Name: Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri la fotostimolazione laser-scanning di circuiti prosencefalici mirati con optogenetica. Questo metodo consente di valutare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti neurali in vitro.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH/NIDCD R03 DC 011361, dalla sovvenzione SVM CORP LAV3202, dalla sovvenzione NSF-LA EPSCoR PFUND86 e da una sovvenzione per la pubblicazione da Leica Microsystems (CCL) e dalla sovvenzione NIH/NIDCD R01 DC 008794 (SMS).

1. Chirurgia e iniezioni
<ol>
	<li>Anestetizzare i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale (si consiglia un ago da 22-25 G) di ketamina (100-120 mg/kg) e xilazina (7,5-16 mg/kg).
	<ol>
		<li>Valutare la sedazione utilizzando forti pizzicotti delle dita dei piedi fino a quando non vengono suscitate risposte. Per tutte le procedure sugli animali descritte, modificare per seguire le linee guida IACUC locali, se necessario.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metti i topi sedati in un dispositivo stereotassico fissando la testa e le orecchie nei rispettivi supporti.
	<ol>
		<li>Lubrificare gli occhi prima di inserire l'animale nel dispositivo stereotassico con un unguento oftalmico sterile.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Radere il cuoio capelluto con un rasoio e sterilizzare la zona con tamponi Betadine.</li>
	<li>Usando un bisturi, praticare un'incisione sulla linea mediana e riflettere la pelle e i muscoli sottostanti sopra l'area da iniettare.</li>
	<li>Ruota la lama di un bisturi come un trapano per eseguire una craniotomia sopra la regione da esporre. In alternativa, utilizzare una piccola punta da trapano attaccata a un Dremel per eseguire la craniotomia.
	<ol>
		<li>Per eseguire la craniotomia, posizionare la lama del bisturi o la punta del trapano sulla superficie del cranio e ruotare lentamente fino a quando non è stato scavato abbastanza osso per rivelare la pia madre sottostante.</li>
		<li>Una volta effettuato lo scavo iniziale, allargare la craniotomia utilizzando una pinza fine per rimuovere con cura l'osso dai bordi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Riempire una siringa da 1 μl con la soluzione virale da iniettare (UNC Vector Core).
	<ol>
		<li>Per migliorare l'efficacia della trasfezione, preparare una soluzione virale con 4 μg/ml di polibrene.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Abbassare l'ago nell'area da iniettare e infondere a pressione 200 nl di soluzione contenente virus con una pompa a siringa.
	<ol>
		<li>Lasciare riposare la siringa per 10 minuti prima di estrarre l'ago.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suturare la pelle con nylon monofilamento non assorbibile e coprire l'incisione con una pomata antibiotica.
	<ol>
		<li>I punti di sutura devono essere rimossi dopo 7-10 giorni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per l'analgesia post-operatoria.</li>
	<li>Lasciare che gli animali si riprendano dopo l'intervento per 14-21 giorni per consentire un'adeguata espressione del canale della rodopsina.</li>
</ol>
2. Preparazione della fetta
<ol>
	<li>Dopo il periodo di convalescenza, anestetizzare profondamente l'animale con anestesia isoflurana, come verificato dall'assenza di riflesso di ritiro quando la zampa posteriore e/o le dita dei piedi sono saldamente pizzicate.</li>
	<li>Sezionare il cervello mediante decapitazione seguita da tagli sulla linea mediana e frontali al cranio.</li>
	<li>Staccare il cranio dalla linea mediana per esporre il cervello.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il cervello usando una spatola a paletta fine per separare i nervi cranici dalla base del cervello.</li>
	<li>Posizionare rapidamente il cervello sezionato in un piccolo becher da 100 ml contenente liquido cerebrospinale artificiale freddo e ghiacciato (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glucosio).</li>
	<li>Rimuovere il cervello dall'ACSF e posizionarlo su un vetrino da microscopio coperto con carta da filtro preinumidita con ACSF.</li>
	<li>Fai un taglio di blocco del cervello nell'orientamento desiderato usando una lama di rasoio pulita.</li>
	<li>Fissare la superficie bloccata del cervello al palco di taglio utilizzando la colla adesiva istantanea.</li>
	<li>Trasferire la fase in una camera di taglio a vibratomo (conservata in congelatore fino al momento del taglio).</li>
	<li>Versare l'ACSF ghiacciato nella camera di taglio.</li>
	<li>Affettare sezioni cerebrali a 400-500 μm utilizzando un'affettatrice vibrante.</li>
	<li>Trasferire le fette di cervello in una camera di contenimento contenente ACSF ossigenato e incubare a 30 °C per almeno 1 ora prima dell'esperimento.</li>
</ol>
3. Registrazione fisiologica
<ol>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, trasferire una fetta in una camera di registrazione su un tavolino da microscopio modificato.</li>
	<li>Fissare la fetta nella vasca da bagno durante l'esperimento utilizzando alcuni fili di filamenti di nylon attaccati a un supporto per fette di filo di platino.</li>
	<li>Perfondere costantemente la fetta con ACSF.</li>
	<li>Tirare le pipette di registrazione a una resistenza del puntale di 3-6 MΩ quando riempite con una soluzione intracellulare contenente quanto segue (in mM): 127 K-gluconato, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. La soluzione intracellulare deve avere un pH 7,3, aggiustato con KOH o acido gluconico e l'osmolalità di 280-290 mOsm.</li>
	<li>Utilizzando una configurazione standard di registrazione di cellule intere visualizzate, posizionare la pipetta di registrazione vicino al neurone da registrare applicando una pressione positiva22,23.</li>
	<li>Rilasciare la pressione positiva durante l'applicazione dell'aspirazione per formare la guarnizione Gigaohm.</li>
	<li>Applicare una breve aspirazione per rompere la membrana e formare la registrazione della configurazione dell'intera cella.</li>
	<li>Registra le risposte dei neuroni in tensione o in pinza amperometrica.</li>
</ol>
4. Fotostimolazione a scansione laser
<ol>
	<li>Avviare il software e l'hardware di acquisizione dati, descritti nei rapporti precedenti23-29. 
	Nota: Abbiamo utilizzato sia i programmi di acquisizione Tidelwave25 che, più recentemente, Ephus26, scritti in Matlab e sviluppati dal laboratorio di Karel Svboda presso Janelia Farms30. Per una descrizione completa della fotostimolazione a scansione laser in Ephus, vedi Suter et al.26 e la guida passo passo30. 
	Nota: la configurazione descritta in questo articolo deriva da quella descritta da Shepherd (2012)23. Il raggio laser viene guidato tramite un sistema di specchi a fascio aperto fino alla porta superiore del microscopio attraverso la lente dell'obiettivo sulla fetta (Figura 2).</li>
	<li>Deviare una piccola parte del laser su un fotodiodo con un vetrino coprioggetti per microscopio posizionato nel percorso del laser e utilizzare la corrente in uscita da questo fotodiodo per monitorare l'intensità del laser durante gli esperimenti.
	<ol>
		<li>Calibrare l'uscita di corrente del fotodiodo registrata nel software in base alla potenza laser misurata sul piano focale posteriore dell'obiettivo utilizzando un misuratore di potenza durante la configurazione dell'apparecchiatura23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Controlla la potenza del laser ruotando una rotella a densità neutra variabile. La potenza del laser utilizzata variava tra 25 e 70 mW (sul piano focale posteriore) nei nostri esperimenti.</li>
	<li>Impostare la lunghezza e la temporizzazione della stimolazione laser modificando i parametri dell'impulso per il laser e l'otturatore. La stimolazione laser è in genere lunga 2 msec.</li>
	<li>Cattura l'immagine della regione da stimolare utilizzando la funzione "Grab Video".</li>
	<li>Selezionare la griglia di stimolazione in base alle dimensioni desiderate. In genere utilizziamo un array di stimolazione 16 x 16 con una spaziatura di 80 μm tra righe e colonne adiacenti.</li>
	<li>Sovrapporre la griglia di mappatura con l'immagine acquisita e regolare l'offset x, y e gradi in base alla posizione e all'orientamento desiderati.</li>
	<li>Attiva la funzione 'Mappa' per avviare la stimolazione e l'acquisizione dei dati.</li>
	<li>Dopo l'acquisizione delle risposte evocate dalla fotostimolazione, eseguire l'analisi dei dati mappati utilizzando il programma di analisi delle mappe offline in Tidelwave25 o il programma "MapAnalysis" in Ephus26.</li>
</ol>
5. Imaging a fette fisse
<ol>
	<li>Dopo le registrazioni, trasferire la fetta di cervello al 4% di paraformaldeide (PFA) in 0,01 M PBS (pH7,4) durante la notte a 4 ºC.</li>
	<li>Trasferire la fetta in saccarosio al 30% in PFA al 4%/0,01 M PBS per una notte a 4 ºC.</li>
	<li>Tagliare sezioni da 50 μm utilizzando un criostato e raccoglierle in 0,01 M PBS.</li>
	<li>Sciacquare due volte le sezioni in 0,01 M PBS a temperatura ambiente.</li>
	<li>Montare le sezioni e il vetrino coprioggetti in un mezzo antisbiadimento appropriato.</li>
	<li>Trasferire le sezioni al microscopio confocale.</li>
	<li>Concentrati sul ROI utilizzando la luce bianca.</li>
	<li>Scegli la lunghezza d'onda, le dimensioni dell'immagine e la ripetizione per l'acquisizione dell'immagine. Per YFP, utilizziamo 514 nm (Ex)/527 nm (Em).</li>
</ol>

<ol><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
L'autore (CCL) ha ricevuto una sovvenzione per la pubblicazione da Leica Microsystems, che produce uno strumento utilizzato in questa ripresa di questo protocollo.

Il protocollo descritto descrive in dettaglio un approccio per la valutazione in vitro della topografia funzionale e della fisiologia dei circuiti neuronali, che non si limita all'indagine dei circuiti del prosencefalo, cioè quelli del talamo e della corteccia. Diversi costrutti virali per la trasfezione optogenetica sono stati messi a disposizione della comunità scientifica e sono facilmente ottenibili dal Vector Core dell'UNC. Per una descrizione dei costrutti virali prontamente disponibili, vedere l'UNC Vector Core31, la pagina delle risorse di optogenetica presso il Deisseroth Lab della Stanford University32 e il laboratorio di neurobiologia sintetica Boyden presso il MIT33. Varianti di queste opsine sono state sviluppate da questi laboratori e consentono modalità ad ampio raggio per il controllo dell'eccitabilità neuronale1,2. L'ottenimento di questi vettori dal nucleo vettoriale UNC richiede un accordo di trasferimento di materiale da parte dei laboratori di origine. In questo protocollo, notiamo che l'aggiunta di polibrene migliora l'efficacia della trasfezione. Inoltre, un'altra variabile che influenza l'espressione è il periodo di recupero post-chirurgico, per il quale notiamo che un periodo di almeno 14 giorni è sufficiente per ottenere un'espressione robusta nelle vie del proencefalo dei topi.
Per la trasfezione mirata di specifici gruppi neuronali, sono state sviluppate diverse linee di topi Cre-transgenici, che possono essere utilizzate in combinazione con costrutti virali a lettura aperta invertita "floxed" che sono stati sviluppati11. Diversi ceppi pertinenti alla ricerca neuroscientifica sono disponibili attraverso i Mutant Mouse Regional Resource Centers34. Atlanti dei pattern di espressione della Cre-ricombinasi in queste linee transgeniche sono offerti attraverso il database GENSAT35. Inoltre, Jackson Labs offre diversi ceppi Cre-transgenici, così come altri che esprimono costitutivamente opsine in specifici gruppi neuronali. Un passaggio fondamentale per l'utilizzo di queste linee di topi è quello di tenere conto del tempo necessario per ottenere e stabilire una colonia riproduttiva, che può variare in base al particolare ceppo di interesse.
Per la fotostimolazione, abbiamo utilizzato e adattato il setup sviluppato dallo Shepherd Lab della Northwestern University, descritto in un recente protocollo29. Sebbene ottimizzata per l'uncaging del glutammato, questa configurazione è adatta anche per la fotostimolazione della canalrodopsina senza modifiche. Questa configurazione consente un controllo spaziale preciso e il posizionamento dei loci di fotostimolazione, che consente una valutazione della topografia funzionale dell'innervazione della canalrodopsina dei neuroni registrati. Sebbene il controllo spaziale sia migliorato con questo metodo di fotostimolazione, è più proibitivo in termini di costi rispetto ai metodi che utilizzano l'illuminazione di campo basata su LED20. Inoltre, la non uniformità del tessuto cerebrale è una limitazione dell'optogenetica, o di qualsiasi tecnica che coinvolga la manipolazione della luce. In pratica, però, è raramente un fattore poiché i risultati sono interpretati per lo più in modo qualitativo. Nel caso in cui sia necessario un confronto più quantitativo tra le regioni del cervello, si può sempre utilizzare la massima intensità luminosa per ottenere risposte "sature".
Inoltre, abbiamo utilizzato sia i programmi software Tidelwave che Ephus scritti in Matlab per il controllo della fotostimolazione a scansione laser e l'acquisizione dei dati25,26. Tuttavia, si raccomanda a coloro che configurano un sistema simile di utilizzare il più recente software Ephus26, che ha il supporto disponibile attraverso il sito di sviluppo Janelia Farms30. Un passaggio fondamentale è la scelta di quale di questi pacchetti software utilizzare, poiché i loro requisiti hardware differiscono leggermente. Inoltre, i programmi di analisi delle mappe sono adattati ai rispettivi programmi di acquisizione dati.
Molti di questi passaggi possono essere modificati per adattarsi alla particolare configurazione del professionista. Le iniezioni di soluzioni virali possono essere eseguite con meccanismi di somministrazione oltre a una siringa, ad esempio anche le pipette capillari in vetro tirate a punte con diametri di ~40 μm funzionano bene. Per gli interventi chirurgici, è possibile sostituire un supporto per la testa non stereotassico se tali coordinate non sono necessarie per guidare le iniezioni. Inoltre, le composizioni delle ACSF e delle soluzioni intracellulari possono essere modificate a seconda delle particolari esigenze sperimentali, ad esempio sostituendo una soluzione intracellulare di cesio o ad alto contenuto di cloruro per isolare le correnti inibitorie. Inoltre, un'alternativa all'imaging dei pattern di espressione in fette fisse può essere eseguita anche nella fetta viva su un impianto di imaging adatto con un sistema di perfusione a bagno.
In sintesi, questo protocollo consentirà al professionista di caratterizzare la topografia funzionale e la fisiologia sinaptica delle proiezioni in vitro, cosa che potrebbe non essere possibile utilizzando metodi standard, ad es. Caratterizzazione di proiezioni a lungo raggio che non possono essere conservate in una sezione. Il protocollo di trasfezione descritto può essere applicato agli esperimenti optogenetici in vivo 1-3,12,14, poiché il meccanismo di consegna è lo stesso. Infine, sebbene questo protocollo descriva la trasfezione dei topi, molti dei vettori virali disponibili possono essere utilizzati per trasfettare ed esprimere teoricamente queste opsine in un'ampia gamma di specie di mammiferi, consentendo così una miriade di studi comparativi e specie-specifici1-3.

L'elaborato circuito del proencefalo dei mammiferi pone una sfida sperimentale per sezionare i ruoli funzionali dei suoi componenti intrecciati. Districare queste relazioni è stato recentemente aiutato dallo sviluppo di metodi optogenetici per eccitare e inibire specificamente le popolazioni neuronali e le loro proiezioni1-3. Questi approcci si avvalgono dell'espressione geneticamente controllata dei canali di membrana sensibili alla luce4-6. Di particolare nota, la canalrodopsina, un canale ionico luce-dipendente, depolarizza le membrane neuronali in seguito alla stimolazione ottica, portando all'eccitazione del neurone che esprime e alle sue proiezioni4,7. Al contrario, l'alorodopina, una pompa per cloruro luce-dipendente, iperpolarizza la membrana, inibendo così la proiezione mirata6,8,9. Sono state ingegnerizzate diverse varianti di queste opsine, sono stati prodotti vettori multipli per la trasfezione e l'espressione in popolazioni neuronali di interesse e sono state ingegnerizzate linee di topi transgenici che esprimono costitutivamente queste opsine o che consentono il controllo mediato da cre-lox della loro espressione1,2,10,11.
L'utilità di questi metodi e materiali optogenetici ha rivoluzionato le moderne neuroscienze sperimentali, consentendo la dissezione del ruolo di specifici circuiti neurali nella fisiologia e nel comportamento dell'organismo12-15. In particolare, questi metodi possono essere applicati in modo potente alla dissezione funzionale dei circuiti cerebrali utilizzando preparazioni in vitro di fette16-20. In questo contesto, uno dei principali vantaggi di questo metodo è la capacità di caratterizzare la fisiologia di proiezioni a lungo raggio che sono difficili, se non impossibili, da conservare in una fetta spessa, come le connessioni commissurali tra emisferi corticali cerebrali16. Inoltre, questa tecnologia consente manipolazioni non possibili con altri metodi, come l'inibizione selettiva delle proiezioni con precisione temporale fine utilizzando l'alodopsina6,8,9. Inoltre, l'espressione specifica del tipo cellulare di queste opsine consente di stimolare o inibire selettivamente componenti isolati in un circuito neurale1,2,11,15,21. In quanto tali, questi nuovi strumenti optogenetici consentono l'analisi senza precedenti dei contributi neuronali alla fisiologia e al comportamento.
Qui, descriviamo un protocollo per esprimere la canalrodopsina nel cervello del topo utilizzando vettori virali adeno-associati (AAV)1,2. La trasfezione specifica di popolazioni neuronali bersaglio può essere realizzata utilizzando questo protocollo, con la scelta appropriata di costrutti promotori o topi transgenici che esprimono Cre-ricombinasi nei neuroni bersaglio di interesse e un costrutto virale 'floxed'1,11,15,21 (Figura 1). A titolo di esempio, esaminiamo le proiezioni corticocorticali tra la corteccia visiva primaria (V1) e la corteccia visiva secondaria (V2) e studiamo anche la proiezione corticotalamica di livello 6 dalla corteccia somatosensoriale primaria (S1) al nucleo mediale ventroposteriore (VPm). Combiniamo questa espressione specifica con la fotostimolazione a scansione laser in vitro per valutare la fisiologia sinaptica e la topografia funzionale. La configurazione qui presentata consente il posizionamento spaziale preciso e il controllo dei loci di fotostimolazione. Infine, descriviamo la visualizzazione dei pattern di espressione utilizzando la microscopia confocale.

<table><tbody><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 32%</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV costrutti virali</td><td>UNC Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Portatesta stereotassico per topo</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore Nanocool</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>Laser UV: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;</td><td>DPSS Lasers, Inc</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>Galvonometri</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>specchi</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>montatura</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>cavo</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>driver/controller</td><td>Cambridge Scanning</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>Otturatore - Rivestimento ZM (compatibile con UV)</td>Controller per otturatore <td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td></td> Amplificatore di corrente <td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr> Scheda <tr><td></td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713</td><td>National Instruments</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 Break-out Box</td><td>National Instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>National Instruments</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>Cavi</td><td>National Instruments</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

laser-scanning fotostimolazione di circuiti prosencefalo optogenetically mirati

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

Il prosencefalo sensoriale è composto da tipi di cellule strettamente connesse, le cui proprietà funzionali devono ancora essere completamente chiarite. La comprensione delle interazioni di questi circuiti del prosencefalo è stata recentemente aiutata dallo sviluppo di metodi optogenetici per la modulazione mediata dalla luce dell'attività neuronale. Qui, descriviamo un protocollo per esaminare l'organizzazione funzionale dei circuiti del proencefalo in vitro utilizzando la fotostimolazione a scansione laser della canalrodopsina, espressa optogeneticamente tramite trasfezione mediata da virus. Questo approccio sfrutta anche l'utilità della ricombinazione cre-lox in topi transgenici per indirizzare l'espressione in specifici tipi di cellule neuronali. Dopo la trasfezione, i neuroni vengono registrati fisiologicamente in preparazioni di fette utilizzando un patch clamp a cellula intera per misurare le loro risposte evocate alla fotostimolazione a scansione laser delle fibre che esprimono la canalrodopsina. Questo approccio consente una valutazione della topografia funzionale e delle proprietà sinaptiche. I correlati morfologici possono essere ottenuti mediante imaging dell'espressione neuroanatomica delle fibre che esprimono la canalrodopsina utilizzando la microscopia confocale della fetta viva o del tessuto post-fissato. Questi metodi consentono indagini funzionali dei circuiti del proencefalo che si espandono su approcci più convenzionali.

La fotostimolazione con scansione laser delle proiezioni tra l'area visiva primaria (V1) e l'area visiva secondaria (V2) nel topo è stata eseguita dopo iniezioni di pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 di un topo Balb/C (Figura 3). Il promotore CaMKIIa in questo costrutto virale induce un'espressione specifica della canalorodopsina-EYFP nei neuroni glutammatergici eccitatori1,15. Dopo la preparazione di sezioni per la registrazione fisiologica, è stata osservata l'espressione delle fibre della canalorodopsina-EYFP, ovvero l'epifluorescenza dell'EYFP coniugato, che si estendevano da V1 a V2 (Figura 3A). Inoltre, sono state osservate anche le fibre corticotalamiche nel nucleo genicolato laterale (LGN) (Figura 3A). Registrazioni in modalità patch-clamp in intera cellula da un neurone in V2 hanno rivelato correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) elicitate mediante fotostimolazione con scansione laser delle fibre esprimenti canalorodopsina-EYFP negli strati inferiori di V2 (Figura 3B).
In un altro esempio, la fotostimolazione con scansione laser delle proiezioni corticotalamiche dallo strato 6 della corteccia somatosensoriale primaria (S1) al nucleo ventroposteriore (VP) è stata realizzata utilizzando questo protocollo. In questo caso, abbiamo utilizzato un approccio Cre-Lox per indirizzare in modo specifico l'espressione della canalrodocopsina nei neuroni dello strato 6 e nelle proiezioni corticotalamiche di interesse. In particolare, abbiamo iniettato pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA nella S1 di topi B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Figure 1 e 4). Questa linea transgenica esprime la ricombinasi Cre in modo specifico nei neuroni corticotalamici dello strato 621, determinando quindi l'espressione di ChR-YFP soltanto in questi neuroni dopo la trasfezione con il costrutto AAV "floxed". Dopo la preparazione delle sezioni, le fibre canalrodocopsina-EYFP sono state osservate nei neuroni dello strato 6 e nelle fibre che proiettano allo strato 4 e al VP (Figure 4A e 4B). La registrazione fisiologica da un neurone del VPm mediante tecnica patch-clamp in configurazione whole-cell ha rivelato che potenziali postsinaptici eccitatori (EPSC) potevano essere eliciti mediante fotostimolazione con scansione laser in prossimità del neurone registrato (Figure 4C e 4D).
La morfologia delle fibre marcate è stata valutata più agevolmente a seguito delle registrazioni fisiologiche. In questo caso, abbiamo sezionato nuovamente (50 μm) preparati in slice con espressione di channelrodopsina-EYFP nei neuroni corticotalamici dello strato 6 (Figura 5). Ciò ha rivelato un fine reticolo di fibre marcate che si estendono dallo strato 6 allo strato 4, dove terminano e si ramificano estesamente (Figura 5A). Inoltre, sono state osservate fibre corticotalamiche in ingresso nella sostanza bianca, dirette verso il talamo (Figure 5A e 5B).
<img alt="Diagramma di editing genetico mediante Cre-loxP per l'espressione mirata di ChR-YFP in un modello murino." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Rappresentazione schematica dell'espressione mirata della channelrodopsina mediante approccio Cre-Lox. Topi transgenici che esprimono Cre-ricombinasi nelle popolazioni neuronali di interesse vengono iniettati con un virus "floxed" che codifica per la channelrodopsina fusa a una proteina fluorescente, come la YFP. Dopo la trasfezione, solo i neuroni che esprimono Cre-ricombinasi produrranno channelrodopsina-EYFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Diagramma di microscopia laser con ottiche laser, specchio dicotico, telecamera CCD e configurazione di scansione." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Illustrazione schematica della configurazione di fotostimolazione. (A) Diagramma della configurazione di fotostimolazione con scansione laser. Il fascio laser viene indirizzato attraverso un sistema a fascio aperto verso un otturatore e un filtro di densità neutra (N.D.). Un coprioggetto riflette parte del fascio verso un fotodiodo collegato a un amplificatore per misurare l'intensità del laser. Galvanometri a specchio vengono utilizzati per posizionare il fascio laser attraverso una lente di scansione, che lo indirizza attraverso un boccaporto laterale posto sulla sommità del microscopio. Il fascio viene quindi riflesso verso il basso attraverso l'obiettivo fino al preparato di tessuto mediante uno specchio dicotico. Per ulteriori dettagli, vedere Lam e Sherman23 e Shepherd29. (B) Esempio del modello a griglia della fotostimolazione per l'esperimento rappresentativo mostrato nella Figura 3. La griglia di stimolazione 16 × 16 è sovrapposta a una fotomicrografia del preparato di tessuto. Una stella rossa indica la posizione di un neurone registrato mediante tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell. La posizione del fascio laser viene guidata a ciascuna delle 256 posizioni della griglia di stimolazione tramite il posizionamento computerizzato dei galvanometri a specchio. Le posizioni del laser relative ai primi 5 siti di stimolazione sono rappresentate in figura. Le risposte del neurone registrato alla fotostimolazione in ciascuno dei siti sono illustrate nella Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Diagramma della mappa di neuroimmagine; analisi della corteccia visiva LGN, V1, V2; studio delle connessioni neurali." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Fotostimolazione con scansione laser di proiezioni corticocorticali dalla corteccia visiva primaria (V1) alla corteccia visiva secondaria (V2) nel topo. (A) Immagine epifluorescente del preparato in sezione che mostra le fibre channelrodopsina-EYFP da V1 a V2 e nel nucleo genicolato laterale (LGN). L'espressione specifica della channelrodopsina-EYFP nei neuroni glutammatergici eccitatori è indotta da un costrutto virale contenente il promotore CaMKIIa. (B) Correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) elicitate in un neurone di V2 in seguito a fotostimolazione con scansione laser. La stella rossa indica il sito di registrazione. Barre della scala: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Diagramma del layer corticale con analisi della regione VP; mappa l'attività microelettrica; dati di elettrofisiologia" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Fotostimolazione con scansione laser di proiezioni corticotalamiche dalla corteccia somatosensoriale primaria (S1) al nucleo ventroposteriore (VP) nel topo. (A) Immagine epifluorescente del preparato in sezione che mostra le fibre channelrodopsina-EYFP in S1. (B) Immagine epifluorescente delle fibre marcate nel VP. (C) Correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) elicitate in un neurone del VP in seguito a fotostimolazione con scansione laser. (D) Grafico delle EPSC medie. La stella rossa indica il sito di registrazione. I tracciati racchiusi in box in (C) corrispondono ai valori racchiusi in box in (D). Barre della scala: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Microscopia a fluorescenza che mostra strutture neuronali, marcate con marcatori verdi; diagramma comparativo." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Imaging di neuroni dello strato 6 che esprimono channelrhodopsin-EYFP nella corteccia somatosensoriale primaria (S1) del topo. (A-B) Neuroni marcati nello strato 6 e fibre che si proiettano nello strato 4 e nella sostanza bianca. Barre della scala: (A) 250 µm, (B) 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare tecniche optogenetiche moderne per stimolare fotoletticamente vie neuronali mirate in preparati di tessuto cerebrale in vitro. Questo viene realizzato innanzitutto esprimendo il canale rodopsinico Dossin nelle linee cellulari neuronali di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare tagli acuti delle strutture cerebrali rilevanti da studiare.Il passo successivo consiste nel registrare le risposte dei neuroni nella preparazione di slice in risposta alla stimolazione fotoptica delle fibre esprimenti il canale rodopsina. L'ultimo passaggio prevede l'acquisizione dell'immagine della distribuzione dei neuroni e delle fibre esprimenti la rodopsina canale. In definitiva, questo approccio consente di valutare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti neurali mediante stimolazione fotoptica con scansione laser di componenti neurali targettizzati con tecniche optogenetiche.I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali di stimolazione elettrica sono la capacità di indirizzare specificamente e stimolare particolari tipi cellulari neuronali ed esaminarne le proiezioni a lungo raggio in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroscienza dei sistemi, come l'organizzazione funzionale dei complessi circuiti neurali. Preparare una siringa e un ago per iniettare la soluzione virale, che contiene quattro microgrammi per millilitro di poli per potenziare la trasfezione.Quindi, iniettare sotto pressione 200 nanolitri della soluzione utilizzando la pompa per siringa; due o tre settimane dopo, si avrà un'espressione adeguata del canale rod Dossin nell'area del taglio. Il campione deve essere preparato nel più breve tempo possibile. Dopo aver rimosso il cervello iniettato, creare un blocco cerebrale nell'orientamento desiderato utilizzando una lama di rasoio pulita. Successivamente, fissare la superficie del blocco cerebrale alla piattaforma di taglio mediante colla adesiva istantanea.Quindi trasferire la piastra in una camera di taglio vibram refrigerata e versare nella camera di taglio un ACSF ghiacciato. Tagliare le sezioni cerebrali utilizzando un viome in sezioni spesse da quattro a 500 micron. Trasferire le fette cerebrali in una camera di mantenimento ossigenata e lasciarle incubare a 30 gradi Celsius per almeno un'ora prima di procedere con l'esperimento.Quando si è pronti per iniziare l'esperimento, trasferire la sezione cerebrale sulla piastra del sistema di registrazione elettrofisiologica. Registrare un neurone utilizzando tecniche standard di patch-clamp in configurazione whole cell. Posizionare brevemente la pipetta di registrazione vicino al neurone applicando una pressione positiva alla pipetta.Dopo aver stabilito il contatto con la cellula, rilasciare la pressione ed applicare un'aspirazione per formare il sigillo giga. Quindi applicare brevemente l'aspirazione per rompere la membrana e ottenere la configurazione a cellula intera, ed effettuare le registrazioni in modalità voltage clamp o current clamp. Utilizzare lo scanner laser con il software di acquisizione dati tidal wave oppure EFAs.Il software deve essere calibrato sul fotodiodo prima dell'uso per controllare la potenza del laser. Una ruota di densità neutra variabile viene posizionata sul suo percorso. Ruotando la ruota si regola la potenza del laser misurando nel piano focale posteriore.La potenza è tipicamente impostata tra 25 e D milliwatt. Il parametro d'impulso dell'otturatore controlla la durata e il tempo di stimolazione nel software. Un'immagine della regione da stimolare può essere ottenuta dalla funzione video grab.Successivamente, impostare la griglia di stimolazione, ad esempio una griglia 16 per 16 con un interasse di 80 micron. Quindi sovrapporre la griglia all'immagine acquisita e regolare le coordinate XY e il grado di offset per ottimizzare l'orientamento prima di iniziare la stimolazione. Attivare la funzione di mappatura.I dati vengono conservati e possono essere analizzati utilizzando il programma di analisi offline in tidal wave, oppure possono essere analizzati mediante il programma di analisi map nel software EFAs. Dopo aver completato le registrazioni fisiologiche sulla sezione, è possibile documentare il pattern di espressione dell'opsina del canale marcata con YFP. In primo luogo, fissare la sezione durante la notte in PFA al 4% in PBS 0,01 molare a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, trasferire la sezione in soluzione di saccarosio al 30% e PFA al 4% per la crio-protezione notturna. Il giorno seguente, tagliare sezioni di 50 micron della sezione al criostato. Lavare le sezioni in PBS e montarle per l'acquisizione di immagini con un mezzo anti-sfaldamento al microscopio confocale.Dopo aver individuato la regione di interesse in luce bianca, utilizzare una lunghezza d'onda eccitatoria di 514 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 527 nanometri. Per visualizzare il costrutto virale YFPA che induce l'espressione del canale rod Dobson, EYFP. Nei neuroni glutammatergici eccitatori è stato iniettato nella corteccia visiva primaria di un topo BSY.L'espressione virale è stata riscontrata nei tratti tra le cortecce visive primaria e secondaria, e nelle fibre cortico-talamiche del LGN. La registrazione con patch clamp a cellula intera da un neurone nella corteccia visiva secondaria, indicato con la stella, ha rivelato EPSC. Successivamente alla stimolazione fotolettica con scansione laser del canale, rod-dossin esprimente fibre nei livelli inferiori di V2, proiezioni cortico-talamiche dal livello VI della corteccia somatosensoriale primaria. Il nucleo ventrale posteriore è stato studiato utilizzando un approccio CRE-LAX per esprimere channelrod-dossin nei neuroni cortico-talamici del livello VI e nelle loro proiezioni. Come previsto, la trasfezione mediante un costrutto AAV floxed in un topo transgenico CRE ha determinato l'espressione di channelrod-dossin nei neuroni mirati del livello VI e nelle loro fibre che si estendono al livello IV.Il canale rod Dobson ha mostrato anche un'espressione di EYFP nelle fibre che proiettano al VP, registrata fisiologicamente da un neurone del VP. L'uso della tecnica del whole cell patch clamp ha rivelato che potenziali sinaptici eccitatori (ePSC) potevano essere evocati mediante stimolazione luminosa in prossimità del neurone registrato, indicato dalla stella. L'analisi post-acquisizione mostra l'ampiezza media della risposta alla stimolazione luminosa nel VP. In sezioni di 50 micron di neuroni cortico-talamici del sesto strato che esprimono Channel Rodin EYFP, si osserva un fine reticolo di fibre marcate che attraversano dal sesto al quarto strato, dove terminano e si ramificano estesamente.Inoltre, sono state osservate fibre corticotalamiche entrare nella sostanza bianca e dirigersi verso il talamo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare tecniche optogenetiche moderne per stimolare fotoletticamente vie neuronali mirate in preparazioni di fettine in vitro. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso durante l'esecuzione dei passaggi di calibrazione associati a questa procedura.Indossare occhiali protettivi.

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Neuroscience

Neuroscienze

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Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Qui si descrive un protocollo per optogenetic manipolazione delle attività dei motoneuroni, mentre il monitoraggio dei cambiamenti in uscita del motore (contrazione muscolare) in...

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Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Come attualmente implementato, l'optogenetica nei primati non umani richiede l'iniezione di vettori virali nel cervello. Un metodo di iniezione ottimale dovrebbe essere affidabile e, per molte applicazioni, in grado di colpire singoli siti di profondità arbitraria che sono prontamente e inequivocabilmente identificati nell'istologia postmortem. Viene presentato un metodo di iniezione con queste proprietà.

Iniezioni di vettori AAV per l'optogenetica in cervello di primati non umani anestetizzati e svegli

I metodi qui descritti delineano una procedura utilizzata per invertire optogeneticamente la plasticità indotta dalla cocaina in un circuito comportamentale rilevante nei ratti. La stimolazione ottica sostenuta a bassa frequenza delle sinapsi talamo-amigdala induce depressione a lungo termine (LTD). La LTD indotta optogeneticamente in vivo in ratti con esperienza di cocaina ha determinato la successiva attenuazione della ricerca di droga motivata da spunti.

Usare l'optogenetica per invertire la neuroplasticità e inibire la ricerca di cocaina nei ratti

Qui, presentiamo due protocolli per la registrazione della micro-elettrocorticografia ad alta densità (μEcoG) in ratti e topi, inclusi metodi chirurgici, di impianto e di registrazione. Le registrazioni μECoG vengono eseguite in combinazione con la registrazione di politrodi laminari nella corteccia uditiva del ratto o con la manipolazione optogenetica dell'attività neurale nella corteccia somatosensoriale del topo.

Indagini multiscala sull'elaborazione corticale integrando politrodi laminari e optogenetica con la microcorticografia nei roditori

Scopri la fotostimolazione laser-scanning di circuiti prosencefalici mirati con optogenetica. Questo metodo consente di valutare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti neurali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

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