Name: Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Scopri metodi per modulare e analizzare la neurogenesi adulta dipendente da NF-κB nel cervello. Questo protocollo utilizza il test comportamentale Barnes maze per valutare l'apprendimento spaziale nei topi.

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Ringraziamo Angela Kralemann-Köhler per un eccellente supporto tecnico. Il lavoro sperimentale qui descritta è stata eseguita nel nostro laboratorio ed è stata sostenuta da sovvenzioni del Consiglio di ricerca tedesco (DFG) a CK e BK e una borsa di studio del ministero tedesco della Ricerca e dell&#39;Istruzione (BMBF) per BK.

Dichiarazione Etica Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le disposizioni della utilizzazione cura degli animali e del comitato governativo, LANUV dello stato del Nord Reno-Westfalia, (Düsseldorf, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal LANUV, Düsseldorf sotto il numero di licenza 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare lo stress e il numero di animali necessari per lo studio. 1. Animal Care and Housing <ol><li> Tutti gli animali impiegati nei protocolli qui descritti devono essere tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, come definito dalla Federazione europea Laboratory Animal Science Association (FELASA). </li><li> I topi dovrebbero essere tenuti in gabbie standard in temperatura e umidità controllata (22 ° C), camera in condizioni diurni (12 ore di luce / buio ciclo) con HEPA aria filtrata. </li><li> Cibo standardizzato e acqua dovrebbero essere forniti ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Se / IkB / tTA e IkB - sono utilizzati topi di controllo, la genotipizzazione basato su PCR deve essere eseguita per ogni animale, come descritto in 7, 18. </li><li> I maschi con una differenza di età di meno di quattro giorni dovrebbe per essere utilizzati per ridurre la variabilità individuale. </li><li> (OPTIONAL): Per gli esperimenti di riattivazione NF-KB, doxiciclina deve essere somministrato in acqua potabile (2 mg / ml con il 2,5% di saccarosio) per almeno 14 giorni. </li></ol> 2. Spatial modello di separazione-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Tutti i test comportamentali dovrebbe essere effettuata secondo le linee guida internazionali e locali. </li><li> IMPORTANTE! Utilizzare solo topi maschi con una età di sei mesi o più. La differenza di età tra gli animali di una serie di test deve essere inferiore a quattro giorni. La prova deve essere eseguita dallo stesso operatore per ogni serie. I topi dovrebbe ricevere una dieta standard prima del test per aumentare ulteriormente la motivazione parzialmente guidata da comeweet ricompensa in cibo. </li><li> Impostare una piastra circolare bianco fatto da plastica dura (diametro 120 cm, vedi figura 5A) in un e umidità ambiente a temperatura controllata (22 ° C), illuminata con almeno 4 x 80 W e 3 x 215 W lampade fluorescenti al neon . IMPORTANTE! Garantire la corretta illuminazione è usata, come la motivazione dei topi per entrare nelle case di cibo è in parte guidato dalla loro avversione per luminose, luoghi esposti. </li><li> Impostare il sistema video-tracking. La telecamera deve essere posizionata 115 centimetri al di sopra del centro della piastra (vedi figura 5A). </li><li> Attaccare multicolore spunti extra-labirinto (EMC) per un panno di colore bianco in posizioni ben visibili per gli animali, circa 100 cm dal bordo della piastra (vedi figura 5A). </li><li> Pulire accuratamente la piastra con un rapido disinfettante che può rimuovere qualsiasi odore dal set-up sperimentale. </li><li> Posizionare sette identiche case gialle alimentari (12 cm x 7 cm x 8 centimetri, vedere Figura 5A </strong&gt;) sulla piastra bianca. Le posizioni dovrebbero essere inequivocabilmente contrassegnati (vedi figura 5A). </li><li> Posizionare dolci ricompense pellet cibo (un quarto di una casa Froot Loop / cibo Kellogs `s) all&#39;interno di tutte le case di cibo sulle posizioni definite (vedi Figura 5A) con una sola casa cibo definito essere liberamente accessibili per l&#39;animale (posizione F, si veda la Figura 5A ). Chiudere le case alimentari non bersaglio con un foglio trasparente. </li><li> Prima della prova, eseguire assuefazione (un giorno prima di iniziare l&#39;attività). Fai tutte le case alimentari liberamente accessibile e permettere ai topi di esplorare il labirinto liberamente e per recuperare una ricompensa pellet alimentare (10 min / animale). </li><li> Accendere il computer e la fotocamera e avviare il software di sistema di video-tracking. </li><li> Avviare la registrazione. </li><li> Posizionare l&#39;animale al punto iniziale definito sulla piastra circolare (Figura 5A, S: posizione iniziale) e permettere ai topi per cercare la casa cibo di destinazione per 10 min. </li><li> Stop video-tracking. </li><li> IMPORTANTE! Pulire la piastra circolare e le case alimentari dopo ogni prova con un rapido disinfettante. </li><li> Ripetere la prova giorno per sette giorni consecutivi (per animale). </li><li> Analizzare i risultati (latenza, distanza percorsa e errori) utilizzando il software di statistiche adeguate. Definire gli errori come avvicinarsi alla casa cibo sbagliato e / o contatto con l&#39;apposita casella senza entrare e recuperare la ricompensa pellet cibo. Per l&#39;analisi raggruppati utilizzare ANOVA a due vie con il test di Bonferroni post-hoc. </li><li> (FACOLTATIVO) Sacrifica i topi e analizzare il dell&#39;ippocampo come descritto di seguito. </li></ol> 3. BrdU Etichettatura <ol><li> Iniettare per via intraperitoneale 50 mg / kg ip BrdU una volta al giorno per 3 giorni (analisi di differenziazione e integrazione) o ip 200 mg / kg per una singola iniezione (analisi della proliferazione). </li><li> Sacrificare gli animali, sezionare l&#39;ippocampo e preparare 40 sezioni micron come descritto di seguito. </li><li> Denaturate l&#39;sezioni con 2 M HCl per 10 min e incubare in 0,1 M tampone borato per 10 min. </li><li> Etichettare una serie uno su dodici di 40 sezioni micron (240 micron a parte) da ciascun animale immunoistochimiche, come descritto di seguito utilizzando anticorpi diretti contro BrdU. </li><li> Quantificare le cellule marcate mediante analisi al microscopio confocale in tutta l&#39;estensione rostrocaudale dello strato di cellule dei granuli e la zona subgranular. Moltiplicare i numeri risultanti per 12 per ottenere il numero totale stimato di cellule BrdU marcato per ippocampo e dividere per due per ottenere il numero totale di cellule marcate per DG. </li></ol> 4. La rimozione dei cervelli e preparazione di criosezioni da Nonperfused Animali <ol><li> Osservare le procedure approvate a livello locale per eutanasia degli animali. I topi possono essere eutanasia direttamente da dislocazione cervicale. </li><li> (OPTIONAL) Gli animali possono essere anestetizzati prima euthanization secondo le linee guida locali e internazionali, ad esempio inje intraperitonealection di 0,8 ml Avertin per un mouse 33 g (appena fatto mescolando 150 ml di soluzione fatta di 2,2 mg 2,2,2-tribromoethanol in 1 ml di etanolo isoamyl con 1,85 ml di soluzione fisiologica o tampone fisiologico). </li><li> Sterilizzare la testa con Betadine (10% povidone-iodio)-garza imbevuta e tampone, successivamente con una garza imbevuta di etanolo al 70%. </li><li> Decapitare l&#39;animale utilizzando opportuni forbici chirurgiche e tirare la pelle da parte. </li><li> (OPZIONE) fissatori possono essere adottate per evitare di ripiegamento della pelle ritardato. </li><li> Effettuare una incisione mediana nel cranio e tirare con attenzione i frammenti di cranio da parte. </li><li> Rimuovere con attenzione l&#39;intero cervello con uno strumento chirurgico adeguato (ad es Moria Spoon). </li><li> Preraffreddare 25 ml di 2-metilbutano in un becher da 50 ml (ad es Schott Duran) a -30 a -40 ° C in ghiaccio secco. Nota: Per la colorazione libera fluttuazione delle sezioni &quot;spesse&quot;, che sono ideali per microscopio confocale a scansione laser, rimuovere il cervello, lavare 3volte in tampone e conservare a 4 ° C in tampone fosfato soluzione di saccarosio al 30% in 50 ml di tubo fino al cervello ha affondato giù alla parte inferiore (tipicamente durante la notte). </li><li> Posizionare con cura il cervello su un pezzo di Nescofilm (Parafilm) e coprire con grande quantità di composto TissueTek ottobre, congelare il Nescofilm in 2-metilbutano, conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: Per la conservazione a lungo tempo a -20 ° C in negozio il 9% di saccarosio, 7 MgCl 2 mM, 50 mM tampone fosfato, 44% glicerolo. </li><li> Tagliare il cervello in 10-12 micron di spessore sezioni su appropriate cryomicrotome. Nota: Per spessore, sezioni free-floating, congelare cervello su cryotome fase di un&#39;adeguata cryotome (es. Reichert Jung, Frigomobil.) E tagliare 40 micron sezioni orizzontali a -20 ° a - 25 ° C. Raccogliere sezioni da coltello con pennello fine e raccogliere in tampone o mantenere in soluzione di storage (punto 4.9) a -20 ° C per la conservazione a lungo tempo. </li><li> Montare con cautela due fette su vetrini da microscopio singoli. Il use di vetrini Superfrost UltraPlus è altamente consigliato per massimizzare l&#39;adesione delle sezioni. </li><li> Essiccare i vetrini per 5 min a temperatura ambiente. I vetrini possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 5. Preparazione di sezioni da irrorati Animali <ol><li> Anestetizzare gli animali come descritto sopra (passo 4.2). </li><li> Profumato con attenzione l&#39;animale transcardially con tampone fosfato (PBS) contenente eparina (0,025 g/100 ml PBS) e procaina (0,5 g/100 ml PBS) per 2-4 min, seguiti da 4% paraformaldeide in PBS per 10-15 min . Perfusione viene eseguita in modo ottimale mediante perfusione attraverso il ventricolo sinistro e l&#39;apertura dell&#39;atrio destro utilizzando una pressione idrostatica di circa 1,2-1,4 m o utilizzando una pompa peristaltica impostato a circa 15 ml / min. Risultati di perfusione ottimale in un cervello bianco pallido, con vasi sanguigni rossi essere visibile. </li><li> Sezionare e post-fissare i cervelli in paraformaldeide 4% a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Cryoproteggere i cervelli in saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C per almeno 24 ore. </li><li> Congelare il cervello sul palco cryotome. </li><li> Preparare 40 micron sezioni orizzontali di intere forebrains utilizzando un cryotome appropriato. </li><li> I vetrini possono essere conservati in soluzione crioprotettore (tampone fosfato 0,1 M, 50% glicerolo, 0,14% MgCl 2, 8,6% di saccarosio) a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 6. L&#39;immunoistochimica di sezioni di cervello di Nonperfused Animali <ol><li> Post-fissare le criosezioni, preparate come sopra descritto, utilizzando -20 ° C metanolo freddo per 10 min. </li><li> Bloccare con siero normale 5% contenente 0,3% Triton-X (dalla specie che è stato utilizzato per sollevare l&#39;anticorpo secondario) per una notte a 4 ° C. </li><li> Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi primari notte a 4 ° C. </li><li> Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi secondari a temperatura ambiente per un&#39;ora. </li><li> Sciacquare 3x con 1x PBS </li><li> Counterstain la sezione di DNA utilizzando Sytox verde, o DAPI (o un colorante DNA alternativo). </li><li> Sciacquare 3x con 1x PBS </li><li> Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento. </li><li> Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per almeno 48 ore. </li></ol> 7. L&#39;immunoistochimica di sezioni di cervello di perfusione Animali <ol><li> Blocca come descritto nel passaggio 6.2 e successivamente incubare le sezioni di cervello fisse in soluzione di anticorpo primario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (fluttuante) notte a 4 ° C. </li><li> Risciacquare tre volte con PBS 1x e incubare in soluzione di anticorpo secondario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (liberamente fluttuante) a temperatura ambiente per 3 ore. </li><li> Sciacquare 3x con 1x PBS </li><li> Controcolorare la sezione di DNA utilizzando Sytox verde o DAPI (o un colorante DNA alternativo). </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x </li><li> Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento. </li><li> Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per unt almeno 48 ore. </li></ol> 8. Indagine su Mossy fibra Proiezioni <ol><li> Sacrificare gli animali, preparare 40 micron sezioni coronali come descritto sopra e macchiare la sezione dell&#39;ippocampo utilizzando un anticorpo per neurofilament M. </li><li> Scansione delle sezioni alla lunghezza d&#39;onda appropriata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser per visualizzarne le fibre coperte di muschio e nuclei. Avviare la scansione a basso ingrandimento. </li><li> Utilizzare le immagini a basso ingrandimento per l&#39;orientamento e indirizzare l&#39;ippocampo con le proiezioni in fibra di muschio. </li><li> Scansione delle sezioni (z-sezionamento) ad alta risoluzione e alto ingrandimento. </li><li> Analizzare l&#39;aspetto morfologico e la connettività delle fibre muschio visualizzate tramite colorazione per NF-M. </li><li> (OPTIONAL) Analizzare le dimensioni e il volume di lame dell&#39;ippocampo. Utilizzare il segnale DNA per le misurazioni. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Assay (neuronale morte cellulare) <ol><li> Sacrificare gli animali, sezionare il hippocAmpus, e preparare 12 sezioni micron come descritto sopra. </li><li> Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Fissare le sezioni in PFA 4% per 40 min a temperatura ambiente. </li><li> Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH 2 O. </li><li> Incubare le sezioni con permanganato di potassio 0,06% (KMnO 4) per 10 min in continuo, agitando delicatamente. </li><li> Lavare le sezioni 3x con DDH 2 O. </li><li> Incubare le sezioni con 0,002% di soluzione Fluoro-Jade C per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> (Opzionale) per colorazioni nucleari simultanee, una soluzione 0,002% Fluoro-Jade C può essere completato con 10 mg / ml DAPI. </li><li> Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH 2 O. </li><li> Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le sezioni con xilene (1 min) </li><li> Montare le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene (DPX). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Neurogenesi adulta, e la possibilità della sua manipolazione attraverso l&#39;inibizione di NF-kB nei neuroni, e la sua riattivazione in seguito con doxiciclina, offre un affascinante sistema di indagini neuroni nel cervello adulto, così come in neuronale de-e ri-generazione . La bellezza di questo sistema è che NF-kB via di segnalazione inibizione dei neuroni non solo si traduce in cambiamenti nella morte neuronale, proliferazione progenitore e migrazione, i cambiamenti strutturali e anatomiche gravi, ma anche nei dife...

Ontologicamente, l&#39;ippocampo è una delle più antiche strutture cerebrali anatomiche conosciuti. E &#39;responsabile di diversi compiti complessi, come le funzioni cardine nella regolazione della memoria a lungo termine, l&#39;orientamento spaziale, e la formazione e il consolidamento della rispettiva memoria. Anatomicamente, l&#39;ippocampo è costituito da strati di cellule piramidali (strato piramidale), tra cui il cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 e CA4), regioni ed il giro dentato (giro Dentato), che contiene granuli e alcuni progenitori neuronali nella propria zona di subgranular . Le cellule granulari proiettano verso la regione CA3 tramite le cosiddette fibre di muschio (assoni delle cellule granulari). Fino alla fine del secolo scorso, il cervello dei mammiferi adulti è stato creduto di essere un organo statico privo di plasticità e neurogenesi cellulare. Tuttavia, durante gli ultimi due decenni, una crescente quantità di prove dimostra chiaramente neurogenesi adulta si svolgono in almenodue regioni del cervello, la zona subventricolare (SVZ) e la zona subgranulare dell&#39;ippocampo. I nostri studi precedenti, e quelli di altri gruppi, hanno dimostrato che il fattore di trascrizione NF-kB è uno dei regolatori molecolari cruciali della neurogenesi adulta, e che i suoi risultati de-regolazione di gravi difetti strutturali dell&#39;ippocampo e menomazioni cognitive 1-6. NF-kB è il nome generico di un fattore di trascrizione inducibile composto da diverse combinazioni dimeriche di cinque-DNA-binding subunità: P50, P52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), gli ultimi tre dei quali hanno domini di transattivazione. All&#39;interno del cervello, la forma più abbondante nel citoplasma è un eterodimero di p50 e p65, che viene mantenuto in una forma inattiva da inibitore di kappa B (IkB)-proteine. Per studiare e manipolare direttamente neurogenesi NF-kB-driven, usiamo modelli di topi transgenici per consentire semplice inibizione di tutti i subun NF-kBsua, specificamente nel proencefalo 7 (vedi figura 1). A questo scopo, abbiamo Incrocio le seguenti linee di topo transgenico, IkB / - e -/tTA. Il transgenico IkB / - linea è stata generata utilizzando un mutante negativo trans-dominante di NF-kB-inibitore IκBa (super-repressore IκBa-AA1) 8. In contrasto con il wild-type IκBα, IκBα-AA1 è dotato di due residui di serina mutati di alanina (V32 e V36), che ostacolano la fosforilazione e la successiva degradazione del proteasoma dell&#39;inibitore. Per prosencefalo espressione di specifici neuroni del IκBa-AA1-transgene, IkB / - topi sono stati incrociati con i topi ospitare una chinasi calcio-calmodulina-dipendente IIα (CAMKIIα)-promotore che può essere guidato da tetraciclina trans-attivatore (AS) 9. p65 topi knock-out hanno un fenotipo letale embrionale, a causa della massiccia apoptosi fegato 10, quindi l&#39;approccio qui illustrato fornisce un metodo eleganteper indagare il ruolo di NF-kB in postnatale e neurogenesi adulta. Il test classico comportamentale per studiare l&#39;apprendimento spaziale e la memoria è stata descritta nel 1980 da Richard Morris, un test noto come Morris water-maze (MWM) 11. In questo open-campo di acqua-labirinto, animali imparano a fuggire da acqua opaca su una piattaforma nascosta basata su orientamento ed extra-labirinto spunti. Una variante secca MWM è il cosiddetto labirinto Barnes (BM) 12. Questo test utilizza una piastra circolare con 20 fori circolari disposti al confine di un piatto, con un foro definito come una scatola di fuga, e visivi spunti extra-labirinto per l&#39;orientamento. Entrambi i paradigmi sperimentali si basano sul comportamento in volo indotto da un roditore `s avversione per l&#39;acqua, o spazi aperti e luminosi illuminati. Entrambi i test permettono un&#39;indagine di orientamento spaziale, e le prestazioni della memoria correlati. Sebbene l&#39;ippocampo gioca un ruolo generale ed essenziale nella formazione della memoria spaziale, l&#39;ippocampo rEGIONI coinvolti variano a seconda del test applicato. La memoria testato in BM deriva da attività neuronale tra la corteccia enthorinal (CE) ei neuroni piramidali situate nella regione CA1 dell&#39;ippocampo senza il contributo della DG 13-16. In particolare, il classico BM si basa principalmente sulla navigazione tramite temporo-ammonico percorso monosinaptico da CE III CA1 CE V. È importante sottolineare che il DG è cruciale coinvolto nella cosiddetta pattern recognition spaziale 17, che non solo comporta il trattamento dei informazioni visive e spaziali, ma anche la trasformazione di rappresentazioni o di ricordi simili in rappresentazioni dissimili, non sovrapposti. Questo compito richiede un circuito tri-sinaptica funzionale da CE II alla DG per CA3 a CA1 e CE VI, che non può essere provato nel BM 15. Per affrontare queste sfide, abbiamo ideato SPS-BM come test comportamentali per verificare specificamente le prestazioni giro-dipendente dentate cognitive in collaborazioneanimali ntrol, e nel modello super-repressore IkB / tTA seguente inibizione di NF-kB. È importante sottolineare che, in contrasto con la MWM o la BM, il SPS-BM può rivelare sottili deficit comportamentali derivanti dal deterioramento della neurogenesi. Poiché spaziale-modello-separazione è strettamente dipendente da un circuito funzionale tra CE II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, questo test è altamente sensibile a potenziali cambiamenti di neurogenesi, modifiche del percorso fibra di muschio o alterazioni dell&#39;omeostasi del tessuto all&#39;interno del DG. Tecnicamente, il set-up del nostro test si basa sullo studio da Clelland et al., In cui il modello di separazione spaziale è stato testato utilizzando un legno 8-braccio braccio radiale labirinto (RAM) 19. Nel nostro modificata set-up, le otto bracci sono stati sostituiti da sette identici alimento case gialle. In sintesi, i metodi qui riportate, compresa l&#39;analisi dei DCX (+), le cellule-doublecortin esprimono all&#39;interno dell&#39;ippocampo, le proiezioni in fibra di muschio, neuronale delle cellule death e in particolare la SPS-BM qui presentato, può essere applicato a ricerche di altri modelli del mouse incorporano transgeni che hanno un impatto sulla neurogenesi adulta. Ulteriori applicazioni possono comprendere lo studio di agenti farmacologici e misurare il loro impatto sulla separazione modello DG e spaziale.

<table><tbody><tr><td>Moria MC17 Cucchiaio Forato&nbsp;</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>rimozione del cervello</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>rimozione del cervello</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche&nbsp;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>rimozione del cervello</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche&nbsp;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>rimozione del cervello</td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>rimozione del cervello SuperFrost</td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td>vetrini per immunoistochimica</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>fissativo</td></tr><tr><td>TissueTek OCT composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>1004200018</td><td>l'inclusione del cervello</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>blocco in IHC</td></tr><tr><td>Siero normale di coniglio</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td>blocco in IHC</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>blocco in IHC</td></tr><tr><td>anticorpi anti-neurofilamento-M</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi</td><td>2H3</td><td>IHC, diluizione 1:200</td></tr><tr><td>anti-Doublecortin&nbsp; anticorpo</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, diluizione 1:800</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>IHC, diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>anticorpo anti-BrdU</td><td>OBT0030G</td><td>Accurate Chemicals</td><td>IHC, diluizione 1:2.000&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoro-Jade C</td><td>FJ-C</td><td>HistoChem</td><td>Determinazione della morte cellulare neuronale</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td>disinfettante D08AG02</td><td></td></tr><tr><td>Criomicrotomo</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>preparazione di fette di cervello</td></tr><tr><td>Eparina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>perfusione Piastra circolare in plastica dura (diametro 120 cm)</td> <td>realizzata</td> <td>in laboratorionessuna</td><td>piastra per SPS-BM, diametro 120 cm</td></tr><tr><td>Disinfettante rapido Buraton&nbsp;</td><td>Sch&uuml; lke Mayr</td><td>113 911</td><td>disinfettante</td></tr><tr><td>Sistema di videolocalizzazione TSE VideoMot 2 con pacchetto software VideoMot2</td><td>TSE Systems</td><td>302050-SW-KIT</td><td>tracciamento e analisi di SPS-BM</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Permeabilizzazione Sigma Aldrich</td><td>T8787</td>/<td>IHC</td></tr><tr><td>Criotomo</td><td>Reichert Jung/Leica</td><td>Frigomobil 1206</td><td>preparazione di 40 &; m fette di cervello</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>inclusione dei vetrini</td></tr><tr><td>SYTOX verde</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Colorazione nucleare</td></tr><tr><td>Pellet alimentari (Kellog's Froot Loops)</td><td>Kellog's</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, versione 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, USA</td><td></td><td>Valutazione statistica del software SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 o Zen 2011</td><td>Carl Zeiss</td><td>Software (microscopio confocale</td><td></td>)</tr><tr><td>D.P.X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317616</td><td>mezzo di montaggio per la colorazione Fluoro-Jade C</td></tr></tbody></table>

metodi per la modulazione e analisi di nf-kb-dipendente adulti neurogenesi

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

L&#39;ippocampo gioca un ruolo fondamentale nella formazione e il consolidamento dei ricordi episodici, ed in orientamento spaziale. Storicamente, l&#39;ippocampo adulto è stato visto come una regione anatomica molto statica del cervello dei mammiferi. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che il giro dentato dell&#39;ippocampo è un&#39;area di enorme plasticità negli adulti, coinvolgendo non solo le modificazioni dei circuiti neuronali esistenti, ma anche neurogenesi adulta. Questa plasticità è regolata da reti trascrizionali complesse, in cui il fattore di trascrizione NF-kB gioca un ruolo di primo piano. Per studiare e manipolare neurogenesi adulta, un modello di topo transgenico per l&#39;inibizione neuronale specifico proencefalo dell&#39;attività di NF-kB può essere utilizzato. In questo studio, sono descritti metodi per l&#39;analisi di neurogenesi NF-kB-dipendente, compresi gli aspetti strutturali, apoptosi neuronale e progenitore proliferazione e significato cognitivo; la cucih specificamente è stato valutato attraverso un giro dentato (DG)-dipendente prova comportamentale, il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale (SPS-BM). Il protocollo SPS-BM potrebbe essere adattato solo per l&#39;uso con altri modelli animali transgenici destinati a valutare l&#39;influenza di particolari geni adulti neurogenesi ippocampale. Inoltre, SPS-BM potrebbe essere utilizzata in altre condizioni sperimentali intesi a studiare e manipolare apprendimento DG-dipendente, ad esempio, utilizzando agenti farmacologici.

Incroci delle IkB / - linee topo transgenico e tTA porta all&#39;inibizione condizionale dell&#39;attività di NF-kB nell&#39;ippocampo. Per studiare l&#39;espressione del IκBα-AA1-transgene nel doppio topo transgenico (Figura 1A), i cervelli sono stati isolati, cryosectioned e colorazione con un anticorpo contro GFP (green fluorescent protein). Microscopio confocale a scansione laser rivelato alta espressione del transgene nelle regioni CA1 e CA3, e nella DG...

Sono descritti metodi per la manipolazione e l&#39;analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali.

Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la funzione del fattore di trascrizione NF kappa B nel cervello adulto. Ciò si ottiene allevando per la prima volta topi transgenici che inibiscono specificamente l'attività di NF kappa B nei neuroni. La seconda fase della procedura consiste nel testare le conseguenze comportamentali dell'inibizione di NF kappa B utilizzando il modello spaziale, separazione o fienili, labirinto.Il terzo passo è l'attenta profusione degli animali, la rimozione del cervello e la corretta sezionazione dello stesso. Il passaggio finale consiste nell'analizzare gli effetti istologici e strutturali, come la visualizzazione delle proiezioni di fibre muschiose mediante immunocolorazione. In definitiva, l'utilizzo del test comportamentale seguito dall'istologia può correlare i cambiamenti nell'apprendimento dipendente dal giro dentato con i cambiamenti strutturali nei tessuti associati.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come Mars Vase è che i legami di separazione spaziale offrono l'opportunità di misurare in modo specifico i processi di apprendimento anti-bambino-dipendente, nonché la neurodegenerazione e la r

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Neuroscienze

Un modo per studiare l'integrazione del neonato granuli dentato negli animali adulti è descritto. Questa tecnica utilizza un retrovirus progettato per etichettare i neuroni neonati, seguita da registrazioni elettrofisiologiche in vivo per determinare integrazione funzionale.

Studiare l&#39;integrazione degli adulti nati Neuroni

La funzione dei neuroni di mammifero adulto-nato rimane un'area attiva di ricerca. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita di nuovi neuroni. Utilizzando la tomografia computerizzata guidata irradiazione focale (CFIR), tridimensionale anatomico di mira specifiche popolazioni progenitrici neurali può ora essere utilizzato per valutare il ruolo funzionale della neurogenesi adulta.

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

Migrazione neuroblasti è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti impiegando DNA / piccolo tornante RNA (shRNA) nucleofection e un saggio di migrazione 3D con neuroblasti isolati dal flusso migratorio rostrale roditore postnatale.

Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em&gt; In vitro</em

Questo articolo video illustra un protocollo completo per rilevare e quantificare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta all'interno della stessa sezione di tessuto. Abbiamo elaborato un metodo per superare i limiti dell'immunofluorescenza multipla indiretta che si verificano quando non sono disponibili anticorpi adatti da diverse specie ospiti.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un approccio per l'analisi del comportamento delle cellule staminali/progenitrici neurali adulte in risposta alla manipolazione chemiogenetica di uno specifico circuito neurale locale.

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Presentato qui è un metodo per sequenziare singoli nuclei isolati dal giro dentato del topo che esclude la maggior parte dei neuroni attraverso l'ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FAN). Questo approccio genera profili di espressione di alta qualità e facilita lo studio della maggior parte degli altri tipi di cellule rappresentati nella nicchia, comprese le popolazioni scarse come le cellule staminali neurali.

Ordinamento negativo dei neuroni dei nuclei attivati dalla fluorescenza combinato con il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo

Qui, descriviamo un sistema di nucleofecazione progettato per migliorare l'efficienza del rilascio genico in cellule staminali neurali espanse (NSC) isolate dalla zona subventricolare murina adulta. I risultati dimostrano che questo metodo migliora significativamente la perturbazione genica nelle NSC, superando l'efficacia dei protocolli di trasfezione tradizionali e migliorando il tasso di sopravvivenza cellulare.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

I saggi di crescita dei neuriti forniscono un valore quantitativo sui processi neuronali rigenerativi. Il vantaggio di questo software semiautomatico è che segmenta separatamente i corpi cellulari e i neuriti creando una maschera e misura vari parametri come la lunghezza dei neuriti, il numero di punti di diramazione, l'area del cluster cellula-corpo e il numero di cluster di cellule.

Standardizzazione di un nuovo software semiautomatico per la misurazione della crescita dei neuriti 

Scopri metodi per modulare e analizzare la neurogenesi adulta dipendente da NF-κB nel cervello. Questo protocollo utilizza il test comportamentale Barnes maze per valutare l'apprendimento spaziale nei topi.

Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

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