Name: Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose Medicago truncatula Con il rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 1 s
Description: Impara a quantificare i fenotipi simbiotici di Medicago truncatula con Sinorhizobium meliloti utilizzando microcosmi sterili per pianta singola. Questo metodo consente l'osservazione controllata del sistema radicale e dei noduli per 9 settimane.

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Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Istituto USDA Nazionale di alimentazione e l&#39;agricoltura, agricoltura e alimentazione Research Initiative concessione 2010-65.108 - 20582 a KMJ Ringraziamo Brian K. Washburn per la revisione critica del manoscritto.

Eseguito le fasi 1, 2, 4, e 6 in una cappa a flusso laminare sterile è raccomandato. 1. Preparazione di M. truncatula A17 Piantine Nota: M. truncatula A17 semi utilizzati in questi studi sono prodotti in condizioni di serra raffreddate a ~ 22 ° C, o in una stanza crescita delle piante mantenuta a 22-26 ° C con ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 luce. <ol><li> Versare in piastre germinazione dei semi: Usa 100 millimetri piatti quadrati (15 mm di profondità) e versare autoclavato 1,1-1,2% w / v di agar purificato 10 ad una profondità di 3-5 mm. Ogni piatto sarà utilizzato per germinare ~ 0,25-0,5 g di seme (equivalente a 63-125 semi / piastra). Nota: E &#39;fondamentale utilizzare impianti coltura cellulare testato, agar purificato per tutti i piatti descritti in questo protocollo. Il venditore e le informazioni il numero di catalogo per l&#39;agar è elencato nella tabella dei reagenti e attrezzature specifiche. </li><li> Scarify / sterilizzare l&#39;M. truncatula A17 semes: Pesare semi sufficienti per il numero desiderato di piantine. (M. truncatula A17 semi sono ~ 4 mg ciascuna) Luogo semi sterili 125 ml flaconi con le coperture foglio sterili (0,25-0,5 g di semi / boccetta, questo è ~ 63-125 semi) e pipetta 20 ml di concentrato (96%) H 2 SO 4 lungo le pareti del pallone. Nota: scarificazione Acid sterilizzare i semi. Inoltre, l&#39;acido pipettando lungo le pareti del pallone, esso ri-sterilizzare l&#39;interno del pallone che è venuto a contatto con i semi sterilizzati. </li><li> Break up ciuffi di sementi con una pipetta di vetro sterile. Agitare ogni boccetta di frequente per 10-12 min. Piccolo, pozzi marroni saranno visibili sui semi. Questi sono piccoli fori nel cappotto di seme 11. Nota: quando si lavora con H 2 SO 4 concentrato Indossare occhiali di protezione e guanti. </li><li> Rimuovere H 2 SO 4 e sciacquare i semi: quando almeno il 10% dei semi hanno piccoli pozzi marrone, o 12 min sono passati, a seconda di qualeviene in primo luogo, rimuovere tutti l&#39;acido dai palloni con una pipetta di vetro sterile. (Acido rifiuti posto in un beaker 1-2 L contenente almeno 300 ml di acqua di rubinetto. Ciò diluire l&#39;acido ed evitarne il surriscaldamento.) Inclinare il pallone per raccogliere l&#39;acido residuo in curva del pallone e utilizzare una piccola pipetta di vetro a eliminare tutto l&#39;acido residuo. Se l&#39;acido residua, che reagisce con l&#39;acqua di risciacquo, scaldare i semi e li uccidono. <ol><li> Risciacquare semi versando rapidamente 100 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone. Il volume in eccesso di acqua diluire l&#39;acido e prevenire il surriscaldamento e sementi danni durante la reazione dell&#39;acido con l&#39;acqua. Versare l&#39;acqua e fiamma sterilizzare il labbro del pallone. </li><li> Sciacquare i semi 8-10x con 50 ml di acqua ultrapura sterile. Agitare il pallone durante ogni lavaggio. Il pallone deve essere considerato sterile a questo punto e il labbro del pallone deve essere fiammato prima di ogni risciacquo. </li></ol></li><li> Lasciate che i semi assorbono durante la notte: dopo laultimo risciacquo, versare 50 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone, sostituire la pellicola di copertura sterile su ogni pallone e posto a 4 ° C al buio durante la notte. </li><li> Luogo semi su piastra germinazione: Dopo semi di locazione assorbono durante la notte, versare l&#39;acqua, sciacquare con 2x ~ 25 ml di acqua ultrapura, quindi aggiungere 20 ml di acqua ultrapura sterile, turbinio per risospendere semi e versare su una piastra di agar germinazione 1,1-1,2% da punto 1.1. Se semi rimangono nel pallone, aggiungere più acqua e versare di nuovo. Distribuire i semi da ogni pallone a una piastra (63-125 semi / piastra). <ol><li> Agitare la piastra per distribuire i semi. I semi devono essere distribuiti in modo uniforme in una banda di 4-5 cm ad una estremità della piastra. Questo sarà il &quot;top&quot; della piastra. Il &quot;fondo&quot; 5-6 cm dovrebbe essere mantenuto privo di semi (Figura 2A). </li><li> Aspirare l&#39;acqua con una pipetta sterile. La piastra a 45 ° per far colare l&#39;acqua rimasta al fondo della piastra. Riposizionare il coperchio sul tilPiastra ted e proteggere dalla luce. Piatti dovrebbe essere consentito di drenare 10-20 min. (Figura 2B). </li></ol></li><li> Montato germinazione: Rimuovere tutta l&#39;acqua che si è raccolto nella parte inferiore della piastra inclinata con una pipetta sterile. <ol><li> Riposizionare il coperchio e sigillare il piatto con parafilm. Indossare guanti e mantenere sterile (Figura 2C). </li><li> Stack le piastre di germinazione e poi girare tutti loro fino ad un angolo di 90 °. I semi vengono stesi sulla superficie verticale della agar. Semi completamente imbibiti dovrebbe facilmente aderire al agar. Le radici cresceranno verso il basso (Figura 2D). </li><li> Avvolgere la pila di lastre di germinazione in fogli di bloccare la luce e mantenerlo a 25 ° C per 3 giorni. </li></ol></li></ol> Nota: Se il provento di germinazione per meno di 3 giorni, le radici possono essere troppo breve per raggiungere l&#39;agar-agar in microcosmi. Se la germinazione procede più di 4 giorni prima del trasferimento a piastre microcosmo, la sopravvivenza delle piantine sarannoessere poveri. Se M. ecotipi truncatula o mutanti con tassi di germinazione più lenti devono essere confrontati, l&#39;ecotipo lentamente germinazione dovrebbe essere consentito di germinare più di 3 giorni. 2. Preparazione dei singoli Microcosmi Piatto <ol><li> Preparare medio 12 (cfr. tabella 1 per la composizione), consentendo ~ 70 ml di mezzo di Jensen per ogni microcosmo. Preparare in brocche o bottiglie che sono convenienti per un rapido versamento (non più di 1-2 litri per ogni lanciatore) e lasciare un ancoretta magnetica nella brocca durante la sterilizzazione in autoclave. <ol><li> Dopo medio è raffreddato a ~ 55-65 ° C, sono stati aggiunti integratori, e il pH è stato controllato (cfr. tabella 1), versare nella rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piatti fondi. Le lastre devono essere versati ~ 0,9-1 cm di profondità (~ 70 ml / piastra). </li><li> Componenti di mezzo di Jensen possono formare un precipitato nuvoloso, quindi è importante per restituire il lanciatore alla piastra magnetica mescolare periodicamente per evitare che i componenti di stabilirsi fuori. Precipitati possono essere vispatibile nel piatto dopo che solidificano, e non influisce sulle prestazioni, purché siano equamente distribuiti tra i piatti. </li><li> Impilare piastre durante il getto per evitare la formazione di condensa sui coperchi piastra. </li></ol></li><li> Dopo piastre di Jensen solidifica, tacca entrambe le piastre e coperchi con una spatola di pesatura che è stato piegato a U 5 (Figura 3A). Riscaldare la curva della spatola con un bruciatore fino al rosso caldo, tacca 5-6 piatti e poi riscaldare di nuovo. Quando il coperchio dentellato è collocata sulla piastra dentata, questo creerà un portale ovale attraverso il quale la ripresa della piantina crescerà (Figura 3B). Se le piastre dentellate devono essere conservati, avvolgere singolarmente con film paraffina .. </li></ol> 3. Preparazione di Sinorhizobium meliloti Culture Due giorni prima inoculazioni di piante, iniziare culture di tutto S. meliloti ceppi essere inoculate sulle piantine. Culres dovrebbero essere coltivate in LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medio 13 supplementato con 2.5 MgSO mm 4, 2,5 mM CaCl 2, e antibiotici appropriati (TY medio funziona anche bene). Appena 2-3 ml di ogni cultura saranno sufficienti. <ol><li> Coltivare a 30 ° C con agitazione per 2 giorni fino a quando le cellule sono densi. </li><li> Per la maggior parte inoculazioni vegetali, la fase di crescita del S. meliloti non è critica. Di solito, in ritardo log o sono utilizzate cellule in fase stazionaria precoce. </li></ol> 4. Posa su M. truncatula Piantine sui singoli Microcosmi <ol><li> Dopo 3 giorni, aprire un piatto di germinazione (preparato nella fase 1) e inondare immediatamente con acqua ultrapura sterile. Dip pinza in etanolo e brevemente fiamma per sterilizzare. Utilizzare pinze sterili per spingere delicatamente le punte delle radici di tutte le piantine sotto l&#39;acqua per evitare l&#39;essiccazione. Radici spazieranno 2-6 cm di lunghezza. La maggioranza sarà 3-4 cm. Selezionare piantine con radici diritte e non evidentedifetti. </li><li> Controllare i coperchi dei microcosmi medie del Jensen per la formazione di condensa. Flick il coperchio per rimuovere la condensa o sostituirlo con un nuovo coperchio dentellato. Se vi è un eccesso di condensa sul coperchio, la radice piantina può aderire al coperchio e poi muoiono dopo la condensazione asciuga. </li><li> Utilizzando le pinze, prendere delicatamente una piantina dalla piastra germinazione dai cotiledoni e laici la radice su mezzo il microcosmo di un Jensen. Assicurarsi che la punta della radice è in contatto con l&#39;agar. </li><li> Rimuovere delicatamente il cappotto di seme se è ancora presente. I cappotti di seme dovrebbero essere sciolti dopo ammollo in acqua per 5-10 min. Stuzzicare delicatamente il cappotto di seme con la pinza fino a quando non cede, e scartare. I cotiledoni e circa 0,5 cm di ripresa devono sporgere fuori dalla U-tacca nella piastra (Figura 4A). Ricollocare accuratamente il coperchio della piastra con l&#39;U-tacca del coperchio sopra la piantina, creando un portale per la piantina (Figura 4B).Set piastre da parte in pile orizzontali fino a quando tutti piantine sono stati immessi sul microcosmi. </li><li> Utilizzare tutte le piantine da ogni piatto germinazione quello sguardo vitale e hanno una radice diritta. (Se possibile, lasciare un piatto di piantine non aperti da utilizzare in sostituzione di piantine avvizzite poco prima inoculazione.) </li><li> Dopo aver posato tutte piantine, permettere loro di sedersi sul microcosmi orizzontale di Jensen, mentre la S. sospensioni di inoculo meliloti sono in preparazione. </li></ol> 5. Preparazione di S. meliloti inoculo Sospensioni <ol><li> Controllare S. meliloti culture periodicamente dopo l&#39;inoculazione per essere sicuri che stanno crescendo. Dopo 2 giorni di crescita, il diametro esterno 600 deve essere compresa tra 2 e 4. </li><li> Pipettare 0,5 ml di ogni cultura in una sterile provetta da 1,5 ml e centrifugare a pellet. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare le cellule due volte in entrambi 0,85% di acqua sterile di NaCl sterile o ultrapura. Risospendere le cellule in 0,5 ml 0,85% sterile NaCl o acqua ultrapura. </li><li> Misurare il diametro esterno 600 di una diluizione 1/10 di risospeso S. meliloti culture dal punto 5.3. Sulla base di questa lettura, fare una sospensione di ogni cultura in acqua ultrapura sterile a OD 600 = 0,05. Se la densità cellulare è troppo alta, nodulation può essere inibito. Fare abbastanza della sospensione diluita in modo che 100 ml possono essere inoculati su ogni piantina. La nuvolosità della OD 600 = 0.05 sospensione deve essere appena percettibile ad occhio. </li></ol> 6. Inoculazione e tenuta di Microcosmi <ol><li> Immediatamente prima di vaccinazioni iniziano, verificare la presenza di piantine avvizzite che non sono sopravvissuti al trasferimento di microcosmi medie del Jensen. Sostituire quelle piantine con piantine fresche da lastre di germinazione. </li><li> Aprire ogni microcosmo e inoculare 100 ml di adeguata S. meliloti sospensione sulla radice piantina. Riposizionare il coperchio e mettere da parte in stac orizzontaleks di 6-10 microcosmi. Per ogni S. ceppo meliloti da confrontare, inoculare almeno 15 piante. Per i ceppi che presentano sottili differenze di produttività simbiotico, inoculare 30-35 piante. Lasciare almeno 10 piante non inoculate come controllo negativo. Inoculare 30-35 piante con S. meliloti 1021 o altra appropriata ceppo selvatico per servire come controllo positivo. </li><li> Dopo la S. sospensione meliloti ha avuto il tempo di assorbire sulla superficie della radice e il liquido di sospensione ha inzuppato nel agar (almeno 20 min.), avvolgere ogni piatto singolarmente con film paraffina. Piastre devono essere avvolti fino al confine della tacca, ma il film paraffina non devono bloccare la crescita della piantina (Figura 4C). </li><li> Al momento del confezionamento, eseguire un controllo finale per radici attaccate alla parte interna del coperchio piastra. Per rimuovere le radici attaccate dal coperchio, porre la lastra piana in panchina e toccare o sfogliare il coperchio a bussare alla radice indietro sulla agar surface. </li><li> Allineare i portali piantine di ciascuna pila di 6-10 piatti. Posare lo stack ad un angolo di 90 ° con le piantine punta verso l&#39;alto (Figura 4D). La vischiosità del film paraffina terrà le piastre in luogo abbastanza a lungo per avvolgere l&#39;intero stack in un foglio, lasciando una striscia di 1-2 cm scartato dove le piantine emergono (Figura 4E). La pellicola protegge le radici dalla luce. </li><li> Inserire la pellicola avvolta stack in una camera di crescita illuminata o camera di crescita a 21-25 ° C, 60-70% di umidità relativa e 100-175 mmol / m -2 s -1 luce su un ciclo di buio 16 ore di luce / 8 ore ( Figura 1A). In queste condizioni di crescita, incubazione prolungato a livelli di luce maggiore di 200 pmol / m -2 s -1 può avere un effetto negativo sulla crescita delle piante. </li></ol> 7. Esame di Root Sistemi e quantitativa di simbiotiche fenotipi Le piante possono essere mantenuti inmicrocosmi fino a 9 settimane. <ol><li> Numero nodulo può essere quantificata in una serie di punti di sempre da scartare il foglio di ogni risma e contando noduli. Lo sviluppo di noduli sulle piante inoculate con S. meliloti 1021 tipo selvatico sono evidenti da 10-14 giorni dopo l&#39;inoculazione. </li><li> Produttività simbiotico può anche essere misurata ad ogni tempo misurando la lunghezza delle riprese emergente. </li><li> Quantificazione finale della produttività simbiotico viene di solito eseguita a 7 settimane dopo l&#39;inoculazione staccando il tiro e la misurazione del peso fresco del germoglio. Questa operazione può essere eseguita più tardi nove settimane se la crescita è più desiderato. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi del protocollo che sono fondamentali per il successo: 1) La necessità di usare purificato, pianta coltura cellulare testato agar non può essere sottovalutata. Questo non è critica per piantine di erba medica, ma è fondamentale per la crescita di M. truncatula A17. 2) E &#39;importante germinare piantine su piastre di agar verticali come descritto nella Fase 1. La tecnica ampiamente usata di germinazione piantine su una superficie orizzontale rovesciato in un piatto fondo 15 millimetri <...

L&#39;interazione tra la pianta ospite legume Medicago truncatula A17 e il batterio rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 è uno dei sistemi modello più trattabili per lo studio di radice sviluppo nodulo e azotofissatrice simbiosi. I genomi di entrambi i partner simbiotici sono stati sequenziati 1,2 e vegetali e batteri sono suscettibili di manipolazione genetica 3,4. Analisi dei fenotipi di vegetali e mutanti batterici richiede la capacità di osservare le fasi di sviluppo del nodulo e per quantificare la produttività simbiotico nel tempo. Qui si descrive un metodo per l&#39;osservazione dello sviluppo radicale nodulo di M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculati con S. meliloti 1021 all&#39;interno dei singoli microcosmi fatti dallo standard, rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piastre di laboratorio profondi (Figura 1A). La ripresa viene esposto e cresce attraverso un portale dentata sul lato della piastra (Figures 1B, 1C e 1E). Radici sono contenuti all&#39;interno dei microcosmi e mantenuti sterili, mentre permette l&#39;osservazione attraverso il coperchio della piastra (Figura 1D). Poiché il tiro è accessibile, la sua crescita non è vincolato e può essere misurata ad intervalli periodici senza compromettere la sterilità della radice. Il metodo di creazione di microcosmi dentellato-targa è stato originariamente sviluppato da Leigh, et ​​al. 5 per la coltivazione di piante di erba medica, ma non è stato largamente adottato a dispetto dei suoi numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi. Una variante di questo metodo è stato sviluppato anche per l&#39;analisi dell&#39;interazione tra le radici delle piante e micorrize 6. Abbiamo ora adattato e ottimizzato questo metodo per la crescita di M. piante truncatula. I vantaggi di questo protocollo oltre più comunemente utilizzati metodi sono descritti di seguito. Ci sono diversi metodi che sono attualmente in uso largo per gli studi nodulazione di M. truncatula inoculolata con S. meliloti 7. Il metodo più comunemente usato per la preparazione su larga scala di radici nodulated è la crescita in cassoni aeroponic 7. In questo metodo, le piante sono sospese su una grande nave e radici sono aerati con una miscela di S. meliloti e soluzione nutritiva 7. Questo metodo è pratico se solo un genotipo di S. meliloti è da testare. Poiché richiede aerosol di elevate concentrazioni di batteri, c&#39;è un&#39;alta probabilità di contaminazione incrociata tra cassoni inoculati con differenti ceppi batterici. Un altro metodo che viene spesso utilizzato per preparare grandi quantità di piante inoculate è la crescita in tini o in vasi di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata che sono infuso con soluzione nutritiva e inoculato con S. meliloti 7. Questo metodo richiede l&#39;utilizzo di vasche aperte o in vasi, e richiede irrigazione e la ricarica della soluzione nutritiva. Un altro svantaggio di pentole è che le piantedeve essere rimosso da questa matrice di particolato per l&#39;esame delle radici e noduli. Un altro inconveniente di questo metodo è che una vasta area di spazio incubatore è necessaria quando molti differenti S. genotipi meliloti devono essere confrontati, perché una pentola a parte deve essere utilizzato per ogni genotipo batterico. Il &quot;vaso Leonard&quot; è una variante di questo metodo di 8,9. Un vaso Leonard è composto di due vasi sterilizzati impilati uno sopra l&#39;altro e collegati da uno stoppino. Terreno di coltura viene inserito nel recipiente inferiore ed aspirata attraverso lo stoppino per capillarità in una matrice di crescita di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata nel recipiente superiore. La piantina (s) sono posti nella matrice crescita e inoculato con S. meliloti. Questo metodo non richiede irrigazione, ma l&#39;esame delle radici e noduli richiede che la piantina essere rimosso dalla matrice crescita particolato. Ci sono diversi metodi che consentono un facile esame della roots. Uno di questi è il transparent &quot;sacchetto di crescita&quot; plastica 7. Uno svantaggio di questo metodo è che l&#39;irrigazione frequente è necessaria poiché solo ≤ 10 ml di terreno liquido è ottimale per la crescita di M. truncatula in sacchetti 7. Esperimenti Pouch sono di solito limitati a ~ 2 settimane 7, grazie alla ripartizione dello stoppino di carta all&#39;interno del sacchetto. Altri due metodi comunemente utilizzati sono simili al nostro metodo dal fatto che le piante sono coltivate su agar e le radici sono visibili, ma questi metodi hanno anche svantaggi che la nostra procedura evita. In questi metodi, le piante sono completamente contenute all&#39;interno di 24,5 centimetri x 24,5 cm piastre di agar sigillate intorno alla parte superiore con del nastro adesivo chirurgico poroso o coltivate in tubi di agar-slant tappate con tappi di cotone o tappi di plastica 7. Entrambi questi metodi consentono un facile esame delle radici e può essere conservato sterile. Tuttavia, i tubi slant agar sono di solito coltivate con solo 20 ml di agar 7 e richiedono di acqua e nutrienti addition per la crescita a lungo termine delle piante. Le piante coltivate entro i 24,5 centimetri x 24,5 centimetri di agar microcosmi piastre hanno umidità e sostanze nutritive per la crescita a lungo termine sufficiente, ma il germoglio che cresce rapidamente diventa vincolati all&#39;interno del microcosmo piastra chiusa e il gas etilene possono accumularsi inibendo nodulazione 7. Nella procedura qui descritta, la ripresa è esposto e cresce liberamente al di fuori del microcosmo che contiene ~ 70 ml di mezzi di comunicazione, permettendo la crescita a lungo termine. La procedura descritta può essere utile non solo per lo studio di nodulation di piante leguminose, ma anche per lo studio dei fenotipi radici di altre piante di medie dimensioni. La differenza tra questi microcosmi e un tradizionale impianto policarbonato tessuto-cultura vaso è che radici nei microcosmi piastra qui descritti crescono sulla superficie verticale della agar piuttosto che verso il basso in uno strato orizzontale di agar al fondo del vaso. Questo permette la radice da sollevare dalla superficie agar con minima dAmage ai peli radicali e spessore ridotto agar alla superficie della radice, che facilita l&#39;esame dei peli radicali al microscopio.

<table><tbody><tr><td>Sigma</td><td>A7921</td><td></td> <td>purificato con agar e testato in coltura cellulare vegetale</td></tr></tbody></table>

singola pianta, sterili microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose<em&gt; medicago truncatula</em&gt; con il rhizobial symbiont<em&gt; sinorhizobium meliloti</em

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Batteri rhizobial formano simbiotici, noduli azoto-fissatori sulle radici delle piante leguminose host compatibili. Uno dei sistemi modello più ben sviluppati per lo studio di queste interazioni è la pianta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 e la rhizobial batterio Sinorhizobium meliloti 1021. L&#39;imaging ripetuta delle radici delle piante e punteggio della fenotipi simbiotici richiede metodi che non sono distruttive per piante o batteri. I fenotipi simbiotici di alcuni impianti e mutanti batterici si manifestano dopo periodi relativamente brevi di crescita, e non necessitano di osservazione a lungo termine delle interazioni ospite / simbionte. Tuttavia, sottili differenze di efficienza e di nodulo senescenza fenotipi simbiotici che non sono evidenti nelle prime fasi del processo di nodulazione richiedono periodi di crescita relativamente lunghi prima di poter essere segnato. Diversi metodi sono stati sviluppati per la crescita a lungo termine e l&#39;osservazione di questa coppia host / simbionte.Tuttavia, molti di questi metodi richiedono annaffiature ripetuto, che aumenta la possibilità di contaminazione da parte di altri microbi. Altri metodi richiedono uno spazio relativamente grande per la crescita di un gran numero di piante. Il metodo qui descritto, la crescita simbiotica di M. truncatula / S. meliloti in sterili, microcosmi singolo impianto, ha diversi vantaggi. Piante in questi microcosmi sono l&#39;umidità e le sostanze nutrienti sufficienti a garantire che l&#39;irrigazione non è richiesto per un massimo di nove settimane, impedendo la contaminazione incrociata durante l&#39;irrigazione. Questo permette di fenotipi da quantificare che potrebbero essere mancati in sistemi di crescita a breve termine, come i ritardi sottili nello sviluppo del nodulo e all&#39;inizio nodulo senescenza. Inoltre, le radici e noduli nel microcosmo vengono visualizzati facilmente attraverso il coperchio piatto, quindi non è necessario fino radicazione delle piante per l&#39;osservazione.

La preparazione e inoculazione di questi microcosmi piatto è relativamente semplice rispetto alla maggior parte degli altri metodi descritti nell&#39;introduzione. L&#39;uso di questi microcosmi consente anche la crescita delle piante prolungata (fino a 9 settimane) senza annaffiature o supplementazione dei nutrienti, la manutenzione di radice di sterilità, sia semplice esame delle radici e la protezione di radici dalla luce, la crescita incontrollata di germogli di piante, di facile accesso per le riprese misura della ...

Crescita delle piante truncatula Medicago in simbiosi con i batteri azoto-fissatori meliloti Sinorhizobium nei singoli, microcosmi sterili fatto da lastre di laboratorio standard consente l&#39;esame frequente dei sistemi di radici e noduli senza compromettere la sterilità. Le piante possono essere mantenuti in queste camere di crescita fino a 9 settimane.

Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Con il rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i fenotipi simbiotici delle piante di medic cargo Tula inoculate con diverse varianti mutanti del batterio fissatore di azoto sino oum me latte, utilizzando microcosmi sterili singoli realizzati con piastre da laboratorio standard. Questo viene ottenuto innanzitutto scarificando Mula, 17 semi con acido e germinando i semi su piastre di agar. Il secondo passaggio consiste nel preparare microcosmi sterili singoli utilizzando una spatola piegata e riscaldata per intaccare ogni piastra solidificata e il suo coperchio, chiudendo quindi la piastra.In seguito, lasceremo un foro ovale sul lato. Successivamente, posizionare singoli semenzali di Mula sui microcosmi con l'apice radicale a contatto con l'agar e con 0,5 centimetri della guida che sporge dalla tacca a U nella piastra. L'ultimo passaggio consiste nell'inoculazione con SME latte e nell'incubazione delle piastre sotto forma di pile avvolte nella pellicola in una camera di crescita illuminata.La quantificazione finale della lunghezza e del peso della parte aerea della pianta e del tipo di nodulo viene utilizzata per mostrare il relativo successo simbiotico di ciascun ceppo S milliot high o di un mutante ULA. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi che permettono un esame visivo continuo della crescita radicale, come le buste per la crescita e il sistema cason, è che il rischio di contaminazione incrociata tra piante inoculate con diversi ceppi di Cy Melo è molto ridotto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della simbiosi Zoia legum, come ad esempio il periodo temporale di sviluppo dei noduli radicali in piante mego trica inoculate con una collezione di ceppi s rosa Melodi che invadono le radici con efficienze diverse.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la costruzione dei microcosmi e il trasferimento delle piantine sono difficili da descrivere per iscritto. A supportarmi nella dimostrazione di questa procedura saranno Haji Mendez, uno studente laureato, e Clotilde Caru, una ricercatrice post-dottorato nel mio laboratorio. Questa procedura inizia con la sterilizzazione dell'aula M trunk. Per 17 semi mediante scarificazione acida, pesare innanzitutto un numero sufficiente di semi per ottenere il numero desiderato di piantine. Trasferire 17 semi, ciascuno di circa quattro milligrammi, in flaconi sterili da 125 millilitri provvisti di coperture in foglio sterile, quindi aggiungere con la pipetta 20 millilitri di acido solforico concentrato lungo la parete del flacone. L'aggiunta dell'acido lungo la parete del flacone consentirà di sterilizzare la superficie interna del flacone che verrà a contatto con i semi non sterilizzati.Separa i grumi di semi con una pipetta di vetro sterile. Agita ogni fiala frequentemente per 10-12 minuti. Appariranno piccole fossette marroni sui semi.Questi sono piccoli fori nel tegumento del seme quando almeno il 10% dei semi presenta piccole fossette marroni o sono trascorsi 12 minuti, a seconda di quale condizione si verifichi per prima; rimuovere tutto l'acido dal pallone con una pipetta di vetro sterile. Inclinare il pallone per raccogliere l'acido residuo nella curvatura del recipiente e utilizzare una pipetta di vetro piccola per rimuovere completamente l'acido rimanente. Sciacquare i semi versando rapidamente 100 millilitri di acqua ultrapura sterile in ciascun pallone. L'eccesso di volume d'acqua diluirà l'acido e preverrà il surriscaldamento e i danni ai semi durante la reazione tra l'acido e l'acqua; versare via l'acqua e sterilizzare a fiamma il bordo del pallone.Aggiungere 50 millilitri di acqua ultrapura sterile in ciascun matraccio e agitare delicatamente. Versare l'acqua, passare il bordo del matraccio alla fiamma. Aggiungere altri 50 millilitri di acqua ultrapura sterile e agitare in questo modo.Risciacquare i semi da otto a dieci volte dopo l'ultimo risciacquo. Versare 50 millilitri di acqua ultrapura sterile in ciascun matraccio e sostituire la pellicola sterile, quindi posizionare a quattro gradi Celsius al buio per tutta la notte. Per permettere l'imbibizione dei semi, il giorno seguente portare i due matracci in una cappa a flusso laminare sterile.Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare sterile poiché le spore di muffa presenti nell'aria sono i contaminanti più problematici. Versare via l'acqua da ogni fiasco e risciacquare due volte con circa 25 millilitri di acqua ultrapura. Dopo il secondo risciacquo, aggiungere 20 millilitri di acqua ultrapura sterile in ogni fiasco, agitare delicatamente per risospendere i semi e versare i semi in una piastra di germinazione con agar al 1,1-1,2%; agitare la piastra per distribuire uniformemente i semi.I semi devono essere distribuiti uniformemente in una fascia larga quattro-cinque centimetri. A un'estremità della piastra, questa sarà la parte superiore della piastra. Gli ultimi cinque-sei centimetri in basso devono rimanere liberi da semi.Aspirare l'acqua con una pipetta sterile. Inclinare la piastra ad un angolo di 45 gradi per 10-20 minuti per permettere all'acqua rimanente di defluire verso il fondo della piastra. Successivamente, rimuovere con una pipetta sterile tutta l'acqua raccoltasi sul fondo della piastra inclinata.Sostituire il coperchio e sigillare la piastra con param. Accatastare le piastre di germinazione e poi capovolgerle tutte. A un angolo di 90 gradi, i semi giaceranno sulla superficie verticale dell'agar.I semi completamente idratati dovrebbero aderire facilmente all'agar. Le radici cresceranno verso il basso. Avvolgere la pila di piastre per la germinazione nella stagnola per bloccare la luce e mantenere a 25 gradi Celsius per tre giorni.Per iniziare questa procedura, preparare il mezzo di Jenssen seguendo la ricetta e le istruzioni riportate nel manoscritto allegato. Dopo che il mezzo si è raffreddato, sono stati aggiunti i supplementi e ne è stato verificato il pH, iniziare a versare il mezzo in piastre rotonde di 100 millimetri di diametro e 15 millimetri di profondità.Le piastre devono essere versate a una profondità di circa 0,9-1 centimetro, utilizzando circa 70 millilitri di mezzo per piastra. Impilare le piastre durante il versamento per evitare la formazione di condensa sui coperchi.I componenti del mezzo di Jenssen possono formare un precipitato torbido, quindi è importante riportare periodicamente il becher sulla piastra magnetica di agitazione per evitare che i componenti si depositino. Dopo che le piastre di Jenssen si sono solidificate, sia le piastre che i coperchi devono essere intaccati con una spatola pesatrice piegata a forma di U. Riscaldare la curvatura della spatola con un becco Bunsen fino a quando non diventa incandescente, intaccare da cinque a sei piastre, quindi riscaldare nuovamente e intaccare di nuovo, procedendo anche con i coperchi delle piastre.Quando il coperchio scanalato viene posizionato sulla piastra scanalata, si formerà un'apertura ovale attraverso la quale lo stelo del germinello crescerà. Tre giorni dopo che i semi di Mula sono stati seminati per la germinazione come mostrato in precedenza, aprire una piastra di germinazione e inondarla immediatamente con acqua sterile ultrapura. Immergere le pinzette nell'etanolo e passarle brevemente alla fiamma per sterilizzarle.Utilizzare la pinzetta sterile per spingere delicatamente le punte radicali di tutte le piantine sotto l'acqua al fine di prevenire l'essiccamento; selezionare le piantine con radici dritte e prive di difetti evidenti. Controllare i coperchi dei microcosmi con mezzo di Jenssen per verificare l'accumulo di condensa. Rimuovere la condensa colpendo leggermente il coperchio con la pinzetta.Prelevare delicatamente una piantina dalla piastra di germinazione per i bordi e appoggiare la radice su un microcosmo di medio Jenssen. Assicurarsi che l'apice radicale sia a contatto con l'agar. Rimuovere delicatamente il tegumento del seme se è ancora presente. Sollevare con delicatezza il tegumento con la pinzetta finché non cede e scartare il rivestimento esterno e circa 0,5 centimetri del canale. La radichetta deve fuoriuscire dalla tacca ad U della piastra; posizionare attentamente il coperchio della piastra con la tacca ad U allineata sul germoglio, creando così un'apertura per il germoglio prima dell'inoculazione dei microcosmi. Le sospensioni inocue di latte sono preparate a partire da colture di S. mil. latte come descritto nel testo allegato.Ogni sospensione viene diluita in acqua ultrapura sterile fino a un OD 600 di 0,05 e l'opacità della sospensione dovrebbe essere appena percettibile ad occhio nudo. Aprire ogni microcosmo e inoculare 100 microlitri della sospensione di salvati appropriata sulla radice della piantina. Richiudere il coperchio e riporre in pile orizzontali di sei-dieci microcosmi per ogni ceppo SEL da confrontare.Inoculare almeno 15 piante per ceppi che presentano differenze sottili nella produttività simbiotica. Inoculare da 30 a 35 piante. Lasciare almeno 10 piante non inoculate come controllo negativo; inoculare da 30 a 35 piante con Esme Lata 1 0 2 1 o un altro ceppo selvatico appropriato da utilizzare come controllo positivo. Attendere almeno 20 minuti per consentire alla sospensione di Esme Lata di assorbirsi sulla superficie radicale e al liquido della sospensione di penetrare nell'agar. Avvolgere ogni piastra singolarmente con pellicola di paraffina; le piastre devono essere avvolte fino al bordo stesso dell'incavo, ma la pellicola di paraffina non deve ostacolare la crescita della piantina. Allineare i fori di uscita delle piantine per ogni pila composta da sei a dieci piastre.Posizionare la pila ad un angolo di 90 gradi con le piantine rivolte verso l'alto. L'adesività del film di paraffina manterrà le piastre in posizione abbastanza a lungo da permettere di avvolgere l'intera pila con della pellicola di alluminio, lasciando una striscia non avvolta di uno-due centimetri nel punto in cui emergono le piantine. Collocare le pile avvolte nella pellicola di alluminio in una camera di crescita illuminata o in un locale apposito regolati alle condizioni appropriate.Le piante possono essere mantenute in microcosmi fino a nove settimane. Il numero di noduli può essere quantificato in una serie di punti temporali rimuovendo la pellicola da ciascun stack e contando i noduli. I noduli in via di sviluppo sulle piante inoculate con il ceppo selvatico SME 1 0 2 1 sono evidenti da 10 a 14 giorni dopo l'inoculazione.La produttività simbiotica può essere misurata anche in ogni punto temporale misurando la lunghezza della guaina emergente. La quantificazione finale della produttività simbiotica viene generalmente effettuata sette settimane dopo l'inoculazione, staccando la guaina e misurando il peso fresco delle giovani piantine di mula. In questa foto sono mostrate piantine in crescita in microcosmi all'interno di un incubatore.Se imballati in modo compatto, più di 220 microcosmi possono essere posizionati su uno scaffale di incubatrice di 73,8 centimetri per 67,5 centimetri. Le prossime quattro immagini mostrano diverse viste di microcosmi contenenti Mula. Nel pannello A, 17 piante inoculate con il ceppo selvatico S. Malta 1 0 2 1, e nei pannelli B e C, microcosmi disposti in una pila avvolti in foglio di alluminio con piante che emergono dai portelli nei microcosmi.La lunghezza della parte aerea può essere misurata a partire dal punto di emergenza dal microcosmo senza disturbare la pianta. Il pannello D mostra un singolo microcosmo con la pellicola rimossa e le radici e i noduli visibili attraverso la parte anteriore della piastra. Il pannello E mostra lo stesso microcosmo disteso orizzontalmente, con la pianta che emerge dal foro presente nella piastra.La crescita nei microcosmi è ideale per raccogliere una serie di punti temporali relativi allo sviluppo dei noduli e alla lunghezza delle parti aeree. Questo grafico mostra i dati sulla lunghezza delle parti aeree per emran atula. 17 piante inoculate con il ceppo selvatico Es Malta 1 0 2 1 confrontate con piante non inoculate a sette settimane e nove settimane dall'inoculazione.Nove settimane dopo l'inoculazione, le parti aeree vengono recise per misurare il peso fresco delle parti aeree. Le piante non inoculate cessano di crescere, diventano gialle e le loro parti aeree raggiungono un peso di soli circa 0,01 grammi. Le piante inoculate con ceppi ssta che colonizzano Mula in modo più efficiente crescono più rapidamente e raggiungono un peso compreso tra 0,10 e 0,12 grammi a nove settimane dall'inoculazione.Questa figura mostra esempi di tre fenotipi simbiotici a sette settimane dall'inoculazione. La produttività simbiotica relativa delle piante MTR aula. A 17 inoculate con diversi ceppi di smeta viene quantificata in base alla lunghezza della parte aerea in centimetri, metri e al peso fresco della parte aerea in grammi.Gli asterischi sopra le barre dei trapianti indicano una differenza statisticamente significativa rispetto al ceppo di riferimento wild type 1 0 2 1 in un test T non appaiato. Il numero di noduli radicali sulle piante inoculate con questi ceppi è mostrato nel pannello C. Un colore rosa indica che i noduli sono funzionali e capaci di fissazione dell'azoto, mentre i noduli bianchi piccoli sono solitamente non funzionali e i noduli marroni sono senescenti e necrotici. I confronti mostrati in questa figura hanno dimostrato che la produttività simbiotica delle piante M trunk aula A 17 inoculate con SML Lavati 1 0 2 1 portanti il plasmide P-S-T-B-L-A FFR five XOY, che sovraesprime la fosfogalattosio fosfotransferasi del ceppo parentale XOY ecop, è maggiore rispetto a quella del ceppo wild type S me 1 0 2 1 e dei ceppi portanti il plasmide di controllo negativo P-S-T-B-L-A-F-R five.Questi ceppi con sovraespressione di oxy producono una maggiore quantità del glicano del polisaccaride esocellulare simbiotico SAG rispetto ai ceppi di controllo. La capacità di quantificare le differenze nei fenotipi simbiotici, che richiedono diverse settimane per manifestarsi, rappresenta un vantaggio notevole di questo metodo per tutte le misurazioni della produttività simbiotica. Su MTR Aula A 17, i ceppi Sano Zoia Medicaid WSM 4 1 9 e ABS sette mostrano prestazioni migliori rispetto alle piante Smeta 1 0 2 1 inoculate con un mutante nullo XO YN cinque che non produce alcun suc e O-glicano, i cui fusti hanno lunghezza e peso fresco simili a quelli delle piante non inoculate e formano solo noduli inefficaci al momento in cui il microcosmo viene smontato e vengono misurati i pesi freschi delle parti aeree, che possono anche essere rimosse.Per l'acquisizione di immagini rappresentative del tronco di M. trunk atula. In questa figura sono mostrate 17 radici dopo il prelievo dai microcosmi. I pannelli A e B mostrano immagini a 10 giorni dall'inoculazione, mentre il pannello C mostra un'immagine a 14 giorni dall'inoculazione; la barra in ciascuna immagine corrisponde a 100 micron.Le radici mostrate in figura sono state inoculate con il ceppo selvatico smeta 1 0 2 1, un ceppo di smeta portatore di una fusione egg-C Gus e un ceppo di smeta portatore della fusione SMC 0 0 9 1 1 Gus. Nel pannello C, la colorazione Gus delle cellule STI che portano la fusione SMC 0 0 9 1 1 Gus è visibile sui peli radicali e sulla superficie della radice. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre la radice della piantina a contatto con l'agar.Altri metodi come la sezione trasversale e la colorazione dei noduli, nonché la preparazione di RNA totale da radici e noduli, possono essere eseguiti per analizzare le differenze anatomiche, fisiologiche ed espressive dei geni associate a ciascun fenotipo simbiotico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come allestire microcosmi sterili singoli per pianta al fine di osservare la simbiosi tra Mego Tula Sino Rosa Melo, inclusa la germinazione dei semi, la preparazione del microcosmo e l'inoculazione delle piantine.

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Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose Medicago truncatula Con il rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti (Video) | JoVE Journal

Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose

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