Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore
18 novembre 2013
Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare colture di cellule staminali neurali da diverse aree del cervello del roditore adulto. Ciò si ottiene raccogliendo tessuto da una regione di interesse per esaminare la presenza e il potenziale delle cellule staminali neurali. In una seconda fase, trasformare il tessuto in una sospensione cellulare per la piastratura come coltura monostrato.
Successivamente, utilizzare le condizioni di coltura definite per propagare selettivamente le cellule staminali neurali, convalidando il loro potenziale di auto-rinnovamento. Si ottengono risultati in vitro che dimostrano che le cellule staminali neurali sono multipotenti in base al loro potenziale di differenziazione e come vari fattori possono influenzare il loro autorinnovamento e il loro destino. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze e della medicina rigenerativa, come ad esempio dove risiedono le cellule neurostaminali endogene e come manipolarle.
Abbiamo pensato per la prima volta a questa tecnica quando abbiamo scoperto i percorsi di riduzione dei segnali. Questo ci ha permesso sia di identificare le cellule staminali neurogeni endogene putative sia di regolarne il numero. Quindi abbiamo applicato queste conoscenze per stabilire colture robuste di queste cellule da diverse aree del cervello.
Studia le loro proprietà e poniti la domanda: sono davvero cellule staminali? La corretta preparazione del piatto di coltura è fondamentale due giorni prima della dissezione programmata, rivestire i piatti con poli L ornitina a 75 microgrammi per millilitro. Quindi incubare le piastre per una notte il giorno successivo, aspirare la poli L ornitina e lavare ciascuna pozzetto due volte con tre millilitri di PBS per cinque minuti per lavaggio.
Le piastre possono quindi essere conservate in un incubatore per un massimo di tre settimane Dopo aver rimosso il lavaggio finale, aggiungere la fibra nin diluita una a 250 in PBS mediante pipettaggio delicato. Fare attenzione a non agitare eccessivamente la soluzione. Quindi incubare le piastre per una notte il giorno della dissezione.
Aspirare la fibronectina e lavare i piatti due volte con PBS. Rimettere le piastre con il lavaggio finale PBS nell'incubatrice e attendere il tessuto dissociato. Le piastre inutilizzate possono essere conservate nell'incubatrice per un massimo di una settimana, ma non lasciarle asciugare e non agitarle.
La dimostrazione di questo protocollo è stata estesa a tre ratti adulti. Innanzitutto, assicurati di raffreddare il blocco di sezionamento del cervello sul ghiaccio prima di sopprimere il primo ratto. Quindi preparare un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio con cinque millilitri di N due FGF medio e basico.
Dopo aver rimosso il cervello da un ratto soppresso, metti il cervello in una capsula di Petri di 10 centimetri contenente PBS ghiacciato. Quindi trasferisci il cervello in un secondo piatto di PBS senza residui di peli o sangue. Ora posiziona il cervello nel blocco di sezionamento raffreddato e inserisci una nuova lama di rasoio pulita nel blocco in prossimità della regione di interesse da cui verranno generate le cellule.
Quindi, inserisci una seconda lama di rasoio pulita. Tre millimetri coccolare la prima lametta. Sollevare con cautela le lame dal blocco portando con sé la sezione di interesse.
Far galleggiare la sezione dalla lama immergendola nel PBS. Ora raccogli l'area di interesse usando la pinza numero cinque. In questo esempio, la sezione contiene la commessura anteriore. Certo.
Raccogliere la sezione nel tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di terreno N due con FGF basico. Quindi ridurre il volume della soluzione a uno o due millilitri. Successivamente, in una cappa per colture cellulari, immergere una punta di pipetta da un millilitro sul fondo del conico e utilizzare circa 20 flussi di soluzione per dissociare meccanicamente il tessuto.
Interrompere la terapia quando la soluzione diventa omogenea e lasciarla riposare per alcuni minuti in modo che i tessuti non associati più grandi si depositino sul fondo. Trasferire ora il surnatante omogeneo senza pezzi di tessuto in una provetta conica contenente 8,5 millilitri di integratore e due terreni. Mescola il contenuto del tubo e prepara un sei.
Pozzetto piastra. Rimuovere il PBS dai pozzetti e quindi aggiungere tre millilitri di miscela cellulare per pozzetto in tre pozzetti nei successivi 10-14 giorni di coltivazione. Sostituire il terreno con N due integratori freschi a giorni alterni, a partire da 24 ore dopo la placcatura a giorni alterni, aggiungere un volume fresco di integratori in N due.
Da medio a mezzo già presente sulle celle. La diligenza alle condizioni dei terreni è essenziale per mantenere le cellule indifferenziate e consentirne l'espansione. Dopo il primo cambiamento del mezzo, è rimasta una grande quantità di detriti cellulari insieme ai vasi sanguigni.
Tuttavia, nei giorni successivi, colonie di cellule staminali proliferanti distinte sono diventate visibili. Erano presenti anche popolazioni cellulari più allungate simili a fusi. Queste non sono cellule staminali neurali e alla fine sono state superate quando le cellule staminali neurali hanno proliferato.
Nel corso delle due settimane successive, le cellule staminali neurali sono cresciute più densamente fino a raggiungere la confluenza. Queste colture sono risultate positive per un certo numero di marcatori di cellule staminali, tra cui SOX due, hesi e nest. In questo modo si ha la certezza che le popolazioni cellulari che sono state selezionate ed espanse sono effettivamente cellule staminali neurali.
Un'ulteriore conferma è arrivata dopo aver ritirato l'FGF dal terreno, che ha permesso alle cellule di differenziarsi per 10 giorni in neuroni, astrociti e tutti i cendraciti. Per indurre la differenziazione. Sostituire il terreno N due integrato con N due non integrato e coltivare le cellule in questo modo per 10 giorni, sostituendo il terreno N due ogni 48 ore dopo 10 giorni aspirare il terreno e fissare le cellule con due millilitri di para formaldeide al 4% per pozzetto per 20 minuti.
Risciacquare il fissativo con tre millilitri di PBS due volte per cinque minuti per lavaggio. Dopo aver aspirato il secondo lavaggio, aggiungere due millilitri di PBS contenente il 5% di siero d'asina normale e lo 0,1% di tritton X 100 per permeare e bloccare le cellule mentre le cellule incubano a temperatura ambiente per 20 minuti. Preparare la miscela di anticorpi primari in PBS contenente il 5% di NDS.
In questo esempio, l'anticorpo anti T UJ one viene applicato per identificare i neuroni, mentre gli anticorpi GFAP e CPA vengono utilizzati per visualizzare rispettivamente gli astrociti e gli oligodendrociti. Dopo 20 minuti, aspirare la soluzione bloccante e aggiungere 1,5 millilitri della miscela di anticorpi primari a ciascuna. Incubare bene le cellule.
Aggiungere la temperatura ambiente per 90 minuti dopo 90 minuti, lavare le cellule con due bagni di PBS, seguiti da un'applicazione di PBS contenente il 5% di NDS, utilizzare tre millilitri di soluzione e cinque minuti di bagni. Dopo aver rimosso il lavaggio finale, applicare 1,5 millilitri di anticorpi secondari in PBS contenenti il 5% di NDS su ciascuno. Bene, quindi mettete il piatto al buio, aggiungete la temperatura ambiente e aspettate 40 minuti.
Dopo 40 minuti, sostituire il secondario con due millilitri di una macchia DPI appena preparata e attendere tre minuti. Dopo aver aspirato la soluzione DPI, lavare le cellule tre volte con tre millilitri di PBS per cinque minuti per lavaggio. Le cellule sono quindi pronte per la microscopia Seguendo questa procedura.
Altri metodi, come i western blot, possono essere eseguiti per osservare i cambiamenti nell'espressione proteica e nella fosforilazione che derivano da trattamenti farmacologici o nel corso della differenziazione cellulare. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, ha effettivamente aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per testare nuovi metodi che hanno implementato nella ricerca in diverse specie, tra cui topi, ratti e persino primati.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulla generazione di colture di cellule staminali neurali da diverse regioni del cervello adulto del roditore. Il processo prevede il prelievo del tessuto, la creazione di una sospensione cellulare e l'uso di condizioni di coltura specifiche per propagare le cellule staminali neurali, validandone il potenziale di autorenovamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Medicina Rigenerativa
Sfondo
- Le cellule staminali neurali sono fondamentali per comprendere lo sviluppo del sistema nervoso.
- Hanno potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa.
- Il controllo delle condizioni di isolamento e di coltura è essenziale per i risultati sperimentali.
Scopo dello studio
- Generare colture di cellule staminali neurali da regioni cerebrali di roditori adulti.
- Esaminare la presenza e il potenziale delle cellule staminali neurali.
- Esplorare i fattori che influenzano l'auto-rinnovamento e la differenziazione.
Metodi Utilizzati
- Prelevare tessuto da regioni cerebrali specifiche.
- Processare il tessuto in una sospensione cellulare.
- Piastrare le cellule come coltura in monocstrato.
- Utilizzare condizioni di coltura definite per la propagazione selettiva.
Risultati principali
- I risultati in vitro confermano la multipotenza delle cellule staminali neurali.
- È stato dimostrato il potenziale differenziativo delle cellule coltivate.
- Sono stati identificati i fattori che influenzano l'auto-rinnovamento e il destino delle cellule staminali neurali.
Conclusioni
- Questo metodo aiuta a comprendere la localizzazione delle cellule staminali neurali endogene.
- Fornisce informazioni su come manipolare le cellule staminali neurali per la ricerca.
- I risultati contribuiscono ai campi delle neuroscienze e della medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La creazione di colture definite di cellule staminali neurali provenienti da diverse regioni cerebrali consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione degli obiettivi terapeutici per le terapie neurodegenerative e rigenerative. Questo approccio garantisce una maggiore affidabilità predittiva isolando popolazioni multipotenti e valutandone il potenziale differenziativo in condizioni controllate. Il metodo facilita la continuità traslazionale dalla fase di scoperta alla valutazione preclinica fornendo un sistema riproducibile per analisi farmacologiche e genetiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando cellule staminali neurali da regioni cerebrali convenzionali e non convenzionali per valutare l'eterogeneità regionale nelle proprietà delle cellule staminali.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante la validazione dell'auto-rinnovamento e della multipotenza attraverso condizioni di coltura definite e l'analisi di marcatori (SOX2, Hes1, nestina).
- Valore predittivo: La differenziazione in neuroni, astrociti e oligodendrociti fornisce letture funzionali per studi sulla modulazione di percorsi molecolari e sulla determinazione del destino cellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera colture omogenee in monocstrato adatte all'analisi mediante imaging ad alto contenuto e alla valutazione quantitativa della proliferazione e differenziazione delle cellule staminali.
- Valore operativo: Terreni definiti (N2 integrato con bFGF) e rivestimento del substrato (poli-L-ornitina, fibronectina) garantiscono standardizzazione e riproducibilità tra esperimenti.
- Scalabilità: Il protocollo consente l'espansione per 10–14 giorni con cambi del mezzo ogni due giorni, permettendo una produzione costante di popolazioni progenitrici indifferenziate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: I saggi di differenziamento eseguiti dopo la rimozione dei fattori di crescita modellano le risposte rigenerative e consentono la valutazione di composti pro-rigenerativi o neuroprotettivi.
- Valore operativo: La validazione mediante immunocitochimica (TUJ1, GFAP, CCAP) fornisce endpoint standardizzati per valutare l'impegno verso specifiche linee cellulari.
- Continuità traslazionale: Applicabile in modelli di roditore e adattabile a campioni clinici umani, supporta la validazione interspecie del comportamento delle cellule staminali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una piattaforma validata di cellule staminali neurali per studi sull'interazione con il bersaglio e sul meccanismo d'azione prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi riguardo a nicchie regionali di cellule staminali e alla loro risposta a segnali microambientali provenienti dai sistemi vascolare e immunitario.
- Screening: Le colture in monoclostrato permettono un'agevole semina e espansione riproducibile, facilitando la predisposizione di saggi per lo screening di librerie di composti.
- Analisi: Gli output quantitativi includono l'espressione di marcatori (immunocitochimica), l'efficienza di differenziamento e la cinetica di proliferazione in condizioni definite.
- Ricerca traslazionale: Il potenziale di differenziamento in tre linee neurali supporta l'allineamento di biomarcatori e la modellizzazione preclinica della capacità rigenerativa.
- Riutilizzo aziendale: Procedure standardizzate di dissociazione, semina e mantenimento consentono il riutilizzo in diversi progetti e sistemi modello con minima riottimizzazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica definendo condizioni di coltura che isolano le proprietà endogene delle cellule staminali neurali e la loro multipotenza.
- Valore operativo: La dissociazione standardizzata dei tessuti, i mezzi definiti e la preparazione del substrato migliorano la riproducibilità e riducono la variabilità tra laboratori.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze precoci dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso in un sistema fisiologicamente rilevante.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati rigenerativi in base al rischio, sulla base degli effetti dimostrati sul self-renewal delle cellule staminali e sulla specificazione delle linee cellulari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione asettica dei tessuti, nella coltura di cellule staminali neurali e nelle tecniche di immunofluorescenza.
- Richiede l'uso di un capo a flusso laminare sterile, incubatori, microscopi invertiti e reagenti standard di biologia molecolare (anticorpi, DAPI, PBS).
- La standardizzazione tra diversi gruppi richiede un rivestimento del substrato costante (poli-L-ornitina/fibronectina), un'adeguata integrazione del mezzo di coltura e tempistiche di differenziazione uniformi.
- L'adattamento a modelli non rodentici potrebbe richiedere un'ottimizzazione degli enzimi di dissociazione e della durata della coltura in base alla cinetica delle cellule staminali specifica per specie.
- Le limitazioni includono il rischio di contaminazione da popolazioni cellulari non staminali (ad esempio, vascolari, gliali) durante le fasi iniziali della coltura, ridotto dalla proliferazione selettiva nel tempo.
