per preparare l'amiloide contenente eparina, mescolare eparina e oligomero proteico solubile stabilizzato in rapporto 1:1 (p/p). Lasciare agire a 4 ºC per almeno 2 ore. Durante questo periodo, il precipitato insolubile è visibile in soluzione quando la concentrazione proteica iniziale è pari o superiore a 0,5 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il metodo qui descritto offre un mezzo rapido e flessibile per preparare fibrille amiloidi in vitro praticamente da qualsiasi proteina o peptide di scelta. Diversi tipi di amiloide possono essere preparati in modo affidabile: fibrille di sole proteine o aggregati ibridi contenenti DNA, RNA o glicosaminoglicani. Le procedure coinvolte sono semplici, dirette e non richiedono una formazione tecnica avanzata. L'amiloide preparata con questo metodo è abbastanza stabile e può essere conservata in sicurezza a 4 ºC o co...

Le proteine sono le macromolecole biologiche più abbondanti presenti in tutti i tipi di cellule. Si presentano in una grande varietà di dimensioni, strutture e modificazioni post-traduzionali e svolgono un'enorme gamma di importanti funzioni biologiche quando si trovano nelle loro forme native. Più di due dozzine di polipeptidi aberranti sono stati implicati in numerose condizioni patologiche umane, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e il diabete di tipo 21-4. Le proteine terminali mal ripiegate accumulano come fibrille amiloidi gli aggregati stabili insolubili che si verificano extracellulare o intracellulare.
Nonostante l'implicazione di proteine specifiche in alcune malattie, prove crescenti supportano l'idea che tutti i polipeptidi abbiano proprietà intrinseche che consentono la trasformazione dell'amiloide. Un'indagine di sequenza sull'intero genoma ha identificato l'"amiloma", mediante il quale i frammenti inclini all'amiloide costituiscono circa il 15% di tutti i segmenti peptidici codificanti da E. coli all'uomo5. Di conseguenza, negli ultimi anni è stato scoperto un numero crescente di amiloidi funzionali, che partecipano a vari importanti processi cellulari. Ad esempio, i batteri assemblano gli amiloidi per formare biofilm e strutture di spore che sono fondamentali per la loro sopravvivenza e patogenesi6-9. Gli ormoni peptidici formano depositi di amiloide durante la conservazione all'interno dei granuli secretori dei mammiferi prima di essere rilasciati, implicando ulteriormente che la forma amiloide proteica può svolgere funzioni biologiche benefiche6,10,11. Inoltre, le proteine possono anche assemblarsi in fibrille amiloidi per trasmettere segnali cellulari critici12,13.
Per molti anni, gli amiloidi più studiati sono stati preparati da singoli peptidi associati a malattie umane, come l'amiloide-beta o il peptide prionico. Questi peptidi di solito mancano di una struttura ben definita e formano spontaneamente amiloide in soluzione nel tempo, un processo mediato da un intermedio parzialmente mal ripiegato che funge da precursore dell'amiloide insolubile. Il precursore dell'amiloide è anche chiamato oligomero proteico solubile, che è raro e instabile se generato da peptidi naturali14,15. Tuttavia, come descritto in precedenza, quasi tutte le proteine in linea di principio possono adottare la conformazione amiloide nelle condizioni appropriate. Recentemente abbiamo messo a punto un metodo per preparare oligomeri solubili stabilizzati di proteine native, che formano facilmente amiloide in presenza di vari cofattori16. Le fibrille amiloidi risultanti riflettono la natura complessa degli aggregati di misfolding delle proteine terminali17,18. Qui usiamo il termine amiloide solo proteica per riferirci alle fibrille proteiche senza cofattori e amiloide ibrida per le fibrille contenenti componenti non proteici.
In precedenza, sono stati sviluppati vari metodi per generare amiloide in vitro applicando condizioni note per favorire il ripiegamento errato delle proteine, come l'alta temperatura, l'ambiente idrofobico e le variazioni di pH19-23. Tuttavia, si associano a vari problemi, come la bassa efficienza, la piegatura reversibile, le variazioni di grandi lotti o la cinetica lenta. L'approccio qui descritto è riproducibile, facile da scalare e consente di controllare con precisione i tempi e le condizioni della conversione dell'amiloide.

<table><tbody><tr><td>Acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>1-etil-3-[3-dimetil-amminopropil] cloridrato di carbodiimmide (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>DNA da spermatozoo di salmone</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>RNA da lievito torula</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Eparina dalla mucosa intestinale suina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bagnomaria</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer cassetta per dialisi</td><td>Thermo/Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Le proteine svolgono compiti cruciali negli organismi esercitando funzioni suscitate dalle loro specifiche pieghe tridimensionali. Sebbene le strutture native dei polipeptidi soddisfino molti scopi, è ormai riconosciuto che la maggior parte delle proteine può adottare un assemblaggio alternativo di amiloide ricca di beta-fogli. Le fibrille amiloidi insolubili sono inizialmente associate a molteplici disturbi umani, ma si dimostrano sempre più come attori funzionali che partecipano a vari importanti processi cellulari. Inoltre, l'amiloide depositata nei tessuti dei pazienti contiene componenti non proteici, come acidi nucleici e glicosaminoglicani (GAG). Questi cofattori possono facilitare la formazione di amiloide, con conseguente generazione di diversi tipi di precipitati insolubili. Sfruttando la nostra comprensione di come le proteine si ripiegano in modo errato attraverso uno stadio intermedio del precursore dell'amiloide solubile, abbiamo ideato un metodo per convertire le proteine native in fibrille amiloidi in vitro. Questo approccio consente di preparare amiloide in grandi quantità, esaminare le proprietà dell'amiloide generata da proteine specifiche e valutare i cambiamenti strutturali che accompagnano la conversione.

La capacità di convertire direttamente le proteine native in amiloidi si basa sul cambiamento conformazionale indotto ad alta temperatura nel tampone MES. La precipitazione nella soluzione è un buon indicatore dell'aggregazione proteica e, possibilmente, della formazione di amiloidi. D'altro canto, per permettere la stabilizzazione di oligomeri proteici solubili, l'EDC viene utilizzato per cross-linkare le proteine, fissando così la conformazione oligomerica indotta nel tampone MES. Di conseguenza, gli oligomeri proteici...

Le proteine possono adottare una struttura nativa o ripiegarsi erroneamente in amiloide insolubile. Le condizioni che favoriscono la via del ripiegamento errato portano alla formazione di diversi tipi di fibrille amiloidi. I metodi qui descritti consentono una rapida conversione di proteine native in amiloide in vitro.

Generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere rapidamente amiloide fis da qualsiasi proteina in vitro. Ciò si ottiene dissolvendo la proteina di scelta nel tampone MES per indurre il ripiegamento errato della struttura. La proteina può quindi essere incubata ad alta temperatura, il che favorisce la formazione di amiloide in assenza di altri cofattori.In alternativa, la proteina viene reticolata mediante EDC al fine di generare legamenti proteici solubili stabilizzati, il precursore dell'amiloide. Infine, i cofattori non proteici vengono miscelati con oligomeri proteici solubili stabilizzati per consentire la formazione di amiloide ibrida Si ottengono risultati che mostrano che le proteine native possono essere facilmente convertite in conferma amiloide quando facilitate da condizioni favorevoli. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle malattie da misfolding proteico, come ad esempio la precisione con cui l'amiloide si forma da oligomeri proteici solubili e se diversi tipi di amiloide hanno funzioni biologiche e patologiche distinte.Per iniziare, preparare il tampone MES come descritto nel protocollo di testo sia per l'amiloide solo proteica che per la proteina solubile stabilizzata. Tutti i legamenti pesano quindi la proteina scelta e la ricostituiscono a 10 milligrammi per millilitro in tampone MES. In questa dimostrazione, viene utilizzata l'albumina sierica umana o HSA, incubare la soluzione a 65 gradi Celsius in un bagno d'acqua per quattro ore.Alla fine del periodo, un precipitato bianco è visibile nella soluzione. Neutralizzare il campione con il 10% di volume per volume. T tris, HCL dializza la proteina in una cassetta per dialisi durante la notte per scambiarla con il tampone desiderato.Per ulteriori analisi, preparare un campione di controllo di proteina nativa seguendo questi passaggi senza precipitazione di calore. Per preparare la proteina solubile stabilizzata, tutti i legamenti pesano la proteina scelta e la ricostituiscono a 10 milligrammi per millilitro. Nel tampone MES, lasciare la soluzione proteica a temperatura ambiente per 15 minuti.Preparare un brodo fresco di 20 milligrammi per millilitro EDC in tampone MES. Mescolare le soluzioni proteiche e EDC in un rapporto da due a cinque, quindi incubare a temperatura ambiente per due ore dopo l'incubazione. Neutralizzare il campione con il 10% di volume per volume di tris HCL, dializzare la proteina in una cassetta per dialisi durante la notte per lo scambio con il tampone desiderato.Per ulteriori analisi. Conservare la proteina solubile stabilizzata di tutti i legamenti a quattro gradi Celsius per un massimo di quattro settimane. Questa sospensione sarà utilizzata per preparare amiloidi ibride per la preparazione sia del DNA contenente amiloide che dell'RNA contenente amiloide.Mescolare, l'acido nucleico e la proteina solubile stabilizzata tutti i legamenti in un rapporto uno a uno. Lasciare il composto a quattro gradi Celsius per almeno due ore durante questo periodo. Il precipitato insolubile è visibile in soluzione quando la concentrazione proteica iniziale è pari o superiore a 0,5 milligrammi per millilitro.Per preparare l'eparina contenente amiloide, mescolare eparina e proteina solubile stabilizzata, tutti i legamenti in un rapporto uno a uno prima di incubarla a quattro gradi Celsius per almeno due ore. Simile all'acido nucleico contenente amiloidi nel precipitato solubile è visibile in soluzione. Quando la concentrazione iniziale di proteine è di 0,5 milligrammi per millilitro o superiore, la capacità di convertire le proteine native direttamente in amiloide si basa sul cambiamento di conferma sostenuto ad alta temperatura.Nel tampone MES, la precipitazione nella soluzione è una buona indicazione dell'aggregazione proteica e della possibile formazione di amiloide per consentire agli oligomeri proteici solubili di stabilizzarsi. L'EDC viene utilizzato per reticolare le proteine per solidificare la conferma oligomerica indotta nel tampone MES. Di conseguenza, gli allgas proteici stabilizzati sono proteine multimeriche distinte dalle proteine native monomeriche o dagli aggregati indotti dal calore.Quando separati da una proteina solubile stabilizzata con SDS, tutti i legamenti possono legarsi facilmente agli acidi nucleici, inclusi DNA e RNA, in modo indipendente dalla sequenza. Pertanto, è possibile eseguire un saggio di spostamento del gel per visualizzare l'interazione diretta tra la proteina solubile stabilizzata, tutti i legamenti e il DNA, che provocherebbe la migrazione ritardata del DNA su un gel AROS. La citotossicità è un carattere archetipico delle proteine solubili.Tutti i legamenti hanno stabilizzato la proteina solubile, tutti i legamenti hanno indotto la morte cellulare in modo dose-dipendente che è rilevabile mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Come mostrato qui, le cellule RP I 8 2 2 6 sono estremamente suscettibili alle proteine solubili, tutte le morti indotte dai legamenti vengono misurate mediante colorazione con ioduro di propidio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare diversi tipi di amiloide da qualsiasi proteina di tua scelta in vitro.

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