Name: La supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Impara a integrare acidi grassi polinsaturi nella dieta di Caenorhabditis elegans per studiare la loro funzione metabolica e fisiologica. Questo metodo consente di analizzare la composizione lipidica e valutare gli effetti sulla sterilità.

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Ringraziamo Chris Webster per l&#39;esecuzione degli esperimenti preliminari mostrati in Figura 3 dei risultati rappresentativi e Jason Watts e Chris Webster per gli utili commenti sul manoscritto. Finanziamento per questo studio è stato fornito da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) per JLW. Alcuni ceppi di nematodi utilizzati in questo lavoro sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è finanziato dall&#39;Ufficio NIH di programmi di infrastrutture di ricerca (P40 OD010440).

Gli acidi grassi polinsaturi sono sensibili al calore, luce e ossigeno. Pertanto, occorre prestare attenzione quando si prepara piatti di integratori di acidi grassi tale che gli acidi grassi non siano esposti a eccesso di calore e di luce. Supporti NGM contenenti 0,1% Tergitol (NP-40) è autoclavato e parzialmente raffreddati, dopo che i sali sodici degli acidi grassi sono aggiunti con agitazione costante. Le piastre vengono lasciati asciugare al buio. Assorbimento di acidi grassi da C. elegans coltivati ​​su queste piastre possono poi essere monitorata mediante gascromatografia. 1. Preparazione di acidi grassi integrato multimediale <ol><li> Misurare componenti multimediali in un pallone di dimensioni adeguate. Per 1 L, aggiungere 17 g Bacto-agar, 2,5 g di triptone, 3 g di NaCl, 1 colesterolo ml 5 mg / ml disciolto in etanolo e 10 ml 10% tergitol disciolto in acqua. </li><li> Aggiungere 80% del volume finale di acqua desiderata Millipore e autoclave media con bottiglie di vetro vuoto (uguale al numero di differenticoncentrazioni di acidi grassi da testare), e anche opportuno cilindri graduati. </li><li> Media freddi in un bagnomaria regolato a 55 ° C. Mentre i media si raffredda preparare la soluzione madre di lavoro del sale di acido grasso di sodio rompendo aperta la fiala di vetro, utilizzando misure di sicurezza e garantire particelle di vetro non si mescolano con gli acidi grassi. Pesare acido grasso abbastanza per fare una scorta di lavoro 100 mm. </li><li> Portare la soluzione di acido grasso ad una concentrazione finale di 100 mM con acqua purificata. Sciogliere completamente il sale di sodio dell&#39;acido grasso richiede in genere circa 20-30 min. Spurgare il lavoro stock di acido grasso con argon o azoto, perché il contatto con un gas inerte impedisce l&#39;ossidazione. Tappare il flacone e conservare lo stock lavorare al buio fino a quando i media si è raffreddato. </li><li> (Facoltativo) Se si desidera RNAi supporto, misurare ampicillina e soluzioni isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) qui. </li><li> Quando l&#39;agar è raffreddato a 55 ° C per aggiungere 1 L: 1ml di 1 M MgSO4, 1 ml di 1 M CaCl 2, e 25 ml di tampone fosfato (108,3 g KH 2 PO 4 e 35,6 g K 2 HPO 4 per 1 L autoclavato). Aggiungere la soluzione IPTG se la fabbricazione di piastre di RNAi filtro ampicillina sterilizzato e. Per tutti i tipi di piastre, aggiungere acqua sterile per portare il volume finale a supporti 1 L. </li><li> Vicino a una fiamma, trasferimento multimediale in un autoclave e di dimensioni adeguate cilindro graduato e aggiungere acqua sterile calda per volume desiderato. Media Transfer torna a pallone iniziale e mescolare agitando. </li><li> Vicino a una fiamma, trasferire file multimediali in un certo numero di bottiglie pari al numero di concentrazioni da testare misurando con una autoclavato e di dimensioni adeguate cilindro graduato. Mantenere i media aliquotate come liquido con un bagno di acqua fino a quando il lavoro stock acido grasso si è completamente dissolto. </li><li> Mettere una bottiglia su un piatto mescolare e mescolare fino a quando la media è calda al tatto, ma non calda. Assicurarsi di lasciare se stessi abbastanzatempo di suscitare nella soluzione stock di acidi grassi e versare le piastre prima della media comincia a solidificare. Se piastra di agitazione ha il controllo della temperatura, impostarlo a 55 ° C. </li><li> Diluire il lavoro stock acido grasso 100 mm nella media per la concentrazione finale desiderata. Supporti Mescolare finché il precipitato bianco è in soluzione (circa 1 minuto). Il materiale può essere ancora leggermente torbida dopo. </li><li> (Facoltativo) Se RNAi supporto si desidera aggiungere l&#39;ampicillina a 0,1 mg / ml e IPTG a 2 mm di concentrazione finale. </li><li> Versare memoria utilizzando un aiuto pipetta automatizzata e una sterile 25 ml pipetta, aggiungere 8 ml di media per 60 millimetri piastra o 25 ml di mezzi per mm piastra 100. Ripetere aggiunta di acido grasso e piastra versando passaggi per i restanti bottiglie. </li><li> Dopo l&#39;agar è solidificato, coprire le piastre acidi grassi completata con una scatola o conservare a temperatura ambiente in un cassetto ben ventilati per proteggere dall&#39;ossidazione luce. </li><li> Seed E. coli OP50 sulle piastre, due giorni dopo piastre sono secchi.Per piastre 60 mm, pipetta 300 microlitri di una cultura OP50 overnight (coltivato a 37 ° C). Se sono stati versati piatti RNAi, seminare con 300 ml di batteri RNAi dopo che le piastre si sono asciugati per quattro giorni. Piatto tempo di asciugatura può essere necessario regolare a causa di differenze di umidità in vari ambienti di laboratorio. </li><li> Incubare le piastre in un ambiente buio a temperatura ambiente, mentre il prato batterica sta asciugando. </li></ol> 2. Indurre cellule germinali distruzione da supplementazione di DGLA <ol><li> C. elegans coltivate su piastre contenenti 0,3 DGLA mm (20:03 n-6) diventano sterili a causa della distruzione delle cellule germinali in entrambi palco e adulti nematodi larvali. <ol><li> Preparare una popolazione sincronizzato di L1 larve trattando ermafroditi gravide con soluzione di ipoclorito alcalino (per una soluzione di 10 ml: 0,5 ml di NaOH 5 M, 2,5 ml di candeggina, e 7 ml H 2 O). Agitare delicatamente gli ermafroditi gravide in questa soluzione fino a quando il verme adultos dissolvenza. Le uova saranno conservati e possono essere pellet per centrifugazione a bassa velocità. </li><li> Lavare preparazione uovo 3 volte in tampone M9 (3 g di KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml di 1 M MgSO 4, H 2 O a 1 L. Aggiungi MgSO 4 dopo la sterilizzazione in autoclave). Per fornire abbastanza ossigeno, risospendere le uova in un tubo di plastica da 15 ml per un volume finale di 5 ml di tampone M9 e roccia su un agitatore notte. </li><li> L1 larve deve essere aggiunto alle piastre, completata due giorni dopo la semina con OP50, o un giorno dopo placcatura batteri RNAi. Incubare vermi a 20 ° C per tre giorni fino a raggiungere lo stadio adulto. </li></ol></li><li> Vermi adulti possono essere lanciati per la sterilità utilizzando un microscopio da dissezione con abbastanza alto ingrandimento per visualizzare gli embrioni in via di sviluppo in utero. Perdita di cellule germinali successo apparirà come un utero chiaro vuoto di uova. </li><li> I worm possono anche essere ottenuto mediante la fissazione e colorazione con la nucleico uncid colorante diamindinophenylindole (DAPI), che facilita la visualizzazione dei nuclei nelle cellule germinali e embrioni di sviluppo. Una macchia DAPI rapida si ottiene prelevando vermi in una goccia di tampone M9 su un vetro d&#39;orologio 9. <ol><li> Flood vetro di orologio con 1 ml di 0,2 ng / m. DAPI in soluzione di etanolo al 95%, lasciar riposare per circa 5 min. </li><li> Scegli vermi in una goccia di Vectashield su un vetrino, e poi coprire con un vetrino. </li><li> Seal vetrino e conservare a 4 ° C al buio durante la notte per la colorazione ottimale, tuttavia diapositive possono anche essere visualizzati immediatamente. Punteggio di presenza o assenza di nuclei di cellule germinali usando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una lampada UV e filtro. </li></ol></li></ol> 3. Confermando Fatty Acid assorbimento da gascromatografia Nel complesso composizione di acidi grassi C. elegans possono essere determinate con la produzione di esteri metilici degli acidi grassi (FAME), che vengono poi separati e quantificate usando chr gasomatography 4. <ol><li> Raccogliere 500-1000 vermi adulti da loro lavando via delle piastre con acqua e trasferimento in un silanizzata 13 millimetri x 100 millimetri tubo tappo a vite in vetro. </li><li> Lasciate che i vermi si depositano per gravità, e quindi rimuovere quanta più acqua possibile con una pipetta Pasteur di vetro. </li><li> Lavare worm una volta con acqua, e poi di nuovo eliminare quanta più acqua possibile. </li><li> FAMEs sono formati aggiungendo 1 ml di 2,5% H 2 SO 4 in metanolo, quindi riscaldamento a 70 ° C per 1 ora in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Rimuovere i tubi dal bagnomaria e lasciare raffreddare per 1 min. </li><li> Estrarre FAMEs aggiungendo 1,5 ml di acqua e 0,25 ml di esano. </li><li> Tubi Recap e agitare vigorosamente. </li><li> Provette da centrifuga in una centrifuga da tavolo clinico per 1 min alla massima velocità per separare esano dal solvente acquoso. </li><li> Trasferire esano (strato superiore) per un inserto GC fiala in una fiala GC, facendo attenzione a non trasferire qualsiasi della fase acquosa. Per GC unanalisi, 1-2 ml di FAMEs in esano viene iniettato in un capillare gascromatografia in colonna polare adatto per l&#39;analisi FAMEs. Il Agilent 7890 GC iniettore è fissata a 250 ° C, con una portata di 1,4 ml / min, e il forno GC è programmato per una temperatura iniziale di 130 ° C, che è tenuto per 1 min. Successivamente, la temperatura viene rampa 10 ° C / min fino a 190 ° C, e poi rampa di nuovo a 5 ° C / min fino a 210 ° C e mantenuta ancora per 1 min. </li><li> Per garantire è verificato che l&#39;assorbimento di DGLA, analizzare FAMEs dalla ionizzazione di fiamma rilevamento (FID) o spettrometria di massa (MS) rilevazione, utilizzando standard autentici per l&#39;identificazione del C. elegans acidi grassi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui si descrive un metodo di supplementazione di C. elegans con acidi grassi insaturi nella dieta. Come accennato in precedenza, è necessario prestare attenzione nella preparazione di piatti PUFA, completata perché la natura reattiva dei doppi legami in PUFA causa questi acidi grassi siano sensibili all&#39;ossidazione mediante calore e luce 11. Per evitare l&#39;ossidazione, è importante aggiungere il PUFA al mezzo liquido agar dopo che il supporto è raffreddato a 55 ° C e memorizza le piastre in un...

Acidi grassi sono componenti strutturali essenziali delle membrane nonché molecole di immagazzinamento dell&#39;energia efficiente. Inoltre, gli acidi grassi possono essere scissi dalla membrane cellulari da lipasi e essere enzimaticamente modificati per produrre effettori di segnalazione 1. Naturalmente presenti acidi grassi polinsaturi (PUFA) contengono due o più doppi legami cis. Gli acidi grassi omega-3 e gli acidi grassi omega-6 si distinguono tra loro in base alle posizioni di legami doppi rispetto alla fine metilico dell&#39;acido grasso. Le diete sane richiedono sia gli acidi grassi omega-3, omega-6 e. Tuttavia, le diete occidentali sono particolarmente ricchi di omega-6 acidi grassi e povera di acidi grassi omega-3. Un alto omega-6 rapporto omega-3 acidi grassi è associata ad aumentato rischio di malattie cardiovascolari ed infiammatorie, tuttavia, le precise funzioni benefici e dannosi degli acidi grassi specifici non sono ben compresi 2. Gli ascaridi Caenorhabditis Elegans è utile nello studio funzione acido grasso perché sintetizza tutti gli enzimi necessari per produrre una gamma di acidi omega-6 e omega-3 grassi, compreso un omega-3 desaturasi, un&#39;attività che è assente nella maggior parte degli animali 3,4. Mutanti privi di grassi acido enzimi desaturasi non riescono a produrre PUFA specifici, portando ad una serie di difetti di sviluppo e neurologici 4-6. Per studiare gli effetti fisiologici degli acidi grassi alimentari, abbiamo sviluppato un saggio biochimico compatibile con l&#39;analisi genetica utilizzando sia tecniche di RNAi di knock-down mutante e in C. elegans. Supplementazione con PUFA specifici è ottenuto aggiungendo una soluzione di sale di sodio di acido grasso per mezzo di agar prima di versare. Ciò si traduce in PUFA assorbimento della E. fonte di cibo coli, dove si accumula nelle membrane batteriche. C. elegans ingerire i batteri PUFA contenenti, e questa integrazione alimentare è sufficiente per salvare il difettosots di mutanti PUFA-deficienti. La supplementazione della maggior parte degli acidi grassi ha effetti negativi sul tipo di animali selvatici, tuttavia, specifici acidi grassi omega-6, in particolare dihomo-acido gamma linolenico (DGLA, 20:03 n-6), causare una distruzione permanente di C. elegans cellule germinali 7,8. Cromatografia gas è utilizzato per monitorare l&#39;assorbimento dell&#39;acido grasso integrato nella fonte alimentare batterica (sia OP50 o HT115) nonché nei nematodi. L&#39;aggiunta del tergitol detersivo (NP-40) nei mezzi permette una distribuzione uniforme degli acidi grassi attraverso l&#39;intera piastra e l&#39;assorbimento più efficiente degli acidi grassi della E. coli e nematodi. Abbiamo trovato che gli acidi grassi insaturi sono prontamente assorbiti da batteri e C. elegans, ma l&#39;assorbimento di acidi grassi saturi è molto meno efficiente. Questo articolo descrive passo-passo come integrare il supporto agar con acidi grassi, e come monitorare l&#39;assorbimento degli acidi grassi in the nematodi mediante gascromatografia.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>(5 mg/mL in etanolo)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodio diomogamma linolenate</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td> <td>calda sterile Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile per la raccolta dei vermi</td> Acqua priva di <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nucleasi per soluzione madre DGLA</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml in acqua (per piastre RNAi)</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M in acqua (per piastre RNAi)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinofenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Flask</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglie di vetro autoclavabili con agitatori</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato in vetro autoclavabile</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di agitazione</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua a 55+ &deg; C</td><td>Precisione Scientifica Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Tappo a vite Flaconcino in vetro marrone</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio</td><td></td><td></td><td></td>di gas argon</tr><tr><td>Aiuto per pipette automatizzato</td><td>Pipette-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>Tubo di vetro silanizzato</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>per derivatizzazione FAME</td></tr><tr><td>Tappi a vite in PTFE</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga clinica da tavolo</td><td>IEC</td> GC Fiala a crimpare SUN <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Inserto per fiala</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Tappo per fiala</td><td>Gascromatografo SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Rivelatore per spettrometria di massa</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna per gascromatografia</td><td>Colonna Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>Colonna capillare in silice fusa da 30 m x 0,25 mm</td></tr></tbody></table>

la supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Gli acidi grassi sono essenziali per numerose funzioni cellulari. Servono molecole di accumulo di energia come efficienza, costituiscono il nucleo idrofobico delle membrane, e partecipare a varie vie di segnalazione. Caenorhabditis elegans sintetizza tutti gli enzimi necessari a produrre una gamma di acidi omega-6 e omega-3 acidi grassi. Questo, combinato con la semplice anatomia e varietà di strumenti genetici disponibili, lo rendono un modello attraente per studiare la funzione di acidi grassi. Per studiare i percorsi genetici che mediano gli effetti fisiologici degli acidi grassi alimentari, abbiamo sviluppato un metodo per integrare il C. elegans dieta con acidi grassi insaturi. L&#39;integrazione è un mezzo efficace per alterare la composizione in acidi grassi di vermi e può essere utilizzato anche per salvare difetti di mutanti di acidi carenti di grassi. Il nostro metodo utilizza nematode crescita agar (NGM) integrato con sali acidsodium grassi. Gli acidi grassi nelle piastre integrate diventano incorporazioneTED nelle membrane della fonte di cibo batterica, che viene poi ripreso dalla C. elegans che si nutrono di batteri integrati. Noi descriviamo anche un protocollo gas cromatografia per monitorare i cambiamenti nella composizione degli acidi grassi che si verificano in vermi completata. Questo è un modo efficace per integrare le diete di piccole e grandi popolazioni di C. elegans, consentendo una vasta gamma di applicazioni di questo metodo.

Integrazione del C. elegans dieta è limitato dalla capacità della fonte alimentare batterica all&#39;assorbimento e incorporare acidi grassi nella membrana batterica. Per determinare la capacità di E. coli OP50 assimilare diversi acidi grassi nelle sue membrane, OP50 è stato placcato su supporto senza supplemento, 0,1 mM e 0,3 mM concentrazioni di acido stearico (18:00), oleato di sodio (18:01 n-9), e sodio DGLA (20 : 3n-6). Le piastre sono state essiccate a temperatura ambiente per 2 giorni al buio, e...

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegant &lt;/ em&gt; è un modello utile per esplorare le funzioni di acidi grassi polinsaturi nello sviluppo e nella fisiologia. Questo protocollo descrive un metodo efficiente di integrare &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; dieta con acidi grassi polinsaturi.

La supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare mezzi dietetici per alterare la composizione degli acidi grassi di sea elegance al fine di studiare la funzione e la regolazione degli acidi grassi. Ciò si ottiene coltivando la fonte di cibo del nematode in presenza di acidi grassi insaturi. Successivamente l'eleganza del mare viene nutrita con i batteri integrati che consentono l'assorbimento dell'acido grasso e la sua incorporazione nel verme.I lipidi cambiano poi in eleganza marina. La composizione degli acidi grassi è confermata dall'analisi di spettrometria di massa gascromatografica. Infine, dopo essersi nutriti di acidi grassi insaturi, i vermi vengono valutati per la sterilità.Si ottengono risultati che mostrano gli effetti fisiologici di un'alterata composizione degli acidi grassi attraverso il comportamento di sviluppo e i cambiamenti nell'espressione genica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'eleganza, dello sviluppo e della fisiologia del mare, perché possiamo utilizzare sia la manipolazione genetica che i contributi dietetici per alterare la composizione degli acidi grassi e monitorarne le conseguenze. In generale, le persone che si avvicinano per la prima volta a questo metodo devono essere attente e caute perché è difficile ottenere risultati coerenti a causa della sensibilità degli acidi grassi insaturi all'ossigeno e alle alte temperature.Per preparare un litro di terreno integrato con acidi grassi, misurare i seguenti componenti in un pallone. Aggiungere acqua millipore fino a 800 millilitri e sterilizzare in autoclave il terreno insieme a una bottiglia di vetro vuota per ogni concentrazione di acidi grassi da testare, nonché ad opportuni cilindri graduati mentre il terreno si raffredda a 55 gradi Celsius. Preparare la soluzione madre di lavoro del sale sodico dell'acido grasso aprendo con cura la fiala di vetro in modo da non far entrare particelle di vetro nella polvere e pesando abbastanza per ottenere una soluzione madre da 100 millimolari, aggiungere la quantità necessaria di acqua purificata.Successivamente, utilizzando argon o azoto gassoso, spurgare la soluzione per prevenire l'ossidazione degli acidi grassi. Quindi tappare la fiala e conservare la fiala al buio mentre l'acido grasso, il sale di sodio, si sta dissolvendo. Quando l'agri si è raffreddato a 55 gradi Celsius al successivo, quindi vicino a una fiamma, trasferire la soluzione in un cilindro graduato sterile.Prima di aggiungere acqua sterile fino a un litro, trasferire nuovamente il terreno nel pallone e continuare a mescolare. Utilizzare un cilindro graduato sterile per trasferire un'aliquota di terreno in un flacone autoclavato per ogni concentrazione di acidi grassi da testare. Tenendo poi le bottiglie in caldo su una piastra per mescolare.Mescolare la concentrazione appropriata di soluzione madre di acidi grassi prima di utilizzare una pipetta sterile da 25 millilitri per versare le piastre dopo che le piastre si sono solidificate, coprire e conservarla a temperatura ambiente in un'area ben controllata al buio. Due giorni dopo, utilizzare e coli OP 50 per seminare le piastre, quindi incubare le piastre in un ambiente buio a temperatura ambiente mentre il prato batterico si sta asciugando. Preparare una popolazione sincronizzata di larve di L uno trattando Ravi Hermafrodites con una soluzione alcalina di ipoclorito.Cullare delicatamente gli ermafroditi GR in questa soluzione fino a quando i vermi adulti non si dissolvono. Quindi centrifugare a bassa velocità per pellettare le uova. Usa il tampone M nine per lavare le uova tre volte.Quindi, in un tubo da 15 millilitri, risospenderli in cinque millilitri di tampone M nove e farli oscillare per una notte. Aggiungere le larve L one alle piastre con semi OP 50 che sono state integrate con 0,3 millimolari di acido homo gammalin o DGLA e incubarle a 20 gradi Celsius per tre giorni o fino a quando le larve non raggiungono lo stadio adulto. Usa un microscopio da dissezione per valutare la sterilità dei vermi adulti.La perdita di germi di successo apparirà come un utero chiaro privo di ovuli. In alternativa, segna i vermi raccogliendoli in una goccia di M nove buffer su un vetro dell'orologio. Quindi utilizzare un millilitro di 0,2 nanogrammi per millilitro di soluzione dappy per inondare il vetro dell'orologio e incubare per circa cinque minuti.Dopo l'incubazione, raccogliere i vermi in una goccia di terreno di montaggio su un vetrino prima di coprirli con un vetrino coprioggetti, sigillare il vetrino coprioggetto e conservarlo a quattro gradi Celsius al buio durante la notte o osservarlo immediatamente al microscopio a fluorescenza per produrre esteri metilici di acidi grassi o fame. Per quantificare l'assorbimento degli acidi grassi, raccogliere da 500 a 1000 vermi adulti usando l'acqua per lavarli via dalle piastre e trasferirli in siliconati. Tubi superiori a vite in vetro da 13 x 100 millimetri.Lascia che i vermi si depositino per gravità e poi usa una pipetta di vetro per rimuovere quanta più acqua possibile. Aggiungere un millilitro di acido solforico al 2,5% in metanolo e scaldare i tubi a bagnomaria a 70 gradi Celsius per un'ora dopo essersi raffreddati per un minuto sotto la cappa, estrarre i telai aggiungendo 1,5 millilitri di acqua e 0,25 millilitri di esano. Richiudere i tubi e agitare energicamente.Quindi centrifugare le provette in una centrifuga clinica da tavolo per un minuto per separare l'esano dal solvente acquoso. Trasferire lo strato superiore di esano in una gascromatografia o in un foglietto di GC all'interno di un flaconcino di GC. Per l'analisi mediante gc, iniettare da uno a due microlitri di fame su una colonna di gascromatografia capillare polare adatta per l'analisi del fame.Impostare l'iniettore a 250 gradi Celsius con una portata di 1,4 millilitri al minuto. Programmare il forno per una temperatura iniziale di 130 gradi Celsius mantenuta per un minuto. Quindi aumentare la temperatura di 10 gradi Celsius al minuto fino a raggiungere i 190 gradi Celsius, quindi aumentarla di nuovo a cinque gradi Celsius al minuto fino a 210 gradi Celsius, quindi tenere premuto per un altro minuto per assicurarsi che si sia verificata l'adozione di DGLA.Analizza i frame mediante rilevamento a ionizzazione di fiamma o spettrometria di massa o rilevamento MS utilizzando standard autentici per l'identificazione dell'eleganza del mare. L'integrazione di acidi grassi della dieta sea elegance è limitata dalla capacità della fonte alimentare batterica di assorbire e incorporare gli acidi grassi nella membrana batterica per determinare la capacità di e coli OP 50 di assimilare vari acidi grassi nelle sue membrane. OP 50 è stato placcato su terreni senza supplementi, concentrazioni di 0,1 millimolari e 0,3 millimolari di acido sterico, ato di sodio e DGLA di sodio, come mostrato in questa figura L'analisi della fama di GCMS dimostra che gli acidi grassi insaturi, tra cui OLEATO e DGLA, si incorporano in OP 50 a livelli più elevati rispetto all'acido sterico degli acidi grassi saturi.Inoltre, la misurazione delle quantità di acidi grassi nei vermi allo stadio adulto rivela che l'integrazione con acidi grassi saturi non ha alcun effetto sulla quantità relativa di acidi grassi saturi nei tessuti dei vermi. Tuttavia, l'integrazione con acidi grassi insaturi ha aumentato le quantità relative di questi grassi presi insieme. Questi dati indicano che l'accumulo relativo di acidi grassi integrati nella dieta è direttamente correlato con l'accumulo relativo di acidi grassi nella dieta e coli.Come abbiamo dimostrato in precedenza, questo grafico illustra la dose-risposta dell'induzione della sterilità da parte della DGLA nell'eleganza del mare. La concentrazione di DGLA nei lipidi dei vermi in cui il 50% della popolazione sarà sterile è di circa il 12% E, cosa interessante, la risposta al DGLA può essere alterata da mutazioni genetiche nei vermi. Sulla base di una recente scoperta che le vie di stress dipendenti dal fattore di crescita dell'insulina possono influenzare la distruzione delle cellule germinali indotta da DGLA.Abbiamo integrato la dieta di vermi contenenti mutazioni deleterie nel recettore IGF dell'insulina DAF 2 o nel fattore di trascrizione FOXO DAF 16 Con DGLA, un punteggio di sterilità in ciascun ceppo ha mostrato che i mutanti DAF due erano fertili con poca o nessuna perdita di cellule germinali indotta rispetto ai vermi wild type a entrambe le concentrazioni di DGLA. Al contrario, i vermi integrati con vox O inattivo hanno mostrato una percentuale più elevata di vermi sterili rispetto al tipo selvatico quando alimentati su piastre contenenti 0,15 millimolari di acido grasso. Seguendo questa procedura, i ricercatori possono eseguire numerosi saggi con l'eleganza marina integrata, come studi di espressione genica, saggi comportamentali o analisi dello sviluppo o della riproduzione.Questi saggi riveleranno il ruolo di specifici acidi grassi in questi processi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare costantemente terreni integrati con acidi grassi che possono essere utilizzati per alterare la composizione degli acidi grassi dell'eleganza del mare.

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