Picoinjection di Microfluidic Gocce senza elettrodi in metallo
18 aprile 2014
Abbiamo sviluppato una tecnica per picoinjecting gocce microfluidici che non richiedono elettrodi metallici. Come tale, dispositivi che incorporano la nostra tecnica sono più semplici da fabbricare e da usare.
L'obiettivo generale di questa procedura è progettare, realizzare e utilizzare chip microfluidici in grado di iniettare con precisione e in modo controllato reagenti in goccioline di acqua in olio, un processo noto come iniezione pico. Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando un dispositivo con un canale per l'emulsione che si restringe fino a un diametro inferiore a quello delle goccioline sferiche, posizionandole in modo uniforme all'interno di un olio inerte di trasporto. Come secondo passaggio, le goccioline di acqua e di olio vengono introdotte nel dispositivo e convogliate al sito di iniezione.
Un canale perpendicolare contenente i reagenti da iniettare. Successivamente, viene applicata una tensione elevata al fluido di iniezione mentre le gocce passano dal sito di iniezione, al fine di far fondere le gocce con il fluido di iniezione. I risultati ottenuti mostrano che, regolando l'ampiezza della tensione applicata, il volume del reagente iniettato può essere controllato con precisione a risoluzioni di picolitri. Questa tecnica è nata dalla necessità di semplificare la fabbricazione dei nostri dispositivi, eliminando la necessità di elettrodi metallici.
I vantaggi rispetto alle tecniche esistenti, come la facilità e la semplicità nella progettazione, realizzazione e utilizzo del dispositivo, sono notevoli. Gli elettrodi metallici utilizzati nei metodi precedenti sono soggetti a rottura e sensibili a polvere e detriti nei canali durante la fabbricazione. Eliminando gli elettrodi, abbiamo reso i nostri dispositivi più robusti e migliorato l'efficienza della fabbricazione. Il primo passo consiste nel progettare un chip microfluidico in base alle esigenze dell'esperimento.
Utilizzare un software di progettazione assistita da computer per poter sfruttare successivamente tecniche di fotolitografia. Questa progettazione del chip presenta canali per emulsioni più piccoli delle goccioline sferiche da utilizzare, consentendo una pico-iniezione più efficace. Il sito di pico-iniezione si basa su un design reperibile in letteratura, dal quale sono stati rimossi gli elettrodi metallici.
Canali aggiuntivi fungono da fossa di Faraday per schermare le gocce a monte dal campo elettrico. Una volta completata la progettazione, utilizzare tecniche di litografia con fotopolimeri morbidi per fabbricare i dispositivi, quindi incollarli su un vetrino per microscopio in vetro con il dispositivo pronto all'uso. Preparare una pompa di controllo della pressione dell'aria per pressurizzare un serbatoio contenente fluido.
Eseguire questa operazione modificando l'uscita della pompa in modo che l'aria pressurizzata fuoriesca attraverso un tratto di tubo in polietilene con un diametro interno di 2,7 millimetri. Terminare il tubo collegandolo sull'attacco posteriore della punta di una siringa. Dopo aver sigillato lo spazio tra la siringa e il tubo con resina epossidica, fissare un ago di calibro 27,5 utilizzando reagenti appropriati all'esperimento.
Preparare un'emulsione uniforme di goccioline acquose sospese in olio vettore. Caricare l'emulsione in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 27,5 gauge. Quindi fissare la siringa a una pompa per siringhe e orientarla con l'ago rivolto verso l'alto.
Il passo successivo consiste nel preparare i reagenti da introdurre nel dispositivo microfluidico e nei relativi serbatoi. Utilizzare un tubo da centrifuga da 15 millilitri con tappo. Con una punta da biopsia o un altro strumento adeguato, praticare tre fori di 0,5 millimetri nel tappo.
Preparare un elettrodo di filo metallico con un diametro di 0,5 millimetri e una lunghezza di alcuni centimetri superiore a quella della provetta per centrifuga. Inserire questo elettrodo in uno dei fori del tappo. Assicurarsi che raggiunga il fondo della provetta e sporga di alcuni centimetri oltre la parte superiore.
Successivamente, preparare un tratto di tubo in polietilene lungo circa 20 centimetri. Inserire questo in un secondo foro. Anche in questo caso, deve raggiungere il fondo del tubo nel foro rimanente.
Infilare circa 2,5 centimetri di tubo in polietilene. Questo tubo sarà posizionato al di sopra del livello del liquido. Applicare un epossidico indurente ai raggi UV per sigillare le fessure sulla parte superiore del cappuccio.
Al termine della polimerizzazione, riempire il tubo con il fluido desiderato per l'iniezione pico, in questo caso cloruro di sodio 100 millimolare, e avvitare il cappuccio. Collegare l'uscita della pompa di controllo della pressione dell'aria al tratto più corto di tubo presente nel cappuccio. Inserendo l'ago nella luz, l'ago dovrebbe adattarsi perfettamente.
Posizionare il tubo del centrifuga nel suo supporto. Procedere riempiendo una siringa da un millilitro con cloruro di sodio uno molare. Per fungere da liquido per il fossato di Faraday, collegare un ago da 27,5 gauge e fissare la siringa su una pompa per siringhe.
Riempire un'altra siringa da un millilitro con olio distanziatore inerte. Collegare un ago da 27,5 gauge e fissarlo a una pompa per siringhe. A questo punto, è possibile effettuare i collegamenti al chip microfluidico.
Per prima cosa, assicurarsi che il chip sia fissato su una superficie piana. Successivamente, portare l'estremità aperta del tubo lungo contenente il fluido di iniezione fino al chip. Collegare questo tubo al porto di ingresso del fluido di iniezione pico sul chip microfluidico.
Quindi collegare un tubo in polietilene alla siringa contenente cloruro di sodio ed estenderlo fino al chip. Collegarlo alla porta di ingresso per il fossato di Faraday. Inoltre, utilizzare un tubo per collegare la siringa contenente l'olio veicolante alla relativa porta di ingresso sul dispositivo.
Terminare un tubo proveniente dalla porta di uscita dell'emulsione in un contenitore di raccolta. Infine, utilizzare dei tubi per collegare la porta di uscita della vasca di Faraday a un contenitore isolato elettricamente non conduttivo. Alla fine, il chip microfluidico appare in questo modo.
Ora prendere un filo dalla massa di un amplificatore ad alta tensione ed estenderlo fino all'ago della siringa contenente cloruro di sodio. Utilizzare una clip a coccodrillo per fissare il filo all'ago. Estendere un altro filo dall'uscita ad alta tensione dell'amplificatore all'elettrodo immerso nel fluido di iniezione pico.
Utilizzare un morsetto a coccodrillo per effettuare il collegamento come ingresso all'amplificatore. Utilizzare l'uscita del computer di un generatore di forme d'onda controllato da software. Iniziare l'infusione nel sistema introducendo il fluido Faraday di cloruro di sodio uno molare nel dispositivo a 100 microlitri all'ora.
In seguito, avviare il flusso della soluzione madre, dell'emulsione e dell'olio veicolante in modo che le goccioline attraversino il pico iniettore a intervalli regolari, separati da un tratto di olio veicolante. Regolare la pressione applicata al liquido di pico iniezione in modo che il liquido sporga dall'orifizio di pico iniezione nel canale delle goccioline, senza staccarsi e formare gocce proprie. Utilizzare il generatore di forme d'onda per produrre un segnale in corrente alternata di 10 chilohertz con un'ampiezza compresa tra 0 e 10 volt, da amplificare mille volte mediante l'amplificatore ad alta tensione.
Per ottenere l'iniezione pico, applicare questo segnale alle goccioline mentre passano attraverso l'orifizio di iniezione e utilizzare l'ampiezza come parametro. Questo filmato mostra l'iniezione selettiva delle goccioline in base alla presenza di un colorante fluorescente.
In questo caso, 200 gocce al secondo sono passate attraverso l'iniettore, ma velocità fino a 10.000 al secondo sono possibili con un adeguato meccanismo di rilevamento delle gocce. Questi dati mostrano la frazione di volume iniettato in funzione della tensione applicata per diversi fluidi iniettati di diversa molarità. Si ritiene che tensioni più elevate causino un'inizio anticipato della coalescenza, portando a durate e volumi di iniezione maggiori.
Questa mappa termica bidimensionale mostra la relazione tra la molarità della soluzione ionica e la tensione necessaria per ottenere volumi di iniezione. Le soluzioni a molarità più bassa richiedono tensioni più elevate poiché riducono più facilmente il campo elettrico nel sito di iniezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e realizzare rapidamente e in modo robusto dispositivi microfluidici che consentano l'iniezione precisa e controllabile di reagenti nelle tue gocce.
Ricordare che lavorare con alta tensione può essere estremamente pericoloso; è sempre necessario adottare precauzioni come un corretto collegamento a terra, l'uso di dispositivi di protezione individuale e sistemi di sicurezza integrati.
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Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnica per la picoiniezione in gocce microfluidiche senza l'uso di elettrodi metallici, semplificando la fabbricazione e il funzionamento del dispositivo. Il metodo consente un controllo preciso dell'inalazione dei reagenti nelle gocce, aumentando l'utilità dei chip microfluidici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microfluidica
- Iniezione di reagenti
- Fabbricazione di dispositivi
Sfondo
- I chip microfluidici sono essenziali per varie applicazioni biochimiche.
- I metodi tradizionali richiedono spesso sistemi elettrodici complessi.
- È necessario sviluppare tecniche di iniezione più semplici ed efficienti.
- L'iniezione pico consente un controllo preciso dei volumi dei reagenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica per l'iniezione di reagenti in goccioline microfluidiche.
- Eliminare la necessità di elettrodi metallici nella progettazione del dispositivo.
- Raggiungere un controllo preciso sul volume dei reagenti iniettati.
Metodi Utilizzati
- Progettare un canale per emulsioni che si restringe sotto il diametro delle goccioline.
- Introdurre goccioline di acqua e olio nel dispositivo microfluidico.
- Applicare una tensione elevata per fondere le goccioline con il fluido di iniezione.
- Regolare la tensione per controllare il volume dei reagenti iniettati con risoluzione di picolitri.
Risultati principali
- La tecnica unisce con successo le gocce con il fluido di iniezione.
- I volumi dei reagenti possono essere controllati con elevata precisione.
- L'assenza di elettrodi metallici semplifica la fabbricazione del dispositivo.
- I risultati dimostrano l'efficacia del nuovo metodo di iniezione.
Conclusioni
- La tecnica sviluppata migliora la funzionalità dei dispositivi microfluidici.
- L'eliminazione degli elettrodi metallici riduce la complessità nella fabbricazione.
- Questo metodo apre nuove strade per applicazioni biochimiche precise.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica di picoiniezione senza elettrodi affronta un collo di bottiglia fondamentale nello sviluppo di saggi microfluidici eliminando l'integrazione di elettrodi metallici, semplificando così la fabbricazione del dispositivo e migliorandone la robustezza. Permettendo un'erogazione precisa di reagenti controllata da tensione con risoluzione di picolitri, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui lo screening basato su gocce e l'analisi a singola cellula sono fondamentali. L'approccio consente piattaforme microfluidiche scalabili e riproducibili per la validazione di bersagli e l'identificazione di composti promettenti nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione funzionale di ipotesi terapeutiche mediante dosaggio preciso dei reagenti in sistemi basati su gocce.
- Valore operativo: Riduce la complessità di fabbricazione e i tassi di errore associati all'integrazione di elettrodi metallici, migliorando il rendimento del dispositivo.
- Valore strategico: Favorisce un'iterazione rapida nella progettazione dei saggi consentendo l'aggiustamento in tempo reale del volume di iniezione tramite tensione applicata.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi microfluidici standardizzati per lo screening coerente di composti con esposizione controllata ai reagenti.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità del saggio eliminando i passaggi di fabbricazione degli elettrodi dipendenti da variabili.
- Valore strategico: Consente lo screening ad alto rendimento di gocce con dosaggio regolabile dei reagenti, migliorando la prontezza allo screening e la qualità dei dati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza biologica consentendo l'iniezione di reagenti comuni come tamponi, enzimi e acidi nucleici, senza introdurre contaminanti metallici.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie a chip microfluidici robusti e riutilizzabili.
- Valore strategico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi dose-risposta mediante iniezioni di picolitri controllate elettricamente con precisione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto leader, in cui una precisa somministrazione di reagenti mediante microfluidica consente uno screening affidabile dei composti e una riduzione dei rischi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il co-incapsulamento controllato di goccioline con molecole segnale o inibitori.
- Screening: Migliora la prontezza e la riproducibilità dei saggi grazie a una picoiniezione regolabile in tensione e priva di elettrodi dei reagenti nelle goccioline del saggio.
- Analisi: Offre un controllo quantitativo sul volume iniettato in funzione della tensione applicata, consentendo misurazioni di risposta al dosaggio e analisi comparative tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico permettendo l'uso di fluidi biologicamente rilevanti senza artefatti o contaminazioni indotte da elettrodi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità microfluidica riutilizzabile per flussi di lavoro basati su goccioline in progetti multipli, riducendo gli sforzi ridondanti di fabbricazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie a un rilascio preciso e controllabile di reagenti all'interno di goccioline microfluidiche.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità nella fabbricazione dei dispositivi, eliminando la dipendenza dagli elettrodi metallici.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento/cessazione grazie alla riduzione del rumore biologico e all’aumento dell'affidabilità del saggio nel screening di goccioline.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei candidati ottimizzata in base al rischio, basata su dati riproducibili e con controllo del dosaggio ottenuti tramite screening microfluidico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di microfluidica, nel controllo di segnali ad alta tensione e nel monitoraggio delle goccioline basato sulla fluorescenza.
- Necessita di un amplificatore ad alta tensione, di un generatore di forme d'onda e di un sistema per la manipolazione dei fluidi elettricamente isolato.
- Esige la standardizzazione dei protocolli di tensione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire volumi di iniezione riproducibili.
- Richiede l'adattamento della conducibilità del fluido di iniezione (ad esempio, forza del tampone) per mantenere relazioni tensione-risposta costanti.
- È limitato dalla necessità di fluidi di iniezione conduttivi; reagenti non conduttivi potrebbero richiedere l'aggiunta di elettroliti.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Design and Fabrication of the Microfluidic Chip
2:21
Preparation of the Air Pressure Control Pump and Emulsion
3:20
Preparation of Reservoirs and Reagents for the Microfluidic Device
5:15
Preparation of the Microfluidic Device for Picoinjection
6:46
Infusion of Reagents into Microfluidic Device and Picoinjection
7:46
Results: Demonstration of Electrodeless Picoinjection
8:43
Conclusion
