Name: Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri l'imaging a due fotoni nel cervello di topi che navigano in realtà virtuale. Questo metodo riduce gli artefatti da movimento e la dispersione di luce per registrare l'attività neuronale con elevata stabilità.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, la Max Planck Society, e la Scienza del programma Human Frontiers.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità alle direttive del Dipartimento veterinario del Cantone di Basilea-Città. 1. Configurazione hardware e software <ol><li> Due fotoni configurazione microscopio a scansione: <ol><li> Utilizzare un laser infrarosso ad impulsi come fonte di illuminazione (larghezza di impulso &lt;120 fsec). </li><li> Utilizzare una testa di scansione composta da uno scanner di risonanza 8 o 12 kHz e un livello galvanometro. Nota: questo permette un frame rate di 40 o 60 Hz a 750 x 400 pixel. Un frame rate elevato è fondamentale per ridurre al minimo il movimento del cervello distorsione dell&#39;immagine indotta. Inoltre, i risultati di scansione veloce di risonanza in un rendimento superiore del segnale e riduce photobleaching 16 e fototossicità. </li><li> Utilizzare una velocità elevata z-stepper piezo-elettrico in sequenza le immagini intercalati tempo acquisiscono a più profondità. Nota: Questo è opzionale e utilizzato per aumentare la resa dei dati a scapito del frame rate. </li><li> Utilizzare amblanker eccanico per ridurre l&#39;esposizione laser al tessuto. Regolare la larghezza della blanker funzione dell&#39;ampiezza dello scanner risonante Nota:. Causa della natura sinusoidale del percorso di scansione di uno scanner di risonanza, il raggio laser si muove invece lento nei punti di consegna di scansione. Per evitare danni del tessuto in questi punti di consegna in cui l&#39;esposizione laser è maggiore, un blanker meccanico viene introdotto nel piano focale tra la scansione e lenti tubo che interrompe il fascio laser. </li><li> Per l&#39;acquisizione dei dati utilizzare un digitalizzatore ad alta velocità (800 MHz) in combinazione con una matrice di field-programmable gate (FPGA). Nota: I filtri passa-alto FPGA e cestini il segnale PMT in pixel. La combinazione del filtro passa-alto sul FPGA e il filtro passa-basso effetto il risultato amplificatore PMT in un filtro passa-banda centrato approssimativamente intorno alla frequenza di ripetizione del laser (80 MHz). Esempio di codice FPGA viene fornito come supplemento. </li></ol></li><li> Impostazione tapis roulant Air supportato basato sul disegno di Dombeck e colleghi 2 <ol><li> Collegare il titolare palla per una linea di alimentazione dell&#39;aria utilizzando un tubo di alimentazione di aria di almeno 10 mm di diametro interno. Massimizzare la sezione del bocchettone di rifornimento dell&#39;aria portapalline e posizionare ampie quantità di tubazione tra l&#39;alimentazione dell&#39;aria principale e la porta pallina Nota:. Aumento sezione trasversale e una maggiore lunghezza del tubo di alimentazione dell&#39;aria riduce la generazione di rumore. </li><li> Mettere una pallina di polistirolo espanso (diametro 20 cm) in un supporto palla custom-designed e 3D-stampati. </li><li> Se il paradigma comportamentale richiede solo avanti (e indietro) locomozione, limitare il movimento della sfera e la (pitch) asse orizzontale inserendo un perno (ad esempio un ago ipodermico G 19) sul lato della palla Nota:. Tipicamente animali si adattano alle l&#39;installazione molto più veloce in questo paradigma di rotazione ridotta. </li><li> Traccia movimento della palla con una o due mouse per computer otticiper rilevare il movimento intorno a due o tutti e tre gli assi, rispettivamente. Nota: I mouse per computer dovrebbe idealmente operare con un diodo ad infrarossi per almeno interferenze con il imaging. </li></ol></li><li> Impostazione ambiente di realtà virtuale <ol><li> Preparare l&#39;ambiente di realtà virtuale. Nota: Un ambiente campione basato su Panda3D, un motore di gioco liberamente disponibile, è fornito come supplemento. Gli oggetti dell&#39;ambiente virtuale vengono generati utilizzando Wings3D, un modellatore 3D open source. Il programma di esempio legge le informazioni di posizione su una scheda di acquisizione dati e questo si traduce in movimento in un ambiente virtuale. Il codice esegue la trasformazione non lineare necessaria per l&#39;ambiente da proiettare su uno schermo toroidale. La costruzione dettagliata della schermata toroidale è stato descritto altrove 14,17. </li><li> Utilizzare proiettori LED o schermi di computer retroilluminati a LED per la visualizzazione di un ambiente virtuale. Integrare un circuito gatingCUIT per un veloce sfarfallio dei LED durante l&#39;imaging. Nota: Un problema inerente a due fotoni di imaging durante la stimolazione visiva è perdita di luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva, che può essere ridotto schermando l&#39;obiettivo. Tuttavia, leggera perdita dal sistema di stimolazione visiva può essere completamente abolita sincronizzando l&#39;emissione di luce del proiettore ai punti di consegna dello scanner di risonanza (quando i dati non vengono acquisiti), come si fa con arene LED utilizzati per la stimolazione visiva durante l&#39;imaging in Drosophila 18. Ciò si traduce in un efficace alternanza alta velocità di stimolazione visiva e acquisizione dati (vedere la Figura 2). La frequenza di sfarfallio (24 kHz) è ordini di grandezza superiori alla soglia sfarfallio di fusione, dal quale sfarfallio non è più percepito dall&#39;animale. Lo schema del circuito elettronico di questa modifica a un proiettore commerciale LED è mostrato in Figura 3. </li></ol></li><li> Cuccioloil monitoraggio <ol><li> Utilizzare una videocamera basata CMOS (30 fps) per il rilevamento di posizione della pupilla. Assicurarsi che la fotocamera non contiene un filtro di blocco infrarossi. Nota: L&#39;allievo è visibile ad alto contrasto durante le registrazioni a causa della luce diffusa dal laser di eccitazione a due fotoni in uscita attraverso l&#39;occhio. Posizione della pupilla e diametro viene estratto in tempo reale utilizzando software programmato personalizzato basato sul disegno di Sakatani e Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. Iniezione di calcio genetica Indicator e la finestra Implant L&#39;iniezione di un indicatore di calcio 20 e l&#39;impianto della finestra cranica 21 vengono eseguiti come precedentemente descritto con le seguenti aggiunte: <ol><li> Iniettare il virus nella regione di interesse utilizzando una pipetta di iniezione vetro ripiena con soluzione virus e collegato ad un sistema di iniezione a pressione. Regolare la pressione in funzione della pipetta interna-diametro, tipicamente ca. 70-140 mbar, per iniettare circa 100 nl di soluzione virus nel corso di 1-2 min. Impulsi di iniezione basso volume erogato a bassa frequenza (0,05 sec impulsi a 2 Hz) dovrebbero essere utilizzati al fine di evitare overflow del virus lungo la pipetta durante l&#39;iniezione. Nota: Al fine di controllare il volume di iniezione, la pipetta può essere marcato in piccola , lunghezze equidistanti (ad esempio 0,5 millimetri) sotto un microscopio stereo. Spostamento del menisco tra le marcature può quindi essere utilizzato per stimare il volume iniettato. </li><li> Diversi iniezione settimane dopo ciò dovrebbe comportare un bolo di cellule densamente marcate con un diametro di circa 500 micron. Efficacia di espressione GECI nella regione di interesse dipende dalla scelta di GECI e combinazione promotore, così come il titolo infettivo e sierotipo di AAV ricombinante usato Nota:. Come esempio rappresentativo, iniezione di AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una tetta viraleer di 8 x 10 12 GC / ml nella corteccia visiva primaria del mouse comporta espressioni soddisfacente a circa due settimane dopo l&#39;iniezione (Figura 1). </li><li> La barra testa non deve ostacolare il campo visivo del mouse, ma deve essere sufficientemente rigido per consentire l&#39;imaging stabile durante il comportamento. Ciò richiede in genere due punti di attacco su entrambi i lati della barra di testa (vedi figura 1). Per fissare saldamente la barra testa al cranio, assicurarsi di massimizzare e asciugare la zona del cranio esposto in cui sarà allegata la barra testa. Inoltre, utilizzando un bisturi o una siringa, graffiare il cranio per creare scanalature superficiali aumentando così la superficie di incollaggio. Coprire l&#39;osso con tessuto adesivo cianoacrilato prima di fissare la barra testa con cemento dentale. </li></ol> 3. Procedura sperimentale <ol><li> Due o tre settimane dopo l&#39;iniezione del virus, controllare la finestra di impianto craniale per chiarezza e di espressione in epiilluminazione a fluorescenza. Confini chiaramente visibili e ben definiti dei vasi sanguigni superficiali sono una buona indicazione che l&#39;impianto finestra è adatto per l&#39;imaging (vedere Figura 1). </li><li> Misurare e regolare la potenza del laser ad un valore inferiore a 50 mW a campione. </li><li> Accendere il flusso d&#39;aria per il tapis roulant sferica. </li><li> Per il fissaggio testa sotto il microscopio, brevemente anestetizzare l&#39;animale con isoflurano per ridurre lo stress. Posto l&#39;animale in un contenitore anestesia isoflurano e attendere che le fermate degli animali in movimento (circa 10 sec). Rimuovere l&#39;animale e subito la testa fissarlo sotto il microscopio. </li><li> Posizionare il sistema di visualizzazione più vicino possibile all&#39;animale per consentire ancora per l&#39;accesso agli animali. Il contatto visivo meno l&#39;animale ha con lo sperimentatore, il meno stressato l&#39;animale sarà durante la fase iniziale dell&#39;esperimento. </li><li> Assicurarsi che la finestra di protesi cranica è libero di polvere e sporcizia. Pulire con acquase necessario. </li><li> Applicare il gel trasparente ultrasuoni come mezzo di immersione tra la finestra cranica e l&#39;obiettivo di acqua-immersion. Questo risolve i problemi di lenta degradazione dell&#39;immagine dovuta all&#39;evaporazione di acqua o perdite e riduce la necessità di montare un cono sulla barra testa di trattenere l&#39;acqua. Nota: Centrifugare il gel prima dell&#39;uso per rimuovere tutte le bolle d&#39;aria, e fare attenzione a non creare l&#39;aria bolle durante l&#39;applicazione del gel. Le bolle d&#39;aria possono ridurre notevolmente la qualità dell&#39;immagine. </li><li> Avvolgere un pezzo di nastro adesivo nero attorno al bar oggettiva e la testa per la schermatura della luce. </li><li> Spostare l&#39;arena ambiente virtuale nella sua posizione definitiva e regolare la telecamera per il monitoraggio degli alunni. </li><li> Impostare la blanker laser per abbinare l&#39;ampiezza di scansione utilizzata durante l&#39;esperimento. </li><li> Avviare la registrazione dei dati. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La chiave del successo di comportamentale due fotoni di imaging è la stabilità della preparazione in due modi: <ol><li> Nel corso della finestra giorni dopo l&#39;impianto, risposte infiammatorie del tessuto possono portare al miglioramento della formazione di tessuto di granulazione e la cartilagine che ostacolare o addirittura impedire imaging. </li><li> Durante l&#39;esperimento il cervello deve essere abbastanza stabile per evitare artefatti da movimento di danneggiare segnale di fluorescenza attività relativa n...

Due fotoni di imaging di indicatori di calcio (geneticamente codificate come GCaMP5 7 o R-GECO 8, o coloranti sintetici come OGB o Fluo4) è emersa come un potente metodo di misurazione dell&#39;attività neuronale nel comportarsi topi 1-6. Esso consente la misurazione simultanea dell&#39;attività di centinaia di cellule a potenziale risoluzione azione quasi unico, fino a circa 800 micron sotto la superficie del cervello 9,10. Inoltre, utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) attività neuronale può essere misurata cronicamente 5,11,12, e in tipi di cellule geneticamente definiti 13. Insieme, questi metodi forniscono un grado di risoluzione temporale e spaziale che aprono una moltitudine di nuove possibilità nello studio della computazione neuronale in vivo. È necessario un intervento chirurgico per esporre ed etichettare il cervello del mouse per l&#39;imaging. Le cellule trasfettate sono tipicamente utilizzando un vir adeno-associato ricombinante<html> siamo Sistema (AAV) per la consegna GECI e una finestra cranica è impiantato sul sito di iniezione per ottenere l&#39;accesso ottico al cervello. Una barra di testa è poi collegato al cranio per il fissaggio testa sotto il microscopio a due fotoni. La progettazione e l&#39;attuazione di questi passaggi è fondamentale come la maggior parte dei problemi con l&#39;imaging sveglio derivano da instabilità nella preparazione. Idealmente la procedura qui descritta dovrebbe consentire per l&#39;imaging cronica fino a diversi mesi dopo l&#39;intervento. Per abilitare il comportamento guidato visivamente durante l&#39;imaging a due fotoni, il mouse fisso testa si siede su un gonfiabile tapis roulant sferica, che si può utilizzare per navigare in un ambiente di realtà virtuale. Locomozione del mouse sul tapis roulant è accoppiato al movimento in un ambiente virtuale che viene visualizzata su uno schermo toroidale che circonda il 14,15 mouse. Variabili comportamentali come la locomozione, stimoli visivi, e la posizione della pupilla possono essere registrate 6. t &quot;&gt; Descriviamo le procedure necessarie cronica due fotoni di imaging in topi esplorare un ambiente di realtà virtuale I punti fondamentali affrontate sono:. riduzione di artefatti di movimento, riduzione della perdita di luce, massimizzazione del numero di cellule registrate simultaneamente, e ridurre al minimo danni photo. Abbiamo anche fornito dettagli sulla configurazione del tapis roulant aria-di sostegno, il monitoraggio allievo, e l&#39;ambiente di realtà virtuale. Le procedure qui descritte possono essere utilizzate per l&#39;imaging popolazioni di cellule fluorescente nei topi fissati alla testa in una potenzialmente vasta gamma di paradigmi comportamentali .

<table><tbody><tr><td>Vetrini coprioggetti (diametro = 3-5 mm)</td><td>Impianto a finestra</td> <td>Menzel</td><td></td></tr><tr><td>Laser InSight DeepSee</td><td>Microscopio Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner a risonanza 12 kHz Microscopio</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td></td></tr><tr><td>Galvometro</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td></td></tr><tr><td>microscopio Digitalizzatore</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscopio</td></tr><tr><td>FPGA</td> National <td>Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>microscopio</td></tr><tr><td>Scheda di acquisizione</td> National <td>Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td></td></tr><tr><td>microscopio Filtro di emissione 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelettrico z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>microscopio</td></tr><tr><td>Controller per piezoelettrico azionamento</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 Microscopio LVPZT</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 16X, 0,8NA</td><td>Microscopio Nikon</td><td>CFI75</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore di corrente</td><td>Microscopio Femto</td><td>DHPCA-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomoltiplicatore</td><td>Microscopio Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera USB senza filtro IR</td><td>ImagingTracciamento</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>della sorgente DMK22BUC03 pupillaObiettivo 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>tracciamento pupillare</td></tr><tr><td>Anelli adattatori macro</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>tracciamento pupillare</td></tr><tr><td>Mouse ottico per computer</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>rilevamento del movimento</td></tr><tr><td>Palla di polistirolo 20 cm</td><td>, ad es. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>ambiente virtuale</td></tr><tr><td>Proiettore LED</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtuale National</td></tr><tr><td></td><td>Instruments</td><td>NI 6009</td><td>ambiente virtuale</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Libreria Numpy per Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Scipy libreria per Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>ambiente virtuale</td></tr><tr><td>Driver NI-DAQmx</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>ambiente virtuale</td></tr><tr><td>Gel per ultrasuoni</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>imaging</td></tr></tbody></table>

due fotoni imaging di calcio in topi navigazione una realtà ambiente virtuale

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Negli ultimi anni, l&#39;imaging a due fotoni è diventato uno strumento prezioso in neuroscienze, in quanto consente di misurazione cronica della attività delle cellule geneticamente identificati durante comportamento 1-6. Qui si descrivono metodi per eseguire due fotoni di imaging in topo corteccia mentre l&#39;animale si sposta un ambiente di realtà virtuale. Ci concentriamo sugli aspetti delle procedure sperimentali che sono fondamentali per l&#39;imaging in un animale si comporta in un ambiente virtuale illuminata. I problemi principali che sorgono in questa configurazione sperimentale che noi qui l&#39;indirizzo sono: ridurre al minimo gli artefatti da movimento legati al cervello, riducendo al minimo perdite luce dal sistema di realtà virtuale di proiezione, e minimizzando laser indotto danni ai tessuti. Forniamo anche software di esempio per controllare l&#39;ambiente di realtà virtuale e di fare il monitoraggio allievo. Con queste procedure e risorse dovrebbe essere possibile convertire un microscopio a due fotoni convenzionale per uso nel comportarsi topi.

La qualità dell&#39;immagine in due fotoni Imaging di calcio di popolazioni di cellule marcate con un GECI dipende in gran parte la qualità della finestra protesi cranica. Due settimane dopo l&#39;iniezione del virus della finestra del cranio devono essere ispezionati per chiarezza. Non ci dovrebbe essere tessuto di granulazione o ricrescita ossea visibile (Figura 1A). Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali rimanga invariato e confini del sistema vascolare deve essere nettamente definito. A...

Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.

Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire gli aspetti chiave dell'imaging cronico a due fotoni nei topi, esplorando un ambiente di realtà virtuale. Ciò si ottiene modificando un microscopio a due fotoni per un imaging veloce e stabile nei topi che si comportano. Successivamente, viene installato un tapis roulant ad aria in grado di tracciare la locomozione.Successivamente viene preparato un ambiente di realtà virtuale che utilizza un proiettore LED sincronizzato con il microscopio in modo da ridurre al minimo la dispersione di luce. Di conseguenza, si ottengono registrazioni di immagini buone e stabili grazie alla riduzione degli artefatti di movimento, alla riduzione della perdita di luce e alla minimizzazione del bordo danneggiato dalla foto. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per misurare la neuroattività durante la navigazione in un ambiente di realtà virtuale, può anche essere facilmente adattato a un'ampia varietà di paradigmi comportamentali diversi che richiedono la stimolazione visiva.Tutte le procedure per gli animali sono state approvate ed eseguite in conformità con le linee guida del dipartimento veterinario del Cantone di Basilio. Il microscopio a due fotoni utilizzato in questi esperimenti è costituito da una testa di scansione composta da uno scanner risonante da otto o 12 kilohertz e da un galvanometro standard. Ciò consente frame rate di 40 o 60 hertz a 750 x 400 pixel e riduce la distorsione dell'immagine indotta dal movimento cerebrale, il fotobleaching e la fototossicità.Un passo-passo Z piezoelettrico ad alta velocità viene utilizzato per acquisire in sequenza immagini interlacciate nel tempo a più profondità. Un blanker meccanico viene utilizzato per ridurre l'esposizione del laser al tessuto nei punti di inversione del percorso di scansione, il blanker deve essere regolabile per impostarne la larghezza. A seconda dell'ampiezza dello scanner risonante, collegare un tubo di alimentazione dell'aria con un diametro interno di almeno 10 millimetri al supporto della sfera del tapis roulant e posizionare una quantità BLE di tubo tra l'alimentazione dell'aria principale e il supporto della sfera per ridurre il rumore.Posiziona una palla di polistirene espanso, di 20 centimetri di diametro in un supporto per palline progettato su misura e stampato in 3D. Se il paradigma comportamentale richiede solo la locomozione in avanti e all'indietro, inserire un perno come un ago ipodermico calibro 19 sul lato della palla. Per limitare il movimento della palla sull'asse orizzontale, utilizzare uno o due mouse ottici per computer per tracciare il movimento della palla attorno a due o tutti e tre gli assi rispettivamente.Per preparare l'ambiente di realtà virtuale, utilizzare proiettori LED o schermi di computer retroilluminati a LED per il display. Integra un circuito di gating per uno sfarfallio rapido dei LED durante l'imaging. La frequenza di sfarfallio di 24 kilohertz è ordini di grandezza al di sopra della soglia di fusione dello sfarfallio, al di sopra della quale lo sfarfallio non è più percepito dall'animale.Regolare l'esatta frequenza di sfarfallio e il ciclo di lavoro per sincronizzare l'emissione luminosa del proiettore con i punti di inversione dello scanner risonante per il tracciamento della pupilla, utilizzare una videocamera basata su CMO. Assicurarsi che la fotocamera non contenga un filtro di blocco degli infrarossi. Circa due o tre settimane dopo l'iniezione dell'indicatore genetico del calcio e l'impianto di una finestra cranica, utilizzare l'illuminazione a epifluorescenza per controllare la chiarezza e l'espressione dell'impianto della finestra cranica.Chiaramente visibile e ben definito. I confini dei vasi sanguigni superficiali sono una buona indicazione che l'impianto della finestra è adatto per l'imaging uno o due giorni dopo. Per eseguire l'esperimento dei due fotoni, misurare e regolare la potenza del laser a un valore inferiore a 50 milliwatt sul campione.Quindi attivare il flusso d'aria verso il tapis roulant sferico. Successivamente, fissa l'animale sul tapis roulant sferico. Le prime volte che il mouse è a testa fissa.Questo processo può essere facilitato sedando brevemente l'animale con isofluoro. Una volta che l'animale si è abituato alla procedura, il montaggio può essere normalmente eseguito senza sedazione. Si noti che è fondamentale ridurre al minimo lo stress per l'animale durante questa procedura.Quindi posizionare il sistema di visualizzazione il più vicino possibile all'animale per consentire comunque l'accesso all'animale. Assicurarsi che l'impianto della finestra cranica sia privo di sporco e pulirlo con acqua se necessario, applicare un gel per ultrasuoni trasparente come mezzo di immersione tra la finestra cranica e l'obiettivo di immersione in acqua per la schermatura della luce. Avvolgi un pezzo di nastro adesivo nero attorno all'obiettivo e alla barra della testa.Sposta l'arena dell'ambiente virtuale nella sua posizione finale e regola la videocamera per il tracciamento della pupilla. Infine, impostare il laser blanker in modo che corrisponda all'ampiezza di scansione utilizzata durante l'esperimento e iniziare a registrare i dati al termine degli esperimenti. Sopprimere l'animale secondo le linee guida del tuo istituto.La qualità dell'immagine nell'imaging del calcio a due fotoni di popolazioni cellulari marcate con un indicatore genetico del calcio dipende in gran parte dalla qualità dell'impianto della finestra cranica, come dimostrato qui quando si controlla la chiarezza della finestra cranica dopo l'iniezione del virus, non dovrebbe essere visibile alcun tessuto di granulazione o ricrescita ossea. Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali dovrebbe rimanere invariato e i confini del sistema vascolare dovrebbero essere ben definiti. Allo stesso tempo, la BOI delle cellule marcate dovrebbe essere chiaramente visibile al microscopio a epifluorescenza.Idealmente, la preparazione è abbastanza stabile in modo tale che le distorsioni delle immagini a due fotoni indotte dalla locomozione del topo non siano visibili nell'immagine dopo la registrazione del fotogramma. La perdita di luce dal sistema di stimolazione visiva può essere completamente eliminata cronometrando correttamente l'emissione luminosa del proiettore rispetto ai punti di rotazione dello scanner di risonanza. Quando i dati non vengono acquisiti, la frequenza di sfarfallio della sorgente luminosa dovrebbe essere il doppio della frequenza di scansione.In questo esempio, il blanker è stato rimosso per illustrare l'effetto della perdita di luce mostrata nelle caselle arancioni durante la stimolazione visiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire due volte nell'imaging, comportarsi con i topi, navigare in un ambiente di realtà virtuale. Oltre a configurare i sistemi di imaging e realtà virtuale come descritto qui, la chiave del successo in questi esperimenti è padroneggiare la tecnica dell'impianto della finestra cranica.Un impianto pulito è un prerequisito per immagini di alta qualità e registrazioni stabili.

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

Ricerca

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Fonte: Lee, H. et. al., Imaging di calcio in vivo riuscito con un microscopio miniaturizzato montato sulla testa nell'amigdala di un topo che si comporta liberamente. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra l'imaging del calcio in vivo in un topo utilizzando un indice di rifrazione a gradiente, o lente GRIN, e un microscopio miniaturizzato. La configurazione combina la fissazione della testa all'interno di un sistema di gabbie mobili senza attrito, stimolando i neuroni e innescando l'afflusso di...

Imaging microendoscopico del calcio in tempo reale in un topo che si muove liberamente

Fonte: Thapa, R., et. al., Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio In vivo.  J. Vis. Exp. (2021)Il video dimostra l'imaging del calcio in tempo reale utilizzando un miniscopio in un topo trasdotto, correlando l'attività neuronale con il comportamento.

Imaging del calcio in tempo reale di una corteccia prefrontale mediale di topo utilizzando un miniscopio

Presentiamo un protocollo per esporre il tronco encefalico del topo adulto dal lato ventrale. Utilizzando una lente indice gradient-rifrazione con un microscopio in miniatura, l'imaging di calcio può essere utilizzato per esaminare l'attività dei somata neurali olivari inferiori in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Miniscope in vivo calcium imaging è una potente tecnica per studiare le dinamiche neuronali e i microcircuiti in topi che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive l'esecuzione di interventi chirurgici al cervello per ottenere una buona imaging del calcio in vivo utilizzando un miniscopio.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Il presente protocollo descrive la realizzazione di una grande finestra cranica (6 x 3 mm2) utilizzando un involucro alimentare, silicone trasparente e vetro di copertura. Questa finestra cranica consente esperimenti di imaging di calcio a campo largo e a due fotoni in vivo nello stesso topo.

In vivo Imaging del calcio a campo largo e a due fotoni da un topo utilizzando una grande finestra cranica

Qui, presentiamo una configurazione hardware e software open source semplificata per studiare l'apprendimento spaziale del mouse utilizzando la realtà virtuale (VR). Questo sistema visualizza una traccia lineare virtuale a un mouse con la testa trattenuta che gira su una ruota utilizzando una rete di microcontrollori e un computer a scheda singola che esegue un pacchetto software grafico Python facile da usare.

Un sistema di realtà virtuale open source per la misurazione dell'apprendimento spaziale in topi con la testa trattenuta

Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per l'imaging delle risposte del calcio nel collicolo superiore (SC) dei topi svegli, compreso l'imaging dell'attività di un singolo neurone con microscopia a due fotoni, lasciando intatta la corteccia nei topi wild-type, e l'imaging dell'intero SC con microscopia ad ampio campo nei topi mutanti a corteccia parziale.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Se integrata con una piastra di testa e un design ottico compatibile con microscopi a singolo e due fotoni, la lente del microprisma presenta un vantaggio significativo nella misurazione delle risposte neurali in una colonna verticale in diverse condizioni, inclusi esperimenti ben controllati in stati di fissazione della testa o compiti comportamentali naturali in animali che si muovono liberamente.

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa

Scopri l'imaging a due fotoni nel cervello di topi che navigano in realtà virtuale. Questo metodo riduce gli artefatti da movimento e la dispersione di luce per registrare l'attività neuronale con elevata stabilità.

Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

Esplora altri video