Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare tecniche optogenetiche moderne per stimolare fotoletticamente vie neuronali mirate in preparati di tessuto cerebrale in vitro. Questo viene realizzato innanzitutto esprimendo il canale rodopsinico Dossin nelle linee cellulari neuronali di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare tagli acuti delle strutture cerebrali rilevanti da studiare.

Il passo successivo consiste nel registrare le risposte dei neuroni nella preparazione di slice in risposta alla stimolazione fotoptica delle fibre esprimenti il canale rodopsina. L'ultimo passaggio prevede l'acquisizione dell'immagine della distribuzione dei neuroni e delle fibre esprimenti la rodopsina canale. In definitiva, questo approccio consente di valutare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti neurali mediante stimolazione fotoptica con scansione laser di componenti neurali targettizzati con tecniche optogenetiche.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali di stimolazione elettrica sono la capacità di indirizzare specificamente e stimolare particolari tipi cellulari neuronali ed esaminarne le proiezioni a lungo raggio in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroscienza dei sistemi, come l'organizzazione funzionale dei complessi circuiti neurali. Preparare una siringa e un ago per iniettare la soluzione virale, che contiene quattro microgrammi per millilitro di poli per potenziare la trasfezione.

Quindi, iniettare sotto pressione 200 nanolitri della soluzione utilizzando la pompa per siringa; due o tre settimane dopo, si avrà un'espressione adeguata del canale rod Dossin nell'area del taglio. Il campione deve essere preparato nel più breve tempo possibile. Dopo aver rimosso il cervello iniettato, creare un blocco cerebrale nell'orientamento desiderato utilizzando una lama di rasoio pulita. Successivamente, fissare la superficie del blocco cerebrale alla piattaforma di taglio mediante colla adesiva istantanea.

Quindi trasferire la piastra in una camera di taglio vibram refrigerata e versare nella camera di taglio un ACSF ghiacciato. Tagliare le sezioni cerebrali utilizzando un viome in sezioni spesse da quattro a 500 micron. Trasferire le fette cerebrali in una camera di mantenimento ossigenata e lasciarle incubare a 30 gradi Celsius per almeno un'ora prima di procedere con l'esperimento.

Quando si è pronti per iniziare l'esperimento, trasferire la sezione cerebrale sulla piastra del sistema di registrazione elettrofisiologica. Registrare un neurone utilizzando tecniche standard di patch-clamp in configurazione whole cell. Posizionare brevemente la pipetta di registrazione vicino al neurone applicando una pressione positiva alla pipetta.

Dopo aver stabilito il contatto con la cellula, rilasciare la pressione ed applicare un'aspirazione per formare il sigillo giga. Quindi applicare brevemente l'aspirazione per rompere la membrana e ottenere la configurazione a cellula intera, ed effettuare le registrazioni in modalità voltage clamp o current clamp. Utilizzare lo scanner laser con il software di acquisizione dati tidal wave oppure EFAs.

Il software deve essere calibrato sul fotodiodo prima dell'uso per controllare la potenza del laser. Una ruota di densità neutra variabile viene posizionata sul suo percorso. Ruotando la ruota si regola la potenza del laser misurando nel piano focale posteriore.

La potenza è tipicamente impostata tra 25 e D milliwatt. Il parametro d'impulso dell'otturatore controlla la durata e il tempo di stimolazione nel software. Un'immagine della regione da stimolare può essere ottenuta dalla funzione video grab.

Successivamente, impostare la griglia di stimolazione, ad esempio una griglia 16 per 16 con un interasse di 80 micron. Quindi sovrapporre la griglia all'immagine acquisita e regolare le coordinate XY e il grado di offset per ottimizzare l'orientamento prima di iniziare la stimolazione. Attivare la funzione di mappatura.

I dati vengono conservati e possono essere analizzati utilizzando il programma di analisi offline in tidal wave, oppure possono essere analizzati mediante il programma di analisi map nel software EFAs. Dopo aver completato le registrazioni fisiologiche sulla sezione, è possibile documentare il pattern di espressione dell'opsina del canale marcata con YFP. In primo luogo, fissare la sezione durante la notte in PFA al 4% in PBS 0,01 molare a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, trasferire la sezione in soluzione di saccarosio al 30% e PFA al 4% per la crio-protezione notturna. Il giorno seguente, tagliare sezioni di 50 micron della sezione al criostato. Lavare le sezioni in PBS e montarle per l'acquisizione di immagini con un mezzo anti-sfaldamento al microscopio confocale.

Dopo aver individuato la regione di interesse in luce bianca, utilizzare una lunghezza d'onda eccitatoria di 514 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 527 nanometri. Per visualizzare il costrutto virale YFPA che induce l'espressione del canale rod Dobson, EYFP. Nei neuroni glutammatergici eccitatori è stato iniettato nella corteccia visiva primaria di un topo BSY.

L'espressione virale è stata riscontrata nei tratti tra le cortecce visive primaria e secondaria, e nelle fibre cortico-talamiche del LGN. La registrazione con patch clamp a cellula intera da un neurone nella corteccia visiva secondaria, indicato con la stella, ha rivelato EPSC. Successivamente alla stimolazione fotolettica con scansione laser del canale, rod-dossin esprimente fibre nei livelli inferiori di V2, proiezioni cortico-talamiche dal livello VI della corteccia somatosensoriale primaria. Il nucleo ventrale posteriore è stato studiato utilizzando un approccio CRE-LAX per esprimere channelrod-dossin nei neuroni cortico-talamici del livello VI e nelle loro proiezioni. Come previsto, la trasfezione mediante un costrutto AAV floxed in un topo transgenico CRE ha determinato l'espressione di channelrod-dossin nei neuroni mirati del livello VI e nelle loro fibre che si estendono al livello IV.

Il canale rod Dobson ha mostrato anche un'espressione di EYFP nelle fibre che proiettano al VP, registrata fisiologicamente da un neurone del VP. L'uso della tecnica del whole cell patch clamp ha rivelato che potenziali sinaptici eccitatori (ePSC) potevano essere evocati mediante stimolazione luminosa in prossimità del neurone registrato, indicato dalla stella. L'analisi post-acquisizione mostra l'ampiezza media della risposta alla stimolazione luminosa nel VP. In sezioni di 50 micron di neuroni cortico-talamici del sesto strato che esprimono Channel Rodin EYFP, si osserva un fine reticolo di fibre marcate che attraversano dal sesto al quarto strato, dove terminano e si ramificano estesamente.

Inoltre, sono state osservate fibre corticotalamiche entrare nella sostanza bianca e dirigersi verso il talamo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare tecniche optogenetiche moderne per stimolare fotoletticamente vie neuronali mirate in preparazioni di fettine in vitro. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso durante l'esecuzione dei passaggi di calibrazione associati a questa procedura.

Indossare occhiali protettivi.