Name: Cultura della Isolato Piastra di tessuti e la produzione di mezzo condizionato per valutare le proprietà funzionali del pavimento segnali piastra rilasciato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Impara a isolare la piastra del pavimento e a produrre mezzo condizionato per studiare i segnali nel midollo spinale embrionale di topo. Questo metodo consente l'analisi biochimica dei marcatori commissurali.

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Ringraziamo Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, e Florie Reynaud per il loro aiuto. Il lavoro è supportato dal CNRS, programma ANR YODA e Labex DevWeCan.

GIORNO 1 1. La dissezione del midollo spinale Piastra (FP) da E12.5 embrioni di topo Nota: L&#39;intera procedura richiede l&#39;uso di condizioni di sterilità. È preferibile effettuare la dissezione sotto una cappa dissezione per evitare la contaminazione. La superficie della cappa deve essere pulito con etanolo. Tutti gli strumenti di dissezione devono essere sterilizzati e tenuti in una piastra di Petri sterile. I liquidi (medio, medio dissezione) devono essere mantenuti chiusi e messi in un bagno di ghiaccio. Ogni embrione deve essere raccolto in singoli fresco goccia. Questo è importante per la conservazione del tessuto. La dissezione viene eseguita con Dumont # 5 pinze. Per trasferire gli embrioni tra piatti, afferrare il cordone ombelicale o la testa senza alcun danno alla hindbrain. E &#39;fondamentale non danneggiare il midollo spinale per completare con successo la dissezione. Preparare freddo Soluzione tampone fosfato (PBS), soluzione salina bilanciata freddo di Hank (HBSS) -6,5% di glucosio e la temperatura stanza di medie Neurobasal. 1.1 spinale dissezione del cavo Gli animali sono trattati secondo le linee guida di cura degli animali del Centre National de la Recherche Scientifique seguenti direttive europee. Il metodo di eutanasia è dislocazione cervicale, e composto di applicare pressione al collo e lussazione della colonna vertebrale dal cervello. Questo metodo è consigliato per modelli animali di topo, e può essere eseguito in modo veloce ed efficiente. <ol><li> Euthanize un mouse incinta a E12.5 di gestazione (E0.5 = primo giorno successivo stuoia). Posizionare il mouse lato ventrale. </li><li> Mettere a bagno l&#39;addome con il 70% di etanolo. Pizzicare la pelle dell&#39;addome con pinze Adson e tagliare attraverso la pelle e gli strati peritoneali con forbici chirurgiche. Fare un&#39;incisione e usarlo per tagliare su entrambi i lati del mouse per esporre la cavità addominale. </li><li> Una stringa di embrioni è presente su ogni lato del mouse. Afferrare un corno delle uterus nel tessuto tra due embrioni e sezionarlo partendo dalla parte esterna. Trasferire l&#39;utero intatto per una piastra di Petri 100 mm con PBS freddo su ghiaccio. </li><li> Estrarre gli embrioni dai tessuti extra-embrionali. Afferrare il tessuto placentare (in rosso scuro) con due paia di pinze e tirare dolcemente a strappare il tessuto e rimuovere gli embrioni dal sacco uterina. </li></ol> Nota: per una migliore conservazione, raccogliere gli embrioni dal loro sac uterino uno per uno. <ol start="5"><li> I prossimi passi sono fatti sotto lente di ingrandimento binoculare e cappuccio dissezione. Mettere un embrione in una goccia di freddo HBSS-6.5% di glucosio. </li><li> Utilizzando pinze, decapitare l&#39;embrione. </li></ol> Nota: Tagliare tra la mandibola e la hindbrain, la parte posteriore del hindbrain è importante per i passi successivi. <ol start="7"><li> Posizionare la faccia ventrale dell&#39;embrione giù con la parte anteriore rivolta verso lo sperimentatore. </li><li> Pizzicare la pelledell&#39;embrione con un paio di pinze e con l&#39;altra coppia tirare via la pelle. </li></ol> Nota: Questa operazione deve essere ripetuta fino a quando la pelle viene completamente rimosso dalla parte anteriore dell&#39;embrione. <ol start="9"><li> Girare il lato embrione anteriore a sinistra. Con una pinza &quot;fissare&quot; l&#39;embrione nella parte anteriore. Con le altre pinze afferrano la pelle e tirare verso la parte rostrale dell&#39;embrione. Il midollo spinale è quindi accessibile. </li><li> Utilizzare un lato della pinza per tagliare le meningi che ancora avvolgono il midollo spinale. Il midollo spinale è ora aperto. </li><li> Girare il lato embrione anteriore a destra. </li><li> Staccare il tessuto dal midollo spinale partendo dal lato cervicale dell&#39;embrione. Far scorrere la pinza sotto il midollo spinale (le pinze devono essere tenute chiuse per evitare danni al midollo spinale). Le pinze devono essere visibili nel midollo spinale. Piccoli movimenti rotatori sotto il midollo spinale sono sufficienti a staccare l&#39;tessuti e gangli delle radici dorsali (DRG) circostante. </li></ol> Nota: Lasciando tessuto circostante divisoria aggiungere peso al midollo spinale, aumentando così la probabilità di rottura durante la fase successiva. <ol start="13"><li> Posizionare il midollo spinale isolato in una fresca goccia di freddo HBSS-6.5% di glucosio. </li><li> Posizionare il midollo spinale in posizione pianeggiante, meningi sul lato superiore e anteriore distanti sperimentatore. </li><li> &quot;Pin down&quot; il midollo spinale tramite il hindbrain rimanente con una pinza, e con la seconda pinza afferrare le meningi. Staccare le meningi a partire dal lato rostrale del midollo spinale. </li></ol> Nota: Il movimento deve essere lento e costante per evitare qualsiasi rottura del midollo spinale. Movimenti vibratori possono facilitare il distacco delle meningi. 1.2 FP dissezione <ol><li> Stringere la hindbrain con una pinza. </li><li> La FP è il TRA centralensparent parte del tessuto. Usando un bisturi tagliare il pavimento piatto. </li></ol> Nota: Per tagliare entrambi i lati con la stessa qualità, partire dal lato rostrale e alternativamente tagliare il lato destro ed il lato sinistro della lastra di fondo. <ol start="3"><li> Conservare il FP sezionato in Neurobasal mezzo a temperatura ambiente. </li></ol> 2. FP Cultura Nota: Tutti i passaggi devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di coltura di tessuti. Utilizzare mezzo fresco e integratori e reagenti appena scongelati. Preparare coprioggetto sterili di vetro, caldo Neurobasal + B27, plasma e HBSS-trombina. 2.1 cultura FP <ol><li> Posizionare diversi coprioggetto sterili in un piatto 100 millimetri Petri e pipetta 20 microlitri di plasma nel centro di ogni coprioggetto. </li><li> Trasferire 2-4 FP in ciascuna goccia di plasma e aggiungere 20 microlitri HBSS-trombina accanto alla goccia plasma e miscelare accuratamente. Mantenere i coprioggettiper almeno dieci minuti alla temperatura ambiente per permettere la coagulazione del plasma. </li></ol> Nota: Trasferimento due PQ in caso di dissezione completa e più in caso di dissezione parziale. Mescolare lentamente con un puntale ed evitare il contatto con gli espianti FP. Il coagulo di plasma ritrae un paio di micron come un segno della coagulazione. La coagulazione non deve essere disattivato, per evitare il distacco del coagulo di plasma. <ol start="3"><li> Trasferire ogni vetrino in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 ml di Neurobasal + B27. Incubare 48 ore a 37 ° C. </li></ol> GIORNO 3 3. FP condizionata Media (FP cm) raccolta Nota: raccolta deve essere eseguita in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale. Se il surnatante è contaminato o se solai sono galleggianti (nel senso che potrebbe essere morto durante i peri culturaod) allora non raccogliere il cm FP da questo bene. 3.1 FP cm di raccolta <ol><li> Raccolta accuratamente il mezzo da ogni pozzetto. </li></ol> Nota: Non dispensare il mix di plasma-trombina polimerizzato o eventuali frammenti di FP. <ol start="2"><li> Conservare aliquote di 100 microlitri a -80 ° C. </li></ol> GIORNO 4 4. La dissezione del midollo spinale commissurale neuroni da E12.5 embrioni di topo Nota: Questo preparato non deve essere eseguita in condizioni sterili. Seguire la procedura sopra descritta per raccogliere gli embrioni. Preparare PBS freddo, freddo HBSS-6.5% glucosio e Neurobasal freddo. 4.1 spinale dissezione del cavo <ol><li> Utilizzando pinze, decapitare l&#39;embrione. </li></ol> Nota: Taglio tra mandibola e hindbrain, la parte posteriore del hindbrain è importante per laprossimi passi. <ol start="2"><li> Posizionare la faccia ventrale dell&#39;embrione giù in una goccia fresco con la parte anteriore rivolta verso l&#39;sperimentatore. </li><li> Pizzicare la pelle dell&#39;embrione con una pinza e con l&#39;altra tirare via la pelle. </li></ol> Nota: Questa operazione deve essere ripetuta fino a quando la pelle viene completamente rimosso dalla parte anteriore dell&#39;embrione. <ol start="4"><li> Girare il lato embrione anteriore a sinistra. Con una pinza &quot;fissare&quot; l&#39;embrione nella parte anteriore. Con le altre pinze, afferrare la pelle e tirare verso il lato rostrale dell&#39;embrione, per esporre il midollo spinale. </li><li> Utilizzare un lato della pinza per tagliare le meningi che ancora avvolgono il midollo spinale. Il midollo spinale è ora esposta e aperta. </li><li> Posizionare il lato anteriore dell&#39;embrione a destra. </li><li> Staccare il tessuto dal midollo spinale partendo dal lato cervicale dell&#39;embrione. Far scorrere la pinza sotto il midollo spinale (tenere le pinze chiuse). Perfunghi porcini devono visibile sotto il midollo spinale. Piccoli movimenti rotatori sotto il midollo spinale sono sufficienti a staccare il tessuto adiacente e gangli delle radici dorsali (DRG). </li><li> Trasferire il midollo spinale isolato in una nuova goccia di freddo HBSS-6.5% di glucosio. </li><li> Posizionare il midollo spinale in posizione pianeggiante, meningi sul lato superiore e anteriore distanti sperimentatore. </li><li> &quot;Pin down&quot; il midollo spinale tramite il hindbrain rimanente con una pinza, con la seconda pinza afferrare le meningi. Staccare le meningi a partire dal lato rostrale del midollo spinale. </li></ol> 4.2 commissurale Neuron dissezione <ol><li> Stringere la hindbrain con una pinza. </li><li> I neuroni commissurale si trovano nella parte più laterale del midollo spinale (lato dorsale). Tagliare questa parte laterale con un bel bisturi. </li></ol> Nota: La parte dorsale del midollo spinale può essere distinto dalla parte ventrale per differenza di cella densità, la parte ventrale essere più opaco. Nota: Per tagliare entrambi i lati con la stessa qualità, partire dal lato rostrale e alternativamente tagliare una piccola lunghezza del lato destro e del lato sinistro. <ol start="3"><li> Conservare il tessuto sezionato in Neurobasal mezzo su ghiaccio per un uso immediato. </li></ol> 5. Trattamento del tessuto commissurale con l&#39;cm FP Nota: Questa procedura non richiede condizioni sterili. Il tessuto deve essere raccolto in singole provette da 1,5 ml. Il congelato FP cm deve essere utilizzato solo una volta. Evitare il ricongelamento aerei. Preparare calda cm FP (37 ° C). 5.1 Trattamenti di neuroni commissurali <ol><li> Dilacerate il tessuto commissurali con piccole forbici. </li></ol> Nota: Tagliare il tessuto più piccolo possibile, per potenziare l&#39;accessibilità delle cellule. <ol start="2"><li> Distribuire equamente il tessuto tra il diverso trattamento di controllo delle condizioni sperimentali e FP trattamento cm. </li><li> Centrifugare i frammenti di tessuto a 800 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Controllare la ripartizione tra i tubi. </li></ol> Avvertenza: Se necessario ridistribuire e centrifugare di nuovo fino frammenti sono equamente distribuiti. <ol start="5"><li> Rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere i cm di controllo e trattamenti caldi FP ai tessuti. </li></ol> Nota: Il volume deve essere regolato alla quantità di pellet e dovrebbe essere almeno il doppio del volume del pellet. <ol start="7"><li> Incubare a 37 ° C per 30 min. </li></ol> Nota: Agitare delicatamente ogni 10-15 minuti <ol start="8"><li> Centrifugare a 800 xg per 1 minuto e rimuovere il trattamento. </li><li> Aggiungere il tampone di lisi </li></ol> Nota: il volume deve essere regolato a unmontaggio del pellet e dovrebbe essere almeno il doppio del volume del pellet. <ol start="10"><li> Pipetta su e giù per risospendere il pellet. </li></ol> Nota: Un vortice può anche essere usato. <ol start="11"><li> Incubare 15 min in ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 14000 g per 15 min a 4 ° C. </li><li> Conservare il surnatante e misurare la quantità di proteina con un saggio Bradford 9. </li><li> Aggiungi 6x Laemmli Buffer. </li><li> Incubare a 95 ° C per 5 minuti per denaturare il contenuto proteico. </li></ol> Nota: I campioni possono essere utilizzati immediatamente o possono essere conservati a -80 ° C. <ol start="16"><li> Valutare gli effetti del trattamento mediante Western blot 10. </li></ol> Nota: Almeno 50 microgrammi di proteine ​​totali dovrebbero essere caricati per ogni corsia.

<ol><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system%3A+how+to+cross+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+floor+plate%3A+multiple+cells%2C+multiple+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li>
<li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li>
<li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li>
<li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li>
<li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li>
<li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li>
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<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li>
<li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

La produzione di pavimento-plate mezzo condizionato fornisce un modo efficace e semplice per valutare le proprietà biologiche del piatto piano segnali rilasciati. La matrice di plasma-trombina offre ottime condizioni per la sopravvivenza del tessuto. Tuttavia, questo ambiente arricchito potrebbe essere una limitazione per alcuni tipi di esperimenti. Pertanto, il tessuto piastra può essere coltivato in matrice di agarosio. La qualità del mezzo piastra condizionata può essere valutato dalla ri...

Il pavimento piastra è un centro patterning ben noto della sviluppo midollo spinale, che gioca un ruolo chiave nella specificazione dei progenitori e linee cellulari postmitotici e controllare la navigazione assone 7,8. La procedura sperimentale descritta qui di produrre FP cm consente agli investigatori di valutare le proprietà funzionali dei segnali piatto di derivazione piano di un diversi contesti di processi di sviluppo, di patterning cellulare e la sopravvivenza delle cellule e la migrazione degli assoni. Per illustrare l&#39;uso di tale FP cm, i tessuti del midollo spinale dorsale che contengono neuroni commissurali sono sezionati, dilacerated e stimolate con la FP cm. I tessuti possono poi essere elaborati per l&#39;analisi Western Blot. Questo permette di indagare disposizioni della macchinari guida degli assoni dal pavimento piatto segnali rilasciati. Il metodo di trattamento di tessuto fresco dilacerated detiene il grande vantaggio di preservare il microambiente delle cellule all&#39;interno the tessuto. Così le conseguenze del trattamento da FP cm o qualsiasi tipo di trattamento sono valutate in modo più fisiologico che in cellule e condizioni di coltura tissutale.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenti richiesti</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Ca2+/Mg2+- free</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Sigma</td><td>P-3266</td><td>1 mg/ml (Ricostituire in H2O e filtrato)</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>T-4648</td><td>10 mg/ml(Ricostituire in H2O e filtrato)</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>50x</td></tr><tr><td>HEPES (260 g/mol)</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5513</td><td>0,5 M, pH 8</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Euromedex</td><td>2189</td><td>1M</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi Compresse</td><td>Roche</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>S-6508</td><td></td></tr><tr><td>H 2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 1.Reagenti richiesti. </td></tr><tr><td colspan="4">Strumenti e Materiali</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Strumenti per le scienze Fini Strumenti</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Adson Strumenti per</td><td>le scienze 11027-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze per punte fini</td><td>Strumenti per le scienze 11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti per</td><td>la scienza</td><td>10136-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 2. Strumenti e materiali. </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Dissezione e coltura FP</td> </tr> <tr> <td>Etanolo 70%</td> <td></td> </tr><tr> <td>cappuccio di dissezione</td> <td></td> </tr><tr> <td>microscopio di dissezione</td> <td></td> </tr><tr> <td>Petri plates</td> <td></td> </tr><tr> <td>vetrini</td> <td>18 mm x 18 mm</td> </tr><tr> <td> Bruciatore a gas Bunsen</td> <td></td> </tr><tr> <td>piastra a 24 pozzetti</td> <td></td> </tr><tr> <td>incubatore per colture tissutali (37 gradi C, 5% CO2, umidità controllata)</td> <td></td> </tr><tr> <td>Centrifuge</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Ricette</td> </tr> <tr> <td colspan="2" >FP terreni di coltura</td> </tr> <tr> <td>Neurobasal</td> <td></td> </tr><tr> <td>B27</td> <td>1/50e diluizione da stock</td> </tr><tr> <td colspan="2">HBSS-thrombin </td> </tr> <tr> <td>HBSS</td> <td>1 ml </td> </tr><tr> <td>Trombina 10 mg/ml</td> <td>30 &mu; l</td> </tr><tr> <td colspan="2">Tampone di lisi pH 7,4</td> </tr> <tr> <td>HEPES (260 g/mol) </td> <td>25 mM</td> </tr><tr> <td>EDTA (pH 8) </td> <td>5 mM</ td> </tr><tr> <td>MgCl2 </td> <td>1 mM</td> </tr><tr> <td>Glicerolo </td> <td>10%</td> </tr><tr> <td>IGEPAL (NP40) </td> <td>0,10%</td> </tr>< tr> <td>Cocktail di inibitori della proteasi </td> <td>1x</td> </tr><tr> <td>Ortovanadato di sodio </td> <td>0.2 M</td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Laemmli Buffer</td> </tr> <tr> <td>Tris 0.5 M, pH 6,8 </td> <td>375 mM</td> </tr><tr> <td>SDS</td> <td>6%</td> </tr><tr> <td>Glicerolo</td> < td>60%</td> </tr><tr> <td>DTT</td> <td>0.6 M</td> </tr><tr> <td>Blu bromofenolo</td> <td></td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </ tr></tbody> </tabella></td></tr></tbody></table>

cultura della isolato piastra di tessuti e la produzione di mezzo condizionato per valutare le proprietà funzionali del pavimento segnali piastra rilasciato

Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

Durante lo sviluppo, progenitori e neuroni post-mitotici ricevono segnali da territori adiacenti che regolano il loro destino. Il pavimento piatto è un gruppo di cellule gliali di rivestimento del canale ependimale in posizione ventrale. Il piano piastra esprime morphogens chiave che contribuiscono al patterning di linee cellulari nel midollo spinale. Nelle fasi successive dello sviluppo, al piano piastra regola la navigazione degli assoni nel midollo spinale, agendo come barriera per impedire il passaggio degli assoni ipsilaterali e controllo attraversamento linea mediana da assoni commissurali 1. Queste funzioni sono raggiunti attraverso la secrezione di vari segnali di orientamento. Alcuni di questi segnali agiscono come attrattivi e repellenti per gli assoni crescenti mentre altri regolano recettori di orientamento e di segnalazione a valle di modulare la sensibilità degli assoni ai segnali locali di orientamento 2,3. Qui si descrive un metodo che consente di studiare le proprietà del pavimento piastra segnali derivati ​​in una varietà di svicontesti lopmental, basate sulla produzione di medio Floor-Plate condizionata (FP cm) 4-6. Abbiamo poi esemplificare l&#39;uso di questo FP cm nel contesto di guida degli assoni. In primo luogo, il midollo spinale è isolato da embrione di topo a E12.5 e il pavimento piastra è sezionato fuori e coltivato in una matrice plasma-trombina (Figura 1). Seconda due giorni dopo, il tessuto commissurali vengono sezionati fuori da embrioni E12.5, triturato ed esposto al cm FP. In terzo luogo, il tessuto vengono elaborati per l&#39;analisi Western Blot dei marcatori commissurali.

Commessurali tessuti sono stati trattati dal cm FP ed i campioni sono stati processati per l'analisi dei livelli di recettore in Western blot. Applicazione delle cm FP ha mostrato di aumentare i livelli di un recettore orientamento, PlexinA1, che media la sensibilità degli assoni commessurali alla linea mediana repellente Semaphorin3B dopo aver attraversato (Figura 2). Ciò ha rivelato che i segnali diffusi dalla FP regolare i livelli di PlexinA1 4,6. <p class="jove_c...

La piastra è una struttura fondamentale delle sviluppo del midollo spinale, che forniscono segnali diffusibili di progenitori e differenziazione dei neuroni. Descriviamo un metodo per produrre pavimento piatto mezzo condizionato, per applicarla al tessuto del midollo spinale fresco, e di valutare le conseguenze sulle proteine ​​di interesse da biochimica.

Cultura della Isolato Piastra di tessuti e la produzione di mezzo condizionato per valutare le proprietà funzionali del pavimento segnali piastra rilasciato

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le proprietà dei segnali derivati dalla piastra di pavimento in una varietà di contesti di sviluppo basati sulla produzione di mezzo condizionato dalla piastra di pavimento. Ciò si ottiene isolando prima il midollo spinale dall'embrione di topo a E 12,5 e sezionando la piastra del pavimento. Il secondo passo consiste nel coltivare la piastra di base in una matrice di trombina plasmatica per produrre terreni condizionati con piastra di base.Successivamente, il midollo spinale degli embrioni di topo a E 12.5 viene isolato e il tessuto dorsale contenente i neuroni comm e corali viene sezionato. La fase finale è la tazione e l'esposizione del tessuto di comunicazione sezionato a campioni di terreno condizionato con piastra a pavimento. Infine, il tessuto viene processato per l'analisi biochimica come il western blot per mostrare l'espressione dei marcatori commissurali.Questo metodo può aiutare la domanda zuki nel campo della biologia dello sviluppo. I segnali rilasciati dalla placca pianale svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del grasso cellulare, della differenziazione, della proliferazione e della guida assonale dei tessuti e delle cellule di varia origine. ZA essere esposto al mezzo di condizione della piastra del pavimento, dimostrando che la procedura sarà gentile con un tecnico A del laboratorio.Inizia questa procedura posizionando una topolina gravida gravida E 12.5 con il lato ventrale della gravidanza soppressa rivolta verso l'alto. Immergere l'addome con etanolo al 70%. Quindi, pizzica la pelle dell'addome con una pinza e taglia la pelle e gli strati peritoneali con le forbici chirurgiche.Fai un'incisione per esporre la cavità addominale. Una serie di embrioni è presente su ciascun lato del topo. Afferrare un corno dell'utero nel tessuto tra due embrioni e sezionarlo partendo dalla parte esterna.Quindi trasferire l'utero intatto in una capsula di Petri da 100 millimetri con PBS freddo su ghiaccio. Successivamente, estrai gli embrioni dai tessuti extra embrionali. Afferrare il tessuto placentare rosso scuro con due paia di pinze e tirare delicatamente per strappare il tessuto e rimuovere gli embrioni dal sacco uterino.In una cappa di dissezione, posizionare un embrione in una goccia di glucosio freddo HBSS. Dopo aver decapitato l'embrione, posizionare l'embrione con il lato ventrale rivolto verso il basso con la parte anteriore rivolta verso lo sperimentatore. Pizzica la pelle dell'embrione con un paio di pinze e tira via la pelle con l'altro paio.Ripetere questo passaggio fino a quando la pelle non è completamente rimossa dalla parte anteriore dell'embrione. Quindi girare il lato anteriore dell'embrione verso sinistra con una pinza. Bloccare l'embrione nella parte anteriore.Fai in modo che l'altra pinza afferri la pelle e tiri verso il lato rostrale per esporre il midollo spinale. Quindi, usa un lato della pinza per tagliare le meningi che stanno ancora avvolgendo il midollo spinale. Il midollo spinale è ora aperto.Quindi gira gli embrioni anteriormente al tuo lato verso destra. Staccare il tessuto dal midollo spinale, partendo dal lato cervicale dell'embrione facendo scorrere la pinza sotto il midollo spinale e staccando il tessuto circostante e i gangli della radice dorsale con piccoli movimenti rotatori. Quindi posizionare il midollo spinale isolato in una goccia fresca di HBSS freddo in posizione piatta con le meningi sulla parte superiore e il lato anteriore lontano dallo sperimentatore.Successivamente, fissare il midollo spinale attraverso il cervello posteriore rimanente con una pinza e afferrare le meningi con la seconda pinza. Quindi staccare le meningi partendo dal lato rostrale del midollo spinale con movimento lento e costante per la dissezione della placca del pavimento. Pizzica il cervello posteriore con una pinza e taglia la piastra del pavimento con un bisturi.Quindi conservare la piastra del pavimento sezionata in mezzo neurobasale. Aggiungere la temperatura ambiente. In questa procedura, posizionare diversi vetrini coprioggetti sterili in una piastra di Petri da 100 millimetri.Pipettare quindi 20 microlitri di plasma al centro di ogni vetrino coprioggetti. Quindi trasferire da due a quattro piastre del pavimento su ciascuna goccia di plasma. Aggiungere 20 microlitri di trombina HBSS alla goccia di plasma, mescolarli accuratamente con la punta di una pipetta ed evitare il contatto con gli espianti della piastra di fondo e conservare i vetrini coprioggetti per un minimo di 10 minuti a temperatura ambiente per consentire la coagulazione del plasma.Il coagulo di plasma si ritrae di alcuni micron come segno della coagulazione e la coagulazione non deve essere interrotta prematuramente per evitare il distacco del coagulo di plasma. Successivamente, trasferire ogni vetrino di copertura in una piastra a quattro pozzetti e aggiungere 500 microlitri di neuro basale più B 27. Incubarli per 48 ore a 37 gradi Celsius.Dopo 48 ore in una cappa di coltura tissutale, raccogliere il terreno da ciascuna. Beh, con attenzione. Fare attenzione a non pipettare la miscela di trombina al plasma polimerizzato o eventuali frammenti di piastra sul pavimento.Quindi conservare aliquote da 100 microlitri a meno 80 gradi Celsius. I neuroni commissurali si trovano nella parte più laterale del midollo spinale. Per sezionare i neuroni commissurali, pizzicare il cervello posteriore con una pinza e tagliare la parte laterale con un bisturi sottile.Quindi conservare il tessuto sezionato in mezzo neuro basale su ghiaccio. Per l'uso immediato per trattare i neuroni del coro comunicativo, lacerare il tessuto corale con piccole forbici. Tagliare il tessuto il più piccolo possibile per potenziare l'accessibilità delle cellule.Successivamente, distribuire uniformemente il tessuto tra le diverse condizioni sperimentali. Trattamento di controllo e trattamento medio condizionato con piastra a pavimento. Successivamente centrifugare i frammenti di tessuto a 800 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius.Quindi, se necessario, controllare la ripartizione tra i tubi. Ridistribuire e centrifugare nuovamente fino a quando i frammenti non sono distribuiti equamente. Successivamente, rimuovere il surnatante, aggiungere la piastra calda del pavimento, il terreno condizionato o i trattamenti di controllo ai tessuti.Successivamente, incubare i tessuti a 37 gradi Celsius per 30 minuti e agitarli delicatamente ogni 10-15 minuti. Quindi centrifugarli a 800 volte G per un minuto e rimuovere il trattamento alla fine. Aggiungere il tampone di lisi.In questo esperimento, il tessuto spinale dorsale è stato raccolto dilatato e stimolato con il terreno condizionato con la piastra del pavimento o il mezzo di controllo. I campioni sono stati lisati e processati per il Western blot. Le proteine sono state quindi sondate con anticorpi, plesso e uno e beta actina.Qui il western blot illustra un aumento del plesso e di un livello uno nel campione stimolato con il mezzo condizionato con la piastra del pavimento. Il dot blot mostra l'espressione di GDNF in un mezzo condizionato con piastra a pavimento rispetto al suo mezzo di controllo. Seguendo questa procedura o il metodo potrebbe essere eseguito invece di essere stimolato e processato per il sangue occidentale.Il tessuto contenente le cellule di interesse potrebbe essere dissociato e le cellule isolate potrebbero essere piastrate su vetrini. Il terreno di coltura può essere applicato su cellule di coltura e la modifica del comportamento cellulare o dell'espressione proteica può essere valutata, ad esempio, mediante immunochimica. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come delike diverse parti del midollo spinale e come stimolare il tessuto fresco acuto prima di procedere con la biochimica.

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Cultura della Isolato Piastra di tessuti e la produzione di mezzo condizionato per valutare le proprietà funzionali del pavimento segnali piastra rilasciato (Video) | JoVE Journal

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