Name: In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri l'elettroporazione postnatale in vivo e l'imaging time-lapse per studiare la migrazione dei neuroblasti nel cervello di topo. Questo metodo consente l'analisi quantitativa della dinamica cellulare in tempo reale.

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MS e YZ sono supportati da KCL e KCL-Cina borse di dottorato. MO è stato finanziato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki per il plasmide PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti per preziosi consigli su elettroporazione.

Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali. 1. Postnatale elettroporazione 1.1. Preparazione di vetro Capillari, Soluzione DNA e Elettroporatore <ol><li> Preparare capillari tirato vetro (OD: 1,5 millimetri, ID: 0,86 millimetri) per l&#39;iniezione di DNA. (Impostazioni indicativi per una capillare estrattore Sutter P-97 sono: Heat 283; Tirare 50; Velocity 90; ora 50). Fare un segno sul capillare corrispondente ad un volume di circa 2 ml. </li><li> Impostare la tensione del elettroporatore a 5 impulsi quadrati, 50 msec / impulso a 100 V, con intervalli di 850 msec (100 V, impulso ON 50 msec, impulso OFF 850 ​​msec, impulsi 5). </li><li> Diluire elevata purezza (OD 260/280&gt; 1,80) privo di endotossine DNA plasmidico ad una concentrazione finale di 1-2 mg / mLcon endotossine liberare tampone Tris-EDTA o PBS. Si consiglia di aggiungere 0,1% Verde veloce per la soluzione di DNA (il colorante si diffonda nel ventricolo quando iniettato con successo). </li><li> Preparare gli elettrodi 5-7 mm, il gel dell&#39;elettrodo e riscaldare il rilievo di riscaldamento. </li></ol> 1.2. Elettroporazione <ol><li> Rimuovere un postnatale giorno 2 del mouse cuccioli da gabbia e anestetizzare che per inalazione isoflurano (in un flusso di ~ 0,6 L / min). </li><li> Dopo circa 1 min, determinare lo stato di anestesia utilizzata la risposta piede pinch. Se si verifica nessun movimento, procedere con l&#39;iniezione intraventricolare. </li><li> Caricare ago capillare con 1-2 ml di DNA utilizzando un tubo aspiratore collegato al capillare. </li><li> Sotto una sorgente di luce fredda, tenere la testa del cucciolo tra il pollice e l&#39;indice della mano meno dominante. Leggermente tirare indietro la pelle sulla testa per aiutare l&#39;identificazione del punto di iniezione di destra. </li><li> Si consideri una linea virtuale tra l&#39;occhio e tegli craniometrico punto di riferimento lambda (Figura 1A). Inserire l&#39;ago capillare a circa un terzo della lunghezza di questa linea dalla lambda (circa 1 mm dal punto centrale linea 15). Inserire il capillare circa 2 mm di profondità, avendo cura di evitare la penetrazione in profondità nel cervello. </li><li> Iniettare plasmide soffiando lentamente attraverso la bocca (una siringa collegata al capillare può anche essere utilizzato). Durante questa procedura, assicurarsi che le dita non stanno applicando troppa pressione sul cervello, in quanto questo può impedire iniezione plasmide successo. </li><li> Arrestare iniezione quando una quantità minima di soluzione di DNA viene lasciato nel capillare. E &#39;opportuno iniettare meno di 1 ml per evitare deleterio aumento della pressione intracranica. </li><li> Coat entrambi gli elettrodi con gel e posizionarle con il lato positivo sul lato laterale dell&#39;emisfero in cui il DNA è stato iniettato (Figura 1A). Per l&#39;incorporazione nel DNA rostrale SVZ, posto gli elettrodi leggermente rostrale alpunto di iniezione. Variando la posizione degli elettrodi può raggiungere specificità regionale di elettroporazione in diverse aree del SVZ 22,25. </li><li> Avviare il trasferimento corrente premendo il pedale del pedale a impulsi. Quando l&#39;elettroporazione è completa, controllare la tensione sul display elettroporatore (valori di tensione non deve essere inferiore a 90 V, in quanto i valori di tensione più bassa correlazione con scarsa efficienza elettroporazione). </li><li> Rianimare il cucciolo sotto ossigeno a rilievo di riscaldamento per un paio di minuti e tornare alla gabbia, mettendo lontano dalla madre. Assicurarsi che la madre recupera il cucciolo e si riunisce con il resto della cucciolata. Dopo l&#39;elettroporazione, lasciare i cuccioli con la madre per 4-7 giorni prima di passo successivo. </li></ol> 2. Preparazione delle Culture acuta del cervello Slice 2.1. Preparazione di soluzioni e strumenti <ol><li> Le seguenti soluzioni sono richiesti (è anche possibile utilizzare DMEM ad alto glucosio per dissezione e l&#39;imaging17): Dissection Medium (500 ml) Supporti Balanced Gey - 500ml 45% di glucosio - 5ml Movie Medio (10 ml) 45% di glucosio - 0,110 ml HEPES 1 M - 0.100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutammina - 0.200 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (fenolo libero-rosso) - 8,89 ml </li><li> Warm up medio di film a 37 ° C. </li><li> Posizionare Millicell inserisce in un piatto di coltura inferiore 35 millimetri di vetro contenente 1 ml di terreno di film e posto in un incubatore umidificato a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Preparare vibratome accessori (cacciavite, camera, lame di rasoio, colla). </li><li> Preparare strumenti di dissezione: forbici, spatola, pinze diritte. </li><li> Preparare gli strumenti per la gestione fette: piccolo pennello morbido o un&#39;ansa da inoculo (dimensioni: 10 ml), pipette Pasteur di plastica, un contenitore di ghiaccio e vari piatti di plastica 6 centimetri. </li><li> Preraffreddare il mezzo dissezionea 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Preparazione del cervello fette <ol><li> Riempire un piatto di 6 centimetri con mezzo dissezione preraffreddata e posizionarlo sul ghiaccio (per mantenere fette appena tagliate). </li><li> A seguito di dislocazione cervicale, usare le forbici per decapitare il cucciolo mouse. Rimuovere il cuoio capelluto con un bisturi, tagliare il cranio, lungo la sutura sagittale dalla OB al cervelletto e rimuovere delicatamente i lembi cranici con pinze. Assicurarsi che l&#39;intero cervello è esposto e con attenzione sezionare fuori con una spatola, facendo particolare attenzione a non danneggiare il tessuto. La dissezione deve essere fatto con attenzione, ma allo stesso tempo molto velocemente (meno di un minuto, se possibile). Dislocazione cervicale è il nostro metodo preferito perché anestesia terminali con anestetici farmaci / gas possono influenzare le proprietà migratorie dei neuroblasti e lo stato di salute del cervello fetta culture, che devono essere ripreso in tempi relativamente brevi seguente sacrificio di animali. </li><li> Hemisect il cervello con un razo lama (Figura 2). Eliminare emisfero non iniettato o utilizzare per altri esperimenti. </li><li> Posizionare un pezzo di nastro sul supporto vibratome e utilizzare la quantità minima necessaria di colla per attaccare l&#39;emisfero cerebrale su di esso (Figura 2). Questo impedisce danneggiamento della superficie titolare causa di colla applicazioni ripetute. </li><li> Lasciate asciugare la colla per alcuni secondi. </li><li> Collocare supporto nel vassoio vibratome riempito con una soluzione di dissezione preraffreddata. Puntare il bulbo olfattivo verso la lama (Figura 2). </li><li> Iniziare a tagliare l&#39;emisfero cerebrale utilizzando le impostazioni appropriate. I seguenti parametri sono raccomandati: spessore di strato di 300 micron; velocità ~ 3-5; frequenza ~ 9. Alta frequenza e bassa velocità sono raccomandati per prevenire danni alla fetta. </li><li> Raccogliere le fette con un piccolo pennello o un un&#39;ansa da inoculo morbido. Tenere le fette solo con OB visibile (solitamente 2-3 fette / cervello). In genere, la fetta che contiene la maggior parte delle RMS can disponibile sul ~ 300 micron dalla superficie inferiore. </li><li> Controllare le fette sotto un microscopio a fluorescenza standard per il segnale GFP (avendo cura di capovolgere su di loro per controllare la fluorescenza su entrambi i lati), e scegliere quelle che mostrano fluorescenza lungo la maggior parte delle RMS. </li></ol> 2.3. Coltura Fette cervello <ol><li> In una cappa di coltura cellulare, tagliare via il terzo più caudale della fetta cervello e rimuovere eventuali tracce di colla con una pinzetta diritte sottili o un bisturi microdissezione. </li><li> Delicatamente aspirare la fetta con una pipetta Pasteur di plastica (tagliata la punta della pipetta per creare un&#39;apertura più grande, questo eviterà di danneggiare la fetta) e collocarlo al centro di un Millicell preriscaldata inserto. </li><li> Assicurarsi che il lato con il segnale fluorescente luminosa viene posta in contatto con il Millicell inserto (per l&#39;imaging con un microscopio invertito). </li><li> Rimuovere la soluzione dissezione eccesso sulla sommità dell&#39;inserto con una pipetta. </li><li> Lasciare culture fetta distabilirsi in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno per 1 ora prima di imaging. </li></ol> 3. Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti <ol><li> Almeno 2 ore prima di imaging, accendere il sistema Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocale filatura, invertito microscopio Nikon Ti-E, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) raffreddato CCD digitale, e il sistema di riscaldamento (Solent Scientific) impostato in costante temperatura di 37 ° C. </li><li> Aprire il modulo di acquisizione software Volocity e fare clic sul pulsante &quot;Viz&quot; e selezionare il laser (s) per l&#39;imaging. </li><li> Entro 2 ore di cervello preparazione fetta, mettere il piatto fondo di vetro contenente la fetta cervello nella camera di imaging sul palco microscopio. </li><li> Utilizzare un obiettivo Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 sotto la luce fluorescente appropriato per selezionare e mettere a fuoco l&#39;area della sezione che verrà ripreso (ad esempio, la prima parte discendente della RMS subito dopo il sito di iniezione, o l&#39;Elbow regione RMS, o subito dopo il gomito prima di neuroblasti entrare nel OB). </li><li> Impostare il time-lapse imaging con le seguenti azioni: <ol><li> Al microscopio, fare clic sul pulsante L100 per consentire la scansione laser del campione. </li><li> In Volocity, aprire la ULTRAVIEW Laser Changer selezionando il laser appropriato (ad esempio 488 nm laser per GFP). </li><li> Impostare il tempo di esposizione (di solito tra 100-500 msec) e l&#39;intensità del laser (di solito 20-30%) a seconda dell&#39;intensità del segnale fluorescente. </li><li> Regolare l&#39;immagine guadagno digitale per migliorare la visualizzazione delle cellule. </li><li> Selezionare l&#39;intervallo di z-stack per l&#39;immagine all&#39;interno della fetta cervello (di solito nel corso di un intervallo di 100-120 micron). Scegliere un intervallo con un adeguato numero di cellule isolate per evitare possibili sovrapposizioni il più possibile (questo faciliterà la successiva analisi di inseguimento). </li><li> Selezionare la spaziatura tra ogni immagine z-stack (di solito 2-4 micron). </li><li> Scegliere il tempo di interval tra ogni cattura z-stack (ad esempio 3 min) e la durata totale di imaging (ad esempio 3 ore). </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Salva&quot; per salvare le modifiche ai parametri di imaging. </li><li> Premere il pulsante di registrazione per iniziare imaging. </li></ol></li><li> Immagini alternate di campioni di controllo e sperimentali (per esempio veicolo / trattamento farmacologico o diversi plasmidi elettroporate) durante lo stesso giorno. </li></ol> 4. Analizzando neuroblasti migrazione <ol><li> Nel modulo Volocity Quantitation, aprire la libreria desiderata creato dopo aver completato un esperimento di time-lapse. Selezionare &quot;Focus avanzata&quot; dalla casella in alto a sinistra (Figura 4A, punto 1). </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;di misure&quot; per visualizzare la finestra di misura (Figura 4A, punto 2). </li><li> Un elenco di attività è visibile in basso a sinistra dello schermo. Trascinare &quot;Track&quot; (presente nella sezione &quot;Varie&quot; voce in fondol&#39;elenco) nello spazio sopra. Questo richiederà l&#39;apertura di una nuova finestra chiamata &quot;Track&quot; nella parte superiore sinistra della schermata (Figura 4A, punto 3). </li><li> Selezionare &quot;Punti&quot; dal tab &quot;Input&quot; nella finestra Track (Figura 4A, punto 4). </li><li> Fai clic sullo strumento Point (4A, punto 5). </li><li> Iniziare a monitorare la migrazione di neuroblasti cliccando con il mouse sulla zona centrale del corpo cellulare e tenere traccia il movimento delle cellule fino all&#39;ultimo punto ora del time-lapse viene raggiunta (ad esempio il punto numero 61 per un film di 3 ore lungo) . </li><li> Per ottenere dati scegliete &quot;Make Voce di misura&quot; dal menu Misure (Figura 4B, punti 6-7). Apparirà una finestra al centro dello schermo. </li><li> In questa finestra, selezionare &quot;Un nuovo elemento di misura denominata:&quot; e digitare un nome (Figura 4C, punto 8). Ricordate di selezionare l&#39;opzione &quot;tutti i momenti&quot; prima pressing OK (Figura 4C, punto 9). Un file oggetto di misurazione apparirà sotto il time-lapse e conterrà i parametri di analisi quantitativa (ad esempio la distanza di migrazione, velocità, spostamento e velocità di spostamento). </li><li> Fare doppio clic sul file elemento di misurazione per aprirlo come una finestra (Figura 4D, punto 10). </li><li> Per visualizzare le singole tracce di cellule analizzate, scegliere &quot;cingolati Point&quot; dalle opzioni del &quot;Display&quot; (Figura 4D, passo 11). </li><li> Fare clic destro sul file Misura Item ed esportarlo come file di testo, che può essere importato in programmi come Excel per analizzare i parametri di migrazione. </li><li> Per misurare movimenti tra fotogrammi consecutivi e pause effettuate da ciascun cellulare durante il periodo di riprese, nel file di misura Item selezionare tra le opzioni &quot;Display&quot;, &quot;Point&quot; o &quot;popolazioni&quot; e clicca su ID (ogni brano ha un ID univoco). Esportare il file risultante da procederezione come spiegato al punto 4.10. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Migrazione efficiente di progenitori neurali lungo le RMS garantisce la loro successiva maturazione in neuroni funzionali 10. Flussi importanti di progenitori neurali diretti verso l&#39;OB sono visibili nella prima infanzia umana e possono svolgere un ruolo importante nei primi mesi del postnatale sviluppo del cervello umano 27. Inoltre, queste cellule sono in grado di siti del cervello colpite da lesioni e neurodegenerazione 4,28 bersaglio. Essere in grado di monitorare in tempo reale ...

Nel cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica dopo la nascita principalmente in due regioni, la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare nel giro dentato dell&#39;ippocampo 1. Notevole prove raccolte negli ultimi anni sostiene un ruolo fondamentale per la neurogenesi postnatale in funzioni di memoria lampadina ippocampo e olfattive 1-3. È importante sottolineare che la neurogenesi postnatale detiene anche potenziale terapeutico a causa della sua relazione con malattie neurologiche degenerative, e la capacità di neuroblasti di migrare verso siti danneggiati nel cervello 4-6. La zona subventricolare (SVZ) ha recentemente emerso come una nicchia neurogena cruciale. Neuroblasti SVZ-derivati ​​migrano verso il bulbo olfattivo (OB) attraverso il flusso migratorio rostrale (RMS), rendendo questo il processo di migrazione più lunga del 1,7,8 cervello postnatale. Il / RMS / sistema OB mammiferi SVZ è diventato unmodello utile per studiare varie fasi neurogenesi, quali la proliferazione, migrazione e differenziazione 1,8. Molti fattori di crescita e segnali extracellulari regolano la neurogenesi SVZ e la migrazione lungo le RMS, ma i meccanismi molecolari intracellulari sono ben lungi dall&#39;essere pienamente compreso 1,9. La corretta migrazione lungo le RMS è di fondamentale importanza per la successiva maturazione dei neuroni neonati 10. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che neuroblasts SVZ-derivate possono uscire dalle RMS a siti lesioni cerebrali 4-6,11-13. Così, indagando la migrazione neuroblasti meccanismi di segnalazione di regolazione è fondamentale non solo per capire neurogenesi, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per etichettare progenitori neurali SVZ da elettroporazione in vivo postnatale e monitorare la loro migrazione lungo le RMS culture acuti fetta cervello usando time-lapse confocale disco rotante microscopy. L&#39;elettroporazione è ampiamente usato in studi sullo sviluppo embrionale da a stadi adulti 14-18. Si tratta di un potente strumento per indirizzare e manipolare progenitori neurali SVZ e rappresenta un&#39;alternativa più economica e molto più veloce di iniezione stereotassica di vettori virali o generazione di modelli transgenici 1,15,19,20. Si tratta di una procedura relativamente semplice che non richiede l&#39;intervento chirurgico e ha alti tassi di sopravvivenza. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprimono plasmidi in modelli genetici di topo che impiegano il sistema loxP può essere utilizzato per indirizzare i geni di interesse o per ottenere l&#39;etichettatura permanente dei progenitori SVZ, rappresentando così uno strumento utile per gli studi di neurogenesi adulta 21,22. Imaging RMS migrazione neuroblasti nel cervello intatto è ancora difficile a causa di limitazioni tecniche. Tuttavia, questo processo può essere monitorato tramite disco confocale spinning time-lapse microscopia di fette di cervello acuto, che forniscono un adeguato system molto simili alla condizione in vivo anche suscettibili di manipolazione farmacologica 23,24. Accoppiamento elettroporazione in vivo postnatale con time-lapse imaging faciliterà la comprensione dei meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppo di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Piatto di coltura con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Terreni bilanciati Gey's</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio, 45%</td><td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pen/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplemento</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (senza rosso fenolo)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro per iniezione</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspiratore</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore capillare Sutter P-97</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Elettroporatore a onda quadra</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta in platino 7 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Interruttore a pedale Modello 1250F</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Gel per elettrodi</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Colla</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX sistema di dischi rotanti</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Configurazione personalizzata (è possibile utilizzare più sorgenti laser) dotata di telecamera CCD Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B</td></tr><tr><td>Software Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Moduli di acquisizione, quantificazione e visualizzazione Camera</td></tr><tr><td>ambientale per microscopia</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>invertito Ti-E</td> su misura <td>Nikon</td><td></td><td>L'obiettivo CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA è consigliato per l'applicazione descritta in questo documento</td></tr></tbody></table>

in vivo postnatale elettroporazione e time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta fette cervello

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

La zona subventricolare (SVZ) è uno dei principali nicchie neurogenici nel cervello postnatale. Qui, progenitori neurali proliferano e danno luogo a neuroblasti in grado di muoversi lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB). È necessaria Questa migrazione a lunga distanza per la successiva maturazione dei nuovi neuroni nel OB, ma i meccanismi molecolari che regolano questo processo sono ancora poco chiare. Indagare le vie di segnalazione che controllano la motilità neuroblast può aiutare non solo a capire un passo fondamentale nella neurogenesi, ma hanno anche terapeutico potenziale rigenerativo, data la capacità di questi neuroblasti per indirizzare siti cerebrali colpite da lesioni, ictus, o la degenerazione. In questo manoscritto si descrive un protocollo dettagliato per l&#39;elettroporazione in vivo postnatale e conseguente time-lapse imaging della migrazione neuroblasti nelle RMS del mouse. Elettroporazione postnatale può efficacemente transfect SVZ progenitorecellule, che a loro volta generano neuroblasti migrano lungo le RMS. Utilizzando la microscopia confocale spinning disk time-lapse sulle culture acuti fetta cervello, la migrazione neuroblasti può essere monitorato in un ambiente molto simili alla condizione in vivo. Inoltre, neuroblast motilità possono essere monitorati e analizzati quantitativamente. Come esempio, si descrive come utilizzare in vivo postnatale elettroporazione di un plasmide GFP che esprimono per etichettare e visualizzare neuroblasti migrano lungo le RMS. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprime plasmidi in topi knockout condizionali che impiegano il sistema loxP può anche essere utilizzato per geni di interesse bersaglio. Manipolazione farmacologica di culture acute fetta cervello può essere eseguita per studiare il ruolo di molecole di segnalazione diverse nella migrazione neuroblasti. Accoppiando in elettroporazione in vivo con time-lapse imaging, speriamo di comprendere i meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppozione di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.

Etichettatura dei neuroblasti migratori SVZ-derivati ​​può essere osservato lungo le RMS, di solito 4-8 giorni dopo il elettroporazione di successo (Figura 1B). Punti di tempo più lunghi possono anche essere scelti, ma meno cellule si trovano nelle RMS poiché la maggior parte di loro sono entrati nel OB. Neuroblasti cominciare ad acquisire tipica morfologia e le caratteristiche di cellule granulari mature nella OB intorno 2-3 settimane dopo l&#39;elettroporazione (non mostrato). Dopo coltura per ~ 1 ora...

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l&#39;etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l&#39;analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e analizzare la migrazione di Neuroblast lungo il flusso migratorio rostrale nel cervello del topo postnatale. Ciò è ottenuto dal primo elettroporo, un plasmide di DNA ENC che riveste la proteina fluorescente verde nel ventricolo laterale del topo pops. Il secondo passo è preparare fette di cervello dai topi elettroporati.Successivamente, le fette con il miglior segnale GFP vengono selezionate per la coltura. La fase finale è l'imaging time-lapse delle fette di cervello contenenti il neuroblasto migratorio marcato GFP utilizzando un microscopio confocale a disco rotante. In definitiva, i filmati time-lapse vengono utilizzati per il tracciamento cellulare e l'analisi quantitativa della migrazione dei neuroblasti.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi, come ad esempio come il movimento dei neuroblasti derivati dalle cellule staminali sia guidato e regolato nel cervello postnatale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la somministrazione di vettori virali è che è più facile, più economica e richiede meno tempo. Inoltre, consente una marcatura sparsa dei neuroblasti, consentendo quindi un'analisi dettagliata delle loro dinamiche di migrazione.Iniziare questa procedura impostando la tensione dell'elettroporato su cinque impulsi quadrati, 50 millisecondi per impulso a 100 volt con intervalli di 850 millisecondi. Quindi caricare un ago capillare con uno o due microlitri di DNA utilizzando un tubo aspiratore collegato al capillare. Successivamente, rimuovere un cucciolo di topo postnatale del secondo giorno dalla gabbia e anestetizzarlo mediante inalazione di fluoro.Dopodiché, tieni la testa del cucciolo tra il pollice e l'indice della tua mano meno dominante. Tirare leggermente indietro la pelle sulla testa per facilitare l'identificazione del punto di iniezione corretto. Si consideri una linea virtuale tra l'occhio e il punto di riferimento metrico del cranio Lambda.Quindi inserire l'ago capillare a circa un terzo della lunghezza di questa linea dalla Lambda a circa due millimetri di profondità dopo, iniettare il plasmide soffiando lentamente attraverso la bocca. Durante questa procedura, assicurati che le dita non esercitino troppa pressione sul cervello. Interrompere l'iniezione quando nel capillare rimane una quantità minima di soluzione di DNA.Quindi rivestire entrambi gli elettrodi con gel e posizionarli con il lato positivo sul lato laterale dell'emisfero dove è stato iniettato il DNA. Per l'incorporazione del DNA nella SVZ rostrale, posizionare gli elettrodi leggermente rostrali rispetto al punto di iniezione. Quindi, avviare il trasferimento di corrente premendo il pedale dell'interruttore a pedale a impulsi.Quindi rimuovere il gel dalla testa del cucciolo, rianimare il cucciolo con l'ossigeno su un termoforo per alcuni minuti. Successivamente, rimettilo nella gabbia e posizionalo lontano dalla madre. Assicurati che la madre recuperi il cucciolo e lo riunisca con il resto della cucciolata.In questa procedura posizionare gli inserti di millicellule in un piatto di coltura con fondo di vetro da 35 millimetri contenente un millilitro di terreno di coltura. Quindi posizionare il piatto di coltura in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo aver decapitato il cucciolo di topo, rimuovere il cuoio capelluto con un bisturi.Quindi, taglia il cranio lungo la sutura sagittale media dal cervelletto al bulbo olfattivo. Praticare alcuni tagli trasversali aggiuntivi sul cranio e rimuovere delicatamente i lembi cranici utilizzando una pinza. Assicurati che l'intero cervello sia esposto e sezionalo con cura usando una spatola, prestando particolare attenzione a non danneggiare il tessuto.Dopo di che l'emite seziona il cervello con una lama di rasoio e scarta l'emisfero non iniettato. Successivamente posizionare un piccolo pezzo di nastro adesivo sul supporto vibram. Usa la quantità minima di colla necessaria per attaccare l'emisfero cerebrale su di esso.Inizia a tagliare l'emisfero cerebrale a fette di 300 micron. Quindi raccogliere le fette usando un pennello piccolo o un anello di inoculazione morbido. Successivamente, controlla entrambi i lati delle fette sotto un microscopio fluorescente standard per il segnale GFP e scegli quelli che mostrano una fluorescenza brillante lungo la maggior parte del flusso migratorio rostrale.In un cappuccio di autocoltura, taglia via il terzo più coccoloso della fetta di cervello e rimuovi eventuali tracce di colla. Quindi, aspirare la fetta utilizzando una pipetta di plastica e posizionarla al centro di un inserto di millicellule preriscaldato. Rimuovere la soluzione di dissezione in eccesso sulla parte superiore dell'inserto con una pipetta Gilson.Quindi lasciare riposare le colture di fette in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per almeno un'ora. Prima dell'imaging entro due ore dalla preparazione della fetta di cervello. Posizionare il piatto inferiore di vetro contenente la fetta di cervello nella camera di imaging sul tavolino del microscopio.Quindi, utilizzare un obiettivo 20 x 0,45 sotto la luce fluorescente appropriata per selezionare e mettere a fuoco l'area della fetta che verrà ripresa. Per impostare l'imaging time-lapse sul microscopio, fare clic sul pulsante L 100 per consentire la scansione laser del campione. Successivamente, in termini di velocità, apri il cambia laser ultra view selezionando il laser appropriato.Impostare il guadagno del tempo di esposizione e l'intensità del laser. Quindi seleziona l'intervallo Zack per l'immagine all'interno del cervello. Successivamente, seleziona la spaziatura tra ciascuna immagine dello stack ZS.Scegli l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione dello stack ZS e la durata totale dell'imaging. Quindi fare clic sull'icona di salvataggio per salvare le modifiche ai parametri di imaging. Al termine, premere il pulsante di registrazione per avviare l'imaging nel modulo di quantificazione della velocità.Aprire la libreria desiderata creata. Dopo aver completato un esperimento time-lapse, seleziona la messa a fuoco estesa dalla casella in alto a sinistra. Fare clic sulla scheda delle misure per visualizzare la finestra delle misurazioni.Un elenco di attività è visibile in basso a sinistra dello schermo. Trascina la traccia sullo spazio sopra. Questo richiederà l'apertura di una nuova finestra chiamata traccia.Nella sezione in alto a sinistra dello schermo, selezionare i punti dalla scheda di input nella finestra della traccia. Fare clic sullo strumento punto, fare clic sulla scheda degli strumenti e selezionare manualmente l'opzione Traccia oggetti, verrà visualizzata una finestra per consentire all'operatore di iniziare a tracciare le celle. Inizia a seguire il neuroblasto in migrazione facendo clic con il mouse sull'area centrale del corpo cellulare e continua a seguire il movimento della cellula fino a raggiungere l'ultimo punto temporale del lasso di tempo.Per ottenere i dati, scegliere Crea elemento di misurazione. Dal menu delle misure, apparirà una finestra al centro dello schermo. In questa finestra, selezionare un nuovo elemento di misura denominato e digitare un nome per un elemento di misura.Il file contenente i parametri per l'analisi quantitativa apparirà sotto il file time-lapse. Fare doppio clic su questo file di elementi di misura per aprirlo come finestra per visualizzare le singole tracce delle celle analizzate. Scegliere il punto tracciato dalle opzioni di visualizzazione e selezionare le celle che devono essere visualizzate per il loro percorso migratorio.Per analizzare i parametri di migrazione, fare clic con il pulsante destro del mouse sul file dell'elemento di misura ed esportarlo come file di testo, che può quindi essere importato in programmi come Excel. Queste sono le immagini time-lapse del disco rotante di neuroblasti prelevate da una fetta di cervello sagittale di topo. Cinque giorni dopo l'elettroporazione di A GFP, le immagini plasmidiche esprimono sono a un'ora di distanza.Ogni pannello è una proiezione di Zack di 28 immagini consecutive a quattro micron di distanza. Le punte delle frecce indicano quattro neuroblasti rappresentativi che migrano lungo il RMS verso il bulbo olfattivo. Questi sono i percorsi migratori rappresentativi ottenuti dall'imaging time-lapse di quattro neuroblasti.Questo grafico mostra la distanza migrata con il tempo di due neuroblasti rappresentativi. Queste cellule mostrano un tipico comportamento mobile saltatorio. Questo filmato mostra una sezione del mouse RMS con GFP etichettato in migrazione.Neuroblasto ottenuto cinque giorni dopo l'elettroporazione del plasmide che esprime A GFP. Il bulbo olfattivo si trova fuori dalla vista verso l'angolo in basso a destra. Le pile Z confocali sono state catturate su un disco rotante confocale.Con un obiettivo 20 x ogni tre minuti per tre ore su un intervallo di 120 micron, la velocità di riproduzione è di 10 fotogrammi al secondo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di praticare l'elettroporazione prima di iniziare gli esperimenti e anche di preparare con cura le colture acute di fette di cervello nel più breve tempo possibile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e analizzare la migrazione dei neuroblasti nel cervello del topo postnatale.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Imaging confocale di neuroni in migrazione in una coltura di fette organotipiche del cervello embrionale di topo utilizzando In Utero Elettroporazione. J. Vis. Exp. (2017) Questo video mostra la microscopia confocale time-lapse per osservare la migrazione radiale del neurone corticale dalla zona subventricolare alla placca corticale tramite scaffold gliali radiali in fette di cervello embrionale di topo trasdotte.

Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Migrazione neuroblasti è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti impiegando DNA / piccolo tornante RNA (shRNA) nucleofection e un saggio di migrazione 3D con neuroblasti isolati dal flusso migratorio rostrale roditore postnatale.

Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em&gt; In vitro</em

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

Scopri l'elettroporazione postnatale in vivo e l'imaging time-lapse per studiare la migrazione dei neuroblasti nel cervello di topo. Questo metodo consente l'analisi quantitativa della dinamica cellulare in tempo reale.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

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