Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di applicare le moderne tecniche optogenetiche per fotostimolare percorsi neuronali mirati in preparazioni di fette in vitro. Ciò si ottiene esprimendo per la prima volta il bastoncello canale Dossin nelle linee cellulari neuronali di interesse. La seconda fase della procedura consiste nell'effettuare preparazioni acute di fette delle strutture cerebrali rilevanti da studiare.

Il passo successivo è quello di registrare le risposte dei neuroni nella preparazione della fetta in risposta alla fotostimolazione del canale, il bastoncello che esprime le fibre che esprime. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare la distribuzione dei neuroni e delle fibre che esprimono l'opsina del canale. In definitiva, questo approccio consente una valutazione della topografia funzionale e delle proprietà sinaptiche dei circuiti neurali utilizzando la fotostimolazione a scansione laser di componenti neurali optogeneticamente mirati.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai tradizionali metodi di stimolazione elettrica sono la capacità di indirizzare e stimolare in modo specifico particolari tipi di cellule neuronali ed esaminare le loro proiezioni a lungo raggio in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dei sistemi, come l'organizzazione funzionale di prese di guerra complesse. Preparare una siringa e un ago per iniettare la soluzione virale, che contiene quattro microgrammi per millilitro di polietilene per migliorare la trasfezione.

Quindi iniettare a pressione 200 nanolitri di soluzione utilizzando la pompa a siringa, due o tre settimane dopo, ci sarà un'adeguata espressione della fetta di Dossin. La preparazione deve essere eseguita il più rapidamente possibile Dopo aver rimosso il cervello iniettato, fare un blocco del cervello nell'orientamento desiderato utilizzando una lama di rasoio pulita. Quindi, fissare la superficie bloccata del cervello alla fase di taglio utilizzando la colla adesiva istantanea.

Quindi trasferire il tavolino in una camera di taglio vibram raffreddata nel congelatore e versare A CSF ghiacciato nella camera di taglio. Taglia le sezioni del cervello usando un vioma in sezioni spesse da quattro a 500 micron. Trasferisci le fette di cervello in una camera di contenimento ossigenata e lasciale incubare a 30 gradi Celsius per almeno un'ora prima di procedere con l'esperimento.

Quando sei pronto per iniziare l'esperimento, trasferisci la fetta di cervello sul palco dell'impianto di registrazione elettrofisiologica. Registra un neurone utilizzando le tecniche standard di patch clamp a cellula intera. Posizionare brevemente la pipetta di registrazione vicino al neurone mentre si applica una pressione positiva alla pipetta.

Dopo aver effettuato il contatto con la cella, rilasciare la pressione e applicare l'aspirazione per formare la guarnizione giga. Quindi applicare una breve aspirazione per rompere la membrana per la configurazione dell'intera cella ed effettuare registrazioni in modalità voltage o current clamp. È possibile utilizzare lo scanner laser con il software di acquisizione dati a onde di marea o EFA.

Il software deve essere calibrato sul fotodiodo prima dell'uso per controllare la potenza del laser. Una ruota a densità neutra variabile viene posizionata sul suo percorso. Ruotando la rotella si regola la potenza del laser misurando sul piano focale posteriore.

La potenza è in genere impostata tra 25 e D milliwatt. Il parametro dell'impulso dell'otturatore controlla la durata e la tempistica della stimolazione nel software. È possibile creare un'immagine della regione da stimolare dalla funzione di acquisizione video.

Successivamente, impostare la griglia di stimolazione, ad esempio una griglia 16 per 16 con una spaziatura di 80 micron. Quindi sovrapporre la griglia all'immagine acquisita e regolare le coordinate XY e il grado di offset per ottimizzare l'orientamento per avviare la stimolazione. Attiva la funzione mappa.

I dati vengono conservati e possono essere analizzati utilizzando il programma di analisi offline in caso di marea, oppure possono essere analizzati utilizzando il programma di analisi delle mappe nel software EFA. Dopo aver completato le registrazioni fisiologiche sulla fetta, è possibile documentare il modello di espressione dell'opsina del canale marcato YFP. Innanzitutto, fissare la fetta durante la notte in PFA al 4% in PBS molare a 0,01 gradi Celsius.

Il giorno successivo, trasferire la fetta in una soluzione di saccarosio al 30% e PFA per la crioprotezione notturna. Il giorno seguente, tagliare sezioni da 50 micron della fetta su un criostato. Sciacquare le fette in PBS e montarle per l'imaging con un mezzo anti dissolvenza al microscopio confocale.

Dopo aver trovato la regione di interesse nella luce bianca, utilizzare una lunghezza d'onda eccitatoria di 514 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 527 nanometri. Per visualizzare il costrutto virale YFPA che guida l'espressione del canale rod Dobson, EYFP. Nei neuroni glutammatergici eccitatori sono stati iniettati nella corteccia visiva primaria di un topo BSY.

L'espressione virale è stata trovata nelle tracce tra la corteccia visiva primaria e secondaria e nelle fibre talamiche cortico-cellulari della registrazione del patch clamp a cellula intera LGN da un neurone nella corteccia visiva secondaria marcata dalla stella ha rivelato e PSCs. Dopo la fotostimolazione a scansione laser del canale, il bastoncello Dossin esprime fibre negli strati inferiori di V due proiezioni talamiche cortico-chirurgiche dallo strato sei della corteccia somatosensoriale primaria. Il nucleo posteriore ventrale è stato studiato utilizzando un approccio CRE LAX per esprimere la dossina dei bastoncelli dei canali nei neuroni talamici corticali del sesto strato e, nelle loro proiezioni, come previsto, la trasfezione da parte di un costrutto floccato a V in un topo transgenico CRE ha portato all'espressione della dosina dei bastoncelli dei canali nei neuroni del sesto strato bersaglio e le loro fibre che si estendono fino al quarto strato.

L'espressione di EYFP è stata notata anche nelle fibre proiettate alle registrazioni fisiologiche VP da un neurone VP. L'uso del patch clamp a cellula intera ha rivelato che le PSC potrebbero essere suscitate in seguito alla fotostimolazione vicino al neurone registrato, che è contrassegnato dalla stella. L'analisi offline mostra l'ampiezza media della risposta alla fotostimolazione in fette di 50 micron resezioni VP di neuroni talamici corticali di sesto strato che esprimono il canale Rodin EYFP hanno rivelato un sottile modello di fibre marcate che attraversano dallo strato sei allo strato quattro dove terminano e si arborano ampiamente.

Inoltre, sono state osservate fibre talamiche corticole che entrano nella sostanza bianca e attraversano il talamo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare le moderne tecniche optogenetiche per fotostimolare percorsi neuronali mirati in preparazioni di fette in vitro. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso quando si eseguono le fasi di calibrazione associate a questa procedura.

Indossare occhiali protettivi.