Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l'uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di funzionalizzare il polietilenglicole e i peptidi con gruppi acrilato di metanfetamina per le successive polimerizzazioni a catena e la sintesi di idrogel. Ciò si ottiene combinando prima l'anidride acrilica di metanfetamina e il precursore funzionalizzato dall'ONU in una fiala di scintillazione. Il secondo passo consiste nell'utilizzare l'energia a microonde per funzionalizzare il peg o il peptide.

Successivamente, il PEG DM viene disciolto in clorometano, oppure il peptide viene scisso dalla resina. E tutti i gruppi di protezione della catena laterale vengono rimossi in un cocktail a base acida. Il passaggio finale consiste nel precipitare il peptide funzionalizzato PEG DM o metanfetammide acrilammide in etere.

In definitiva, la spettrometria di massa a tempo di volo del protone NMR o Maldi viene utilizzata per mostrare il successo della funzionalizzazione del peg o della macro peptidica. Ciao, mi chiamo Amy Van Hove. Sono uno studente di dottorato presso il dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Rochester.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la reazione del PEG con il fluoruro acrilico di metanfetamina è che la reazione è significativamente più veloce e più rispettosa dell'ambiente. Ciao, mi chiamo Brandon Wilson. Sono uno studente universitario in ingegneria chimica presso l'Università di Rochester.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei biomateriali, come ad esempio come gli idrogel prodotti utilizzando il dimetile peg possono essere impiegati per controllare la consegna di cellule terapeutiche nelle molecole. Ciao, sono Danielle Benoit, assistente professore presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Rochester. Le implicazioni di questa tecnica sono per lo sviluppo di terapie per una varietà di malattie, poiché i composti sintetizzati possono essere utilizzati per applicazioni di somministrazione cellulare e di farmaci.

Prima di iniziare questa procedura, la vetreria necessaria è stata essiccata in forno per un'ora per evitare la contaminazione con l'acqua in una grande barca di siero di latte. Fuori cinque grammi di peg con un peso molecolare compreso tra 1000 e 100.000 dalton. Se presente, rimuovere il pezzo di plastica dal coperchio di una fiala a scintillazione nella cappa chimica.

Erogare 10 molari in eccesso di anidride acrilica di metanfetamina in una fiala di scintillazione strappata. Quindi aggiungere PEG alla fiala. Quindi, attorcigliare il tappo sulla fiala e posizionare la fiala nel microonde.

Imposta il microonde su cinque minuti alla massima potenza indossando guanti resistenti al calore. Togli la fiala dal microonde ogni 30 secondi. Quindi serrare completamente il tappo e far vorticare il campione per 30 secondi.

Allentare il tappo prima di rimettere la fiala nel microonde. Ripetere questi passaggi fino a quando la soluzione non è stata cotta nel microonde per tutti i cinque minuti. Dopo aver rimosso la fiala dal microonde, allentare il tappo e lasciare raffreddare il PEG DM a temperatura ambiente.

Quindi sciogliere il PEG DM in 10-15 millilitri di clorometano. Far precipitare il PEG DM in 10 x eccesso di etere pre datile per 20 minuti. Utilizzando un imbuto Buckner da sette centimetri e un pallone da 500 millilitri.

Raccogliere il PEG DM mediante filtrazione sotto vuoto. Quindi, trasferire il PEG DM filtrato in un tubo conico da 50 millilitri con un ago di grosso calibro perforato attraverso il tappo per la ventilazione. Posizionare il tubo in una camera a vuoto e asciugare il PEG DM per una notte.

Dopo aver rimosso il tubo dalla camera a vuoto, sciogliere il PEG DM nel precipitato di clorometano DI con etere datilico ghiacciato. Per rimuovere l'anidride acrilica di metanfetamina non reattiva dopo la filtrazione e la raccolta, asciugare il PEG DM in una camera a vuoto come prima. Per l'analisi NMR protonica, inserire circa 10 milligrammi di PEG DM in una fiala di scintillazione e aggiungere circa un millilitro di cloroformio deuterato.

Una volta che il campione è disciolto, trasferirlo in una provetta NMR pulita. Successivamente, raccogliere gli spettri NMR del protone ed eseguire i campioni a temperatura ambiente per almeno 64 scansioni per ottenere una risoluzione dei dati sufficiente. Dopo aver sintetizzato il peptide di interesse mediante sintesi in fase solida, conservarlo sulla resina in DMF a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Quindi raccogliere la resina peptidica tramite filtrazione utilizzando un imbuto buckner di sette centimetri con carta da filtro e un pallone da 250 millilitri. Rimuovere il pezzo di plastica dal coperchio di una fiala a scintillazione e trasferire la resina nella fiala. Usando una pipetta usa e getta, aggiungere una quantità sufficiente di anidride acrilica di metanfetamina per coprire la resina Dopo aver ruotato liberamente il tappo sulla fiala, metterla nel microonde e impostare il timer su tre minuti.

Alla massima potenza indossando guanti resistenti al calore, rimuovere la fiala dal microonde ogni 15-20 secondi. Dopo aver serrato completamente il tappo, agitare il campione per 15 secondi. Allentare il tappo prima di rimettere la fiala nel microonde.

Ripetere l'operazione fino a quando la soluzione non è stata cotta nel microonde per tutti e tre i minuti. Con il tappo della fiala allentato, lasciare raffreddare la soluzione peptidica a temperatura ambiente utilizzando una piccola quantità di DMF e un imbuto buckner di sette centimetri. Con carta da filtro e un pallone da 250 millilitri.

Raccogliere la resina peptidica dalla fiala per la scissione e la protezione profonda. Trasferire la resina peptidica in una fiala di scintillazione fresca per 0,25 millimoli di peptide contenente arginina. Aggiungere 0,25 millilitri ciascuno di tri ISO, propilene, tre, sei biossidi, uno, otto ottani, diolo, tiolo, acqua deionizzata e 18,0 millilitri di TFA.

Quindi ruotare la miscela di reazione su un rotatore di terremoti da laboratorio per quattro ore a temperatura ambiente. Al termine, precipitare il peptide in 10 volte l'eccesso di etere etilico pre-raffreddato. Dividere la soluzione in modo uniforme in quattro provette coniche da 50 millilitri, centrifugare i quattro campioni a 3.200 G per 10 minuti per raccogliere il peptide dopo la centrifugazione, decantare l'etere, risospendere il peptide in 100 millilitri di etere etilico fresco diviso in due provette coniche da 50 millilitri.

Ripetere il processo di centrifugazione. Resus: sospendendo il peptide in 50 millilitri di etere fresco due volte per un totale di quattro lavaggi di etere dopo l'ultima fase di centrifugazione, decantare l'etere di scarto e asciugare il peptide per una notte sotto vuoto. Per preparare il campione per l'analisi del tempo di volo di Maldi, posizionare uno o due milligrammi di peptide in una provetta da 1,5 millilitri e sciogliere il campione in un millilitro di solvente maldi.

Successivamente, preparare una soluzione di matrice da 10 milligrammi per millilitro di acido alfa sano quattro idrossiceramici nel solvente multis. Combinare le soluzioni di peptide e matrice in un rapporto uno-a-uno, individuare un microlitro della soluzione combinata in tre posizioni separate sulla piastra del campione MALDI. Asciugare le macchie con una pistola termica.

Quindi riposizionare e asciugare ogni campione. Infine, raccogliere i dati del tempo di volo MALDI e confermare un aumento di 68 grammi per mole del peso molecolare dovuto all'aggiunta del gruppo acrilammide della metanfetamina all'estremità terminale del peptide. Qui è mostrato lo spettro NMR di un PEG DM lineare da due kilodalton funzionalizzato utilizzando il metodo assistito da microonde per questa reazione.

L'analisi NMR protonica può essere utilizzata per calcolare la percentuale di funzionalizzazione dal rapporto osservato a quello teorico tra i protoni terminali di metacrilato e i protoni PEG centrali. La percentuale di funzionalizzazione complessiva è del 91% e questo PEG DM è adeguatamente funzionalizzato per l'uso nella sintesi di idrogel. Vedere il protocollo di testo per i dettagli sul calcolo della percentuale di funzionalizzazione dovuta alla moltitudine di picchi di protoni che si verificano nell'analisi NMR protonica dei peptidi pep.

La funzionalizzazione dei peptidi è più facilmente studiata utilizzando la spettrometria di massa a tempo di volo maldi. Ciò è dimostrato qui dove il peptide G-K-R-G-D-S-G è stato sintetizzato e sottoposto a funzionalizzazione con metanfetammide, una piccola frazione del peptide è stata scissa per la valutazione del peso molecolare pre-funzionalizzazione, che ha mostrato il picco di peso molecolare osservato che si verifica a 676 grammi per mole, il peso molecolare atteso del peptide, il resto del peptide ha subito la funzionalizzazione della metanfetammide acrilammide prima della scissione dopo la funzionalizzazione della metanfetammide. Il picco di peso molecolare osservato si verifica a 744 grammi per mole, il peso previsto del peptide funzionalizzato con metanfetammide.

Per dimostrare la funzionalità sia del PEG DM che dei peptidi funzionalizzati con acrilammide metanfetamina, sono stati prodotti idrogel PEG con e senza 0,5 millimolari di metanfetamina. Il GK R-G-D-S-G funzionalizzato con acrilammide mostrato qui è rappresentato da immagini a contrasto di fase e fluorescenti morte vive di MSC su gel peg da soli e su gel peg contenenti il peptide funzionalizzato con metanfetamina. Le MSC non sono state in grado di aderire agli idrogel peg funzionalizzati dall'ONU, ma dopo l'inclusione del peptide di adesione cellulare RGD, sono state in grado di aderire e diffondersi sulla superficie dell'idrogel.

Le immagini dei morti vivi non rappresentano la vitalità della popolazione di MSC seminata. Piuttosto, le immagini fluorescenti hanno lo scopo di demarcare tra le cellule di aderenza e piccole variazioni nella topologia dell'idrogel, che possono essere difficili con il solo contrasto di fase. È interessante notare che le cellule non diffuse seminate sul PEG solo i gel si colorano positivamente sia per il calcio AM che per l'AUM Homodimer, indicando che le cellule stavano morendo al momento dell'imaging.

Uno dei tanti vantaggi degli idrogel PEG è la loro natura altamente sintonizzabile, che modifica la composizione specifica del piolo. L'idrogel offre ai ricercatori un alto grado di controllo su proprietà come il modulo di elasticità, come illustrato qui. È noto che sia il peso molecolare del PEG che la percentuale di peso controllano le dimensioni della maglia dell'idrogel, l'idrogel risultante, la rigidità e la velocità di rilascio dei farmaci incapsulati.

Ciò è stato dimostrato producendo idrogel con peso molecolare variabile PEG dm e studiando il modulo di idrogel risultante e la dimensione della maglia come ipotizzato aumentando il peso molecolare del peg. Il macer ha causato un aumento delle dimensioni delle maglie degli idrogel e una diminuzione della rigidità degli idrogel, le dimensioni delle maglie degli idrogel e la conseguente rigidità dei gel possono anche essere controllate modificando il peso. La percentuale di idrogel PEG è stata prodotta con peso variabile.

La percentuale di PEG DM lineare da 10 kilodalton e la rigidità dell'idrogel e la dimensione della maglia sono state determinate come illustrato qui, l'aumento della percentuale in peso del PEG provoca una diminuzione significativa della dimensione della maglia e un aumento della rigidità dell'idrogel. Gli idrogel contenenti albumina sierica bovina incapsulata sono stati formati utilizzando peg di peso molecolare variabile, come mostrato qui. Il rilascio di albumina sierica bovina avviene più rapidamente dagli idrogel formati utilizzando PEG DM a peso molecolare più elevato a causa della dimensione delle maglie più grandi all'interno dell'idrogel.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare il riconoscimento PEG DME utilizzando il metodo assistito da microonde e come valutare la funzionalizzazione utilizzando la risonanza magnetica protonica. Una volta padroneggiata questa procedura, si potrebbe anche utilizzare l'apertura dell'anello di gruppi idrolitici degradabili per rispondere a ulteriori domande su come la degradazione dell'idrogel influisce sulla funzione cellulare. Dovresti anche avere una buona comprensione di come questa tecnica può essere utilizzata per incorporare selettivamente le funzionalità dell'acrilammide di metanfetame sulle sequenze peptidiche terminali finali e come valutare questa funzionalizzazione utilizzando la spettrometria di massa multi tempo di volo.

Grazie per l'attenzione.