Name: Metodi per identificare le risonanze NMR dellammina 13C-dimetil N-terminale su proteine metilate riduttivamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Scopri metodi per assegnare le risonanze NMR dell'ammina dimetilica α ed ε del lisina N-terminale in lisozima mediante metilazione riduttiva selettiva e trattamento con aminopeptidasi.

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Questa ricerca è stata supportata dal premio numero R00RR024105 dal National Center For Research Resources, National Institute of Health.

1. Metilazione riduttiva del lisozima
<ol>
	<li>Preparare 500 ml di un tampone fosfato di sodio 50 mM a pH 7,5. Conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Etichettare tre provette per microcentrifuga da 1 ml per campioni completamente marcati (FLS), campioni parzialmente marcati a basso pH (LpH) e campioni parzialmente marcati a pH elevato (HpH).</li>
	<li>Pesare 10 mg di lisozima e sciogliere in 2 ml di tampone fosfato di sodio per creare una soluzione acquosa con una concentrazione di 5 mg/ml. Coprire le provette con un foglio di alluminio per proteggere la formaldeide dalla degradazione dovuta all'esposizione alla luce. Aggiungere 500 μl di soluzione di lisozima in ciascuna provetta.</li>
	<li>Preparare soluzioni fresche 1,0 M di complesso di dimetilammina borano (DMAB) e 13C-formaldeide. Conservare a 0 °C.</li>
	<li>Per il campione completamente marcato, utilizzare un rapporto molare di 1:10 (ammina reattiva: formaldeide) e per i campioni parzialmente marcati, utilizzare un rapporto 1:5. In alternativa, il rapporto può essere ottimizzato. Ad esempio, per vedere la dominanza del picco di C-dimetilammina α-13a pH basso, era necessario un rapporto 2:7.</li>
	<li>Aggiungere 6,1 μl di DMAB da 1,0 M a FLS, aggiungere 3,2 μl di DMAB da 1,0 M a LpH e HpH e vorticare delicatamente. Quindi aggiungere 12,3 μl di 1,0 M 13C-formaldeide a FLS e 6,1 μl di 1,0 M 13C-formaldeide a LpH e HpH. Agitare le miscele di reazione a 4 °C per 2 ore.</li>
	<li>Aggiungere un'altra aliquota di 1,0 M DMAB e 13C-formaldeide come nel passaggio precedente e agitare la miscela di reazione per una notte a 4 °C per un tempo di reazione totale di 18-24 ore.</li>
	<li>Sostituire il tampone del campione con fosfato a pH 7,5 per rimuovere i reagenti in eccesso e i prodotti collaterali utilizzando un filtro centrifugo (cut-off del peso molecolare di 3 kDa).</li>
	<li>Per i campioni parzialmente marcati, metilare riduttivamente i campioni a pH 7,5 con formaldeide naturale per creare una proteina modificata in modo omogeneo. Preparare nuove soluzioni 1.0 M di DMAB e formaldeide ad abbondanza naturale.</li>
	<li>Coprire le provette del campione con un foglio, aggiungere 6,1 μl di DMAB a LpH e HpH e agitare delicatamente. Quindi aggiungere 12,3 μl di formaldeide in abbondanza naturale. Agitare le miscele di reazione a 4 °C per 2 ore.</li>
	<li>Aggiungere un'altra aliquota di DMAB 1,0 M e formaldeide ad abbondanza naturale come nel passaggio precedente e agitare le miscele di reazione per una notte a 4 °C per un tempo di reazione totale di 18-24 ore. Quindi sostituire il tampone utilizzando i passaggi 2.5-2.6 e conservare campioni da 50 μg a -20 °C per MS.</li>
</ol>
2. Prepara il campione per l'analisi NMR
<ol>
	<li>Preparare una soluzione tampone borato di sodio 2,0 M a pH 8,5 in H2O.</li>
	<li>Aggiungere 375 μl di soluzione tampone borato di sodio 2,0 M in quattro provette coniche da 15 ml. Parafilmare le cime e fare dei buchi. Collocare il pallone in un pallone liofilizzante e congelare il campione.</li>
	<li>Posizionare il campione congelato su un liofilizzatore per asciugarlo. Rimuovere quando è asciutto.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, aggiungere 15 ml di D2O in ciascuna provetta e mescolare.</li>
	<li>Etichettare tre filtri centrifughi da 4 ml (3 kDa di taglio del peso molecolare) con FLS, LpH e HpH. Aggiungere il campione corrispondente alle provette filtranti (~500 μl). Aggiungere 3,0 ml di tampone borato di sodio 50 mM a pH 8,5 in ciascuna provetta. Realizzare una provetta di bilancia per la terza provetta e concentrare i campioni a 500 μl utilizzando una centrifuga con rotore ad angolo fisso di 35° a 4 °C e 7.500 rcf.</li>
	<li>Svuotare il sifone sotto ogni filtro. Aggiungere altri 3,0 ml di tampone ai campioni e concentrare nuovamente i campioni a 500 μl. Ripetere il passaggio 2.5 4 volte.</li>
	<li>Utilizzando il saggio della proteina dell'acido bicinconninico (BCA)36, determinare la concentrazione di ciascun campione. Diluire i campioni di lisozima con 50 mM di tampone borato di sodio per ottenere campioni da 150 μM.</li>
	<li>Trasferire 530 μl in una provetta NMR da 5 mm o 250 μM in una provetta da 5 mm con suscettibilità magnetica abbinata.</li>
	<li>Preparare una soluzione madre da 80 mM di 1,2-dicloroetano-13 C2 in D2O. Conservare questa soluzione madre a -80 °C. Diluire a 24 mM in 80 μl e trasferire in una provetta con inserto coassiale da utilizzare come riferimento nell'analisi NMR. Analizzare i campioni con NMR. Nota: Eseguire un HSQC 1D 1 H-13C e integrare le aree di picco per ogni risonanza. Le aree di picco dovrebbero essere le stesse per il campione completamente etichettato.</li>
</ol>
3. Degradazione dell'aminopeptidasi del lisozima
<ol>
	<li>Preparare una soluzione di 5 mg/ml di lisozima in acqua ultrapura.</li>
	<li>Aggiungere 250 μl della soluzione di lisozima in una provetta da centrifuga pulita da 1 ml.</li>
	<li>Aggiungere 25 μl di una soluzione di tricina 0,1 M, pH 8,0 e 6 μl di una soluzione di Aeromonas proteolytica aminopeptidasi da 2,16 μg/ml.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 6 ore.</li>
	<li>Aggiungere altri 6 μl della soluzione di aminopeptidasi da 2,16 μg/ml al campione per ottenere un rapporto molare 1:50 tra aminopeptidasi e lisozima. Incubare per ulteriori 20 ore a 37 °C.</li>
	<li>Dissalare 30 μl del campione utilizzando una colonna di centrifuga C18 (seguire il protocollo del produttore). Conservare a -20 °C per l'analisi MALDI MS.</li>
	<li>Preparare il campione proteico rimanente per la risonanza magnetica nucleare come descritto nel protocollo 2).</li>
</ol>
4. Preparare i campioni per la spettrometria di massa
<ol>
	<li>Utilizzando i 50 μg di campione riservati al punto 2.3, sostituire il tampone con 100 mM di bicarbonato di ammonio, pH 8,0 e concentrare a circa 50 μl utilizzando un filtro centrifugo da 1 ml (3 kDa di taglio del peso molecolare). Trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 1 ml e avvolgerlo in un foglio di alluminio.</li>
	<li>Aggiungere 2,0 μl di 500 mM di ditiotreitolo per ridurre i legami disolfuro. Incubare la soluzione a 60 °C per 1 ora.</li>
	<li>Aggiungere 2 μl di iodoacetamide 500 mM appena preparato per alchilare i gruppi tiolici. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Rimuovere la pellicola e aggiungere 1,0 μl della soluzione di ditiotreitolo da 500 mM per estinguere la reazione.</li>
	<li>Aggiungere 2,0 μg di tripsina di grado sequenziale per digerire la proteina. Incubare la miscela a 37 °C per 16-24 ore.</li>
	<li>Aggiungere TFA fino a quando il pH è inferiore a 2 per placare la digestione. (Possono essere utilizzati anche acido formico e acetico)</li>
	<li>Desalinizzare il campione su una colonna di centrifuga C18 ed eluire la proteina in acetonitrile all'80% e TFA allo 0,1%. Asciugare il campione utilizzando un concentratore sottovuoto.</li>
	<li>Ricostituire il campione in 5,0 μl di acetonitrile al 50% e TFA allo 0,1% per l'analisi MALDI MS. Miscelare volumi uguali del campione ricostituito e una soluzione satura di matrice di acido 2,5-diidrossibenzoico sulla piastra bersaglio MALDI. Analizzare i campioni su un MALDI MS. Nota: utilizzare il tandem MS per confermare l'identità dei picchi peptidici. Smussare gli spettri di massa e analizzarli. Per ogni peptide contenente dimetilammina, determinare l'intensità del picco e l'area del picco di ciascun isotopo nel profilo. Calcola la percentuale di 13C-incorporazione come descritto in precedenza34.</li>
</ol>

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L'assegnazione dei segnali NMR di 13proteine C-metilate in modo riduttivo è necessaria per utilizzare appieno questo metodo di marcatura isotopica. L'uso della MS per facilitare l'assegnazione dei segnali NMR attraverso la correlazione dei dati parziali di incorporazione del C 13è una tecnica promettente. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi di assegnazione è che è necessaria solo la sequenza di amminoacidi primari. Il metodo di assegnazione assistita da MS è limitato quando l'amm...

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è un prezioso strumento di chiarimento della struttura per le proteine1. La spettroscopia NMR può essere utilizzata per determinare la struttura in soluzione di una proteina nel suo stato nativo. Per superare la bassa abbondanza naturale di isotopi magnetici stabili, è necessario incorporare 13C e 15N nella proteina di interesse. Il metodo più comunemente impiegato è l'espressione ricombinante in un ospite batterico2-3. Tuttavia, due svantaggi della sovraespressione dell'ospite batterico sono che non può produrre modifiche post-traduzionali e non funziona per tutte le proteine3-4. Quando l'espressione batterica non è una via praticabile per la produzione di proteine, può essere utilizzata la sovraespressione negli ospiti non batterici, ma la marcatura isotopica è difficile e costosa5. I metodi di espressione alternativi per incorporare gli isotopi 13C e 15N nelle proteine per l'analisi NMR includono tecniche di marcatura sparsa utilizzando precursori metabolici per la marcatura metilica6 e singoli amminoacidi 13C, 15N7-9. Un approccio chimico alla marcatura sparsa utilizzato qui è la ben nota reazione riduttiva di metilazione a 13C (Figura 1), in cui i gruppi amminici primari di una proteina - la α-ammina N-terminale e la lisina, catena laterale ε-ammine - sono metilati. Una volta formate le monometilammine, l'ammina subisce nuovamente metilazione, a causa del valore di pKa più elevato, per formare dimetilammine.
La metilazione riduttiva è stata introdotta per la prima volta come metodo per modificare chimicamente le proteine da Means e Feeney10. I vantaggi di questa reazione sono la sua ampia applicabilità e le condizioni di reazione blande a pH fisiologico tamponato e basse temperature11,12. In presenza di formaldeide e di un agente riducente, come il complesso dimetilammina borano (DMAB), i gruppi ε-amminici di lisina e il gruppo N-terminale α-amminico vengono metilati selettivamente per produrre ammine dimetilate. Sebbene la formaldeide sia nota per reticolare le proteine attraverso la formazione di ponti metilene, questo processo è bloccato dall'agente riducente13,14.
La metilazione riduttiva è stata utilizzata con successo per studiare le proteine sia con NMR che con cristallografia a raggi X. La metilazione riduttiva viene utilizzata per facilitare la cristallizzazione di proteine altrimenti intrattabili15. Il lisozima dell'albume d'uovo di gallina è stata la prima proteina cristallizzata nella sua forma dimetilata. La differenza quadratica media tra gli atomi pesanti nelle strutture di lisozima metilato e non metilato è 0,40 Å16. Questo confronto dimostra che la struttura proteica può essere mantenuta dopo la metilazione riduttiva, rendendo la reazione un valido strumento di marcatura per la delucidazione della struttura.
Utilizzando 13formaldeide marcata con C nella reazione di metilazione riduttiva, vengono prodotte 13ammine C-dimetilate. Le 13C-dimetilammine sono sonde rilevabili NMR che sono state ampiamente utilizzate per studiare la dinamica, la struttura e la funzione delle proteine. La NMR e la C-metilazione riduttiva 13sono state utilizzate per studiare le interazioni proteina-ligando e proteina-proteina per il recettore adrenergico17 β2, la ribonucleasi A18, il lisozima19, la proteina20 del gene fd 5 e il citocromo c21. Allo stesso modo, sono state studiate le proprietà strutturali e funzionali della ribonucleasi A22 riduttivamente metilata 13, del lisozima23, della proteina24 del gene fd 5, della ferredossina25 di Clostridium pasteurianum, del frammento Fc di IgG26, dell'apolipoproteina A-I27 e del MIP-1α28 La dinamica dei 13gruppi C-dimetilamminici è stata studiata sulla concanavalina A29-30 e sulla calmodulina31.
Anche se la C-metilazione riduttiva 13è stata ampiamente utilizzata per studiare le proteine con NMR, il metodo di marcatura è sempre stato limitato dalle difficoltà di assegnare le risonanze NMR26. La maggior parte delle strategie di assegnazione per riduttivamente 13proteine C-metilate si sono basate su un piccolo numero di siti,20,28 proprietà strutturali note11,19,23,26,31,32. o estese modificazioni genetiche33. Nessuno di questi studi è riuscito ad assegnare tutti i 13picchi di C-dimetilammina, ad eccezione dello studio della calmodulina, in cui i picchi sono stati assegnati mediante mutagenesi sito-specifica di ciascuna lisina33. Nello studio della formazione di dimeri MIP-1α, l'uso della spettrometria di massa (MS) per aiutare nell'assegnazione NMR di 13ammine C-metilate riduttive è stato riportato per la prima volta28. La MS a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF) MS è stata utilizzata per identificare la lisina all'interfaccia del dimero. Le lisine parzialmente metilate dei peptidi trittici umani MIP-1α sono state identificate con la SM e correlate con la comparsa di segnali mono- e dimetilamminici della proteina intatta osservati negli spettri 2D 1 H-13C HSQCNMR 28. Il nostro gruppo ha ampliato l'uso della SM e ha presentato un metodo di assegnazione che non richiede alcuna conoscenza preliminare della struttura o delle proprietà della proteina oltre alla sequenza di amminoacidi34. Questo metodo è applicabile alla maggior parte delle proteine. Un'eccezione è quando una proteina ha una lisina N-terminale perché il profilo isotopico MS della lisina N-terminale α- e ε-13C-dimetilammine non può essere misurato in modo indipendente.
Qui presentiamo due metodi, uno chimico e uno enzimatico, per identificare i siti N-terminali α-dimetilammina e la catena laterale ε-dimetilammina di un residuo di lisina N-terminale. Il primo metodo è stato ispirato da Córdova et al.che ha utilizzato il pH per controllare la selettività dell'acetilazione delle proteine35. La reazione favorisce la α-ammina N-terminale a pH basso e la catena laterale ε-ammine a pH elevato, permettendo di distinguere i gruppi proteici α- e ε-amminico, nei loro studi, con l'elettroforesi capillare35. Dimostriamo come un pH alto e basso venga utilizzato per alterare la marcatura di gruppi amminici proteici utilizzando la reazione riduttiva di metilazione a 13C e per consentire l'applicazione della strategia di assegnazione assistita da MS. Il secondo metodo per assegnare le C-dimetilammine N-terminali α- e ε-13sfrutta la rimozione selettiva del/i residuo/i N-terminale utilizzando l'aminopeptidasi ricombinante Aeromonas proteolytica.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Amicon Ultra 4 ml (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidasi</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidasi-86A</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Complesso borano-dimetilammina</td><td>Sigma</td><td>180238</td><td>Preparare una soluzione fresca 1 M prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Insulina pancreas bovina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonne di rotazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dicloroetano-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>Soluzione madre da 80 mM conservata a -80 °C. Utilizzata come riferimento negli spettri NMR a 24 mM.</td></tr><tr><td>Formaldeide (36,5% in peso/peso)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>Preparare una soluzione fresca 1 M prima dell'uso.</td></tr><tr><td>13C-formaldeide (99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>Preparare una soluzione fresca 1 M prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Lisozima (albume d'uovo di gallina)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato (eptaidrato bibasico)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato (monobasico)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS con sonda HCN 5922 da 5 mm</td><td>Agilent Tecnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per identificare le risonanze nmr dell'ammina 13c-dimetil n-terminale su proteine metilate riduttivamente

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica collaudata per studi sulla struttura e la dinamica delle proteine. Per studiare le proteine con NMR, gli isotopi magnetici stabili sono tipicamente incorporati metabolicamente per migliorare la sensibilità e consentire l'assegnazione sequenziale della risonanza. La C-metilazione riduttiva del 13è un metodo di marcatura alternativo per le proteine che non sono suscettibili di sovraespressione dell'ospite batterico, il metodo più comune di incorporazione degli isotopi. La C-metilazione riduttiva 13è una reazione chimica eseguita in condizioni blande che modifica i gruppi amminici primari di una proteina (gruppi ε-amminici della lisina e gruppo α-amminico N-terminale) in 13gruppi C-dimetilamminici. La struttura e la funzione della maggior parte delle proteine non vengono alterate dalla modifica, rendendola una valida alternativa alla marcatura metabolica. Poiché la metilazione riduttiva del 13C aggiunge marcature isotopiche sparse, i metodi tradizionali di assegnazione dei segnali NMR non sono applicabili. È stato sviluppato un metodo di assegnazione alternativo che utilizza la spettrometria di massa (MS) per facilitare l'assegnazione dei segnali NMR della proteina 13C-dimetilammina. Il metodo si basa su quantità parziali e diverse di 13C-marcatura in ciascun gruppo amminico primario. Una limitazione del metodo sorge quando il residuo N-terminale della proteina è una lisina perché i gruppi α- e ε-dimetilamminico di Lys1 non possono essere misurati individualmente con la MS. Per aggirare questa limitazione, vengono descritti due metodi per identificare la risonanza NMR delle 13C-dimetilammine associate sia alla α-ammina N-terminale che alla catena laterale ε-ammina. I segnali NMR della α-dimetilammina N-terminale e della catena laterale ε-dimetilammina del lisozima dell'albume d'uovo di gallina, Lys1, sono identificati in 1spettri di coerenza quantistica singola eteronucleare H-13C.

Metilazione riduttiva e pH
È stata dimostrata una reazione chimicamente selettiva di riduttiva metilazione con 13C su lisozima indotta dal pH. A pH basso, la reazione preferisce l'ammina α del gruppo N-terminale rispetto alle ammine ε delle catene laterali, e viceversa a pH elevato. In soluzione, i gruppi amminici della proteina esistono in equilibrio tra l'ammina libera e l'acido coniugato, equilibrio regolabile tramite il pH. L'intervallo di pH ottimale per questa reazione d...

Vengono descritti due metodi per assegnare i segnali di risonanza magnetica nucleare α- e ε-dimetilammina di una lisina N-terminale riduttivamente metilata 13C. Un metodo utilizza la selettività indotta dal pH della reazione di metilazione riduttiva e l'altro utilizza l'aminopeptidasi per rimuovere selettivamente la lisina N-terminale.

Metodi per identificare le risonanze NMR dell'ammina 13C-dimetil N-terminale su proteine metilate riduttivamente

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di assegnare il carbonio alfa ed epsilon. 13 dimetilammina risonanza NMR della lisina terminale terminale, residuo di lisozima. Ciò si ottiene metilando prima in modo riduttivo il lisozima a pH basso e alto, con una quantità subgeometrica di carbonio-13 formaldeide.Il secondo passo consiste nel metilare in modo riduttivo i campioni di pH basso e alto con un'abbondanza naturale in eccesso per la formaldeide per completare la metilazione. Il passaggio finale consiste nello scambiare i campioni metilati in modo riduttivo in tampone D due O per l'analisi NMR. Nel secondo metodo, l'obiettivo viene raggiunto mediante la degradazione dell'amminopeptidasi di un campione di lisozima.Il secondo passo consiste nel metilare riduttivamente il campione di proteina troncata con un eccesso di carbonio-13 formaldeide, seguito dallo scambio di tampone per l'analisi NMR. In definitiva, la spettroscopia NMR viene utilizzata per mostrare l'assenza di risonanza metilica del carbonio 13 per effettuare assegnazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente l'assegnazione univoca delle risonanze alfa e SSON dimet

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Metodi per identificare le risonanze NMR delle ammine N-terminali 13C-dimetilici su proteine metilati riduttivamente

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