Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire gli aspetti chiave dell'imaging cronico a due fotoni nei topi, esplorando un ambiente di realtà virtuale. Ciò si ottiene modificando un microscopio a due fotoni per un imaging veloce e stabile nei topi che si comportano. Successivamente, viene installato un tapis roulant ad aria in grado di tracciare la locomozione.

Successivamente viene preparato un ambiente di realtà virtuale che utilizza un proiettore LED sincronizzato con il microscopio in modo da ridurre al minimo la dispersione di luce. Di conseguenza, si ottengono registrazioni di immagini buone e stabili grazie alla riduzione degli artefatti di movimento, alla riduzione della perdita di luce e alla minimizzazione del bordo danneggiato dalla foto. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per misurare la neuroattività durante la navigazione in un ambiente di realtà virtuale, può anche essere facilmente adattato a un'ampia varietà di paradigmi comportamentali diversi che richiedono la stimolazione visiva.

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate ed eseguite in conformità con le linee guida del dipartimento veterinario del Cantone di Basilio. Il microscopio a due fotoni utilizzato in questi esperimenti è costituito da una testa di scansione composta da uno scanner risonante da otto o 12 kilohertz e da un galvanometro standard. Ciò consente frame rate di 40 o 60 hertz a 750 x 400 pixel e riduce la distorsione dell'immagine indotta dal movimento cerebrale, il fotobleaching e la fototossicità.

Un passo-passo Z piezoelettrico ad alta velocità viene utilizzato per acquisire in sequenza immagini interlacciate nel tempo a più profondità. Un blanker meccanico viene utilizzato per ridurre l'esposizione del laser al tessuto nei punti di inversione del percorso di scansione, il blanker deve essere regolabile per impostarne la larghezza. A seconda dell'ampiezza dello scanner risonante, collegare un tubo di alimentazione dell'aria con un diametro interno di almeno 10 millimetri al supporto della sfera del tapis roulant e posizionare una quantità BLE di tubo tra l'alimentazione dell'aria principale e il supporto della sfera per ridurre il rumore.

Posiziona una palla di polistirene espanso, di 20 centimetri di diametro in un supporto per palline progettato su misura e stampato in 3D. Se il paradigma comportamentale richiede solo la locomozione in avanti e all'indietro, inserire un perno come un ago ipodermico calibro 19 sul lato della palla. Per limitare il movimento della palla sull'asse orizzontale, utilizzare uno o due mouse ottici per computer per tracciare il movimento della palla attorno a due o tutti e tre gli assi rispettivamente.

Per preparare l'ambiente di realtà virtuale, utilizzare proiettori LED o schermi di computer retroilluminati a LED per il display. Integra un circuito di gating per uno sfarfallio rapido dei LED durante l'imaging. La frequenza di sfarfallio di 24 kilohertz è ordini di grandezza al di sopra della soglia di fusione dello sfarfallio, al di sopra della quale lo sfarfallio non è più percepito dall'animale.

Regolare l'esatta frequenza di sfarfallio e il ciclo di lavoro per sincronizzare l'emissione luminosa del proiettore con i punti di inversione dello scanner risonante per il tracciamento della pupilla, utilizzare una videocamera basata su CMO. Assicurarsi che la fotocamera non contenga un filtro di blocco degli infrarossi. Circa due o tre settimane dopo l'iniezione dell'indicatore genetico del calcio e l'impianto di una finestra cranica, utilizzare l'illuminazione a epifluorescenza per controllare la chiarezza e l'espressione dell'impianto della finestra cranica.

Chiaramente visibile e ben definito. I confini dei vasi sanguigni superficiali sono una buona indicazione che l'impianto della finestra è adatto per l'imaging uno o due giorni dopo. Per eseguire l'esperimento dei due fotoni, misurare e regolare la potenza del laser a un valore inferiore a 50 milliwatt sul campione.

Quindi attivare il flusso d'aria verso il tapis roulant sferico. Successivamente, fissa l'animale sul tapis roulant sferico. Le prime volte che il mouse è a testa fissa.

Questo processo può essere facilitato sedando brevemente l'animale con isofluoro. Una volta che l'animale si è abituato alla procedura, il montaggio può essere normalmente eseguito senza sedazione. Si noti che è fondamentale ridurre al minimo lo stress per l'animale durante questa procedura.

Quindi posizionare il sistema di visualizzazione il più vicino possibile all'animale per consentire comunque l'accesso all'animale. Assicurarsi che l'impianto della finestra cranica sia privo di sporco e pulirlo con acqua se necessario, applicare un gel per ultrasuoni trasparente come mezzo di immersione tra la finestra cranica e l'obiettivo di immersione in acqua per la schermatura della luce. Avvolgi un pezzo di nastro adesivo nero attorno all'obiettivo e alla barra della testa.

Sposta l'arena dell'ambiente virtuale nella sua posizione finale e regola la videocamera per il tracciamento della pupilla. Infine, impostare il laser blanker in modo che corrisponda all'ampiezza di scansione utilizzata durante l'esperimento e iniziare a registrare i dati al termine degli esperimenti. Sopprimere l'animale secondo le linee guida del tuo istituto.

La qualità dell'immagine nell'imaging del calcio a due fotoni di popolazioni cellulari marcate con un indicatore genetico del calcio dipende in gran parte dalla qualità dell'impianto della finestra cranica, come dimostrato qui quando si controlla la chiarezza della finestra cranica dopo l'iniezione del virus, non dovrebbe essere visibile alcun tessuto di granulazione o ricrescita ossea. Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali dovrebbe rimanere invariato e i confini del sistema vascolare dovrebbero essere ben definiti. Allo stesso tempo, la BOI delle cellule marcate dovrebbe essere chiaramente visibile al microscopio a epifluorescenza.

Idealmente, la preparazione è abbastanza stabile in modo tale che le distorsioni delle immagini a due fotoni indotte dalla locomozione del topo non siano visibili nell'immagine dopo la registrazione del fotogramma. La perdita di luce dal sistema di stimolazione visiva può essere completamente eliminata cronometrando correttamente l'emissione luminosa del proiettore rispetto ai punti di rotazione dello scanner di risonanza. Quando i dati non vengono acquisiti, la frequenza di sfarfallio della sorgente luminosa dovrebbe essere il doppio della frequenza di scansione.

In questo esempio, il blanker è stato rimosso per illustrare l'effetto della perdita di luce mostrata nelle caselle arancioni durante la stimolazione visiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire due volte nell'imaging, comportarsi con i topi, navigare in un ambiente di realtà virtuale. Oltre a configurare i sistemi di imaging e realtà virtuale come descritto qui, la chiave del successo in questi esperimenti è padroneggiare la tecnica dell'impianto della finestra cranica.

Un impianto pulito è un prerequisito per immagini di alta qualità e registrazioni stabili.