La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare il livello di migrazione dei neutrofili attraverso una barriera epiteliale della vescica durante l'infezione batterica o in risposta a molecole chemio-attrattive. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule epiteliali della vescica in coltura fino alla confluenza su supporti permeabili. Il secondo passo consiste nell'infettare le cellule epiteliali della vescica con vari batteri o applicare molecole chemio-attrattive al serbatoio inferiore dei supporti permeabili.

Successivamente, i neutrofili vengono isolati dal sangue venoso e vengono applicati al serbatoio superiore dei supporti permeabili. Il passaggio finale consiste nell'enumerare il numero di neutrofili nel serbatoio inferiore dopo un'ora utilizzando un emocitometro. In definitiva, il saggio di migrazione dei neutrofili epiteliale trans uro viene utilizzato per valutare le differenze nella migrazione dei neutrofili indotta da vari stimoli.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli aspetti della risposta immunitaria innata durante l'infezione del tratto urinario, può anche essere utilizzato per studiare altre malattie, comprese le infezioni batteriche che si verificano su altre superfici mucose. Eseguire questa procedura in un cappuccio per coltura tissutale utilizzando una tecnica settica utilizzando una pinza sterile. Capovolgere i supporti permeabili in una piastra sterile di coltura tissutale profonda 25 millimetri.

Per risultati ottimali, utilizzare 5 6 3 7 cellule epiteliali della vescica che hanno subito meno di 10 sottocolture di tripsina oculare. Un pallone di 75 centimetri quadrati di 5, 6, 3, 7 celle al 95% di confluenza secondo il testo scritto. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, risospendere delicatamente le cellule in circa due millilitri di RPMI più una concentrazione di 3 milioni di cellule per millilitro determinata dal conteggio delle cellule.

Utilizzando un emocitometro, applicare 50 microlitri di sospensione cellulare su ciascun supporto permeabile senza toccare la membrana. Metti il coperchio sul piatto e posiziona con cura il piatto a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per non più di 16 ore. Utilizzo di pinze sterili.

Scrivere i supporti permeabili in una piastra a 24 pozzetti contenente 0,6 millilitri di RPMI plus per. Aggiungere 0,1 millilitri di RPMI plus al serbatoio superiore di ciascun supporto permeabile prima di incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Sostituire il terreno ogni due giorni aspirando il terreno dal serbatoio superiore, seguito dal serbatoio inferiore.

Quindi applicare il nuovo RPMI plus nell'ordine inverso, aggiungendo 0,6 millilitri al serbatoio inferiore e poi 0,1 millilitri al serbatoio superiore. Sette giorni dopo la semina i supporti permeabili con 5, 6, 3, 7 cellule. Valutare la confluenza delle cellule riempiendo il serbatoio superiore con 0,35 millilitri di RPMI.

Inoltre, le celle sono sufficientemente confluenti quando il mezzo non si equilibra tra i serbatoi superiore e inferiore. Preparare l'inoculo batterico e raccogliere il sangue da volontari adulti come descritto nel protocollo di testo in una cappa di coltura tissutale. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire delicatamente il sangue in una provetta conica fresca sterile da 50 millilitri.

Aggiungere una quantità equivalente di destrano al 3% in cloruro di sodio allo 0,9%. Incubare la provetta in posizione verticale a temperatura ambiente per 20 minuti senza interrompere lo strato inferiore. Aspirare con cura lo strato superiore e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.

Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 volte G per 10 minuti dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in un volume di cloruro di sodio allo 0,9% equivalente al volume iniziale di sangue. Quindi stendere 10 millilitri di soluzione di centrifugazione per densità sotto la sospensione cellulare.

Preservando l'interfaccia tra le due fasi, centrifugare a 400 volte G per 30 minuti senza interruzioni prima di scartare il surnatante per eliminare i globuli rossi rimanenti. Risalire, sospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di cloruro di sodio freddo allo 0,2% dopo aver incubato per 30 secondi, aggiungere prontamente 10 millilitri di cloruro di sodio freddo all'1,6% per ripristinare l'isotonicità, pellettare le cellule mediante centrifugazione a 300 volte G per sei minuti e scartare il surnatante. Ripetere questi passaggi fino a quando il pellet cellulare non sembra essere privo di globuli rossi.

In genere tre cicli di lisi utilizzando una pipetta da 1000 microlitri. Sospendere il pellet cellulare, principalmente leucociti polimorfonucleati o PMN, in RPMI caldo meno a una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro come determinato dal conteggio delle cellule. Utilizzando un emocitometro, mantenere le cellule a 37 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Tipicamente, la vitalità e la purezza del pm n sono superiori al 99%, come valutato rispettivamente dall'esclusione del trian blue e dalla visualizzazione della morfologia nucleare dopo la colorazione. Per il saggio di migrazione, utilizzare solo supporti permeabili con confluente. 5, 6, 3, 7 strati cellulari.

Eloqua un millilitro di RPMI caldo meno per pozzetto. In una piastra a 24 pozzetti, preparando tre pozzetti per supporto permeabile, aspirare il terreno dai serbatoi superiore e inferiore dei supporti permeabili utilizzando una pinza sterile. Trasferire i supporti permeabili sulla piastra a 24 pozzetti, lavare i supporti permeabili tre volte trasferendoli da un pozzetto all'altro.

Se si desidera utilizzare un inoculo batterico, capovolgere i supporti permeabili in una piastra sterile di coltura tissutale profonda 25 millimetri. Per esperimenti con stimoli batterici vivi o uccisi, inoculare il lato apicale di ciascun supporto permeabile con 60 microlitri di RPMI per una finta infezione o con l'inoculo batterico preparato. Metti il coperchio sul piatto e incuba a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per un'ora.

Quindi aggiungere 0,6 millilitri di RPMI meno per pozzetto a una piastra di attacco bassa da 24 pozzetti. Preparare un pozzetto per ogni supporto permeabile. Preparare tre pozzetti contenenti 0,5 millilitri di RPMI meno per enumerare l'input PMN.

In alternativa, se viene utilizzato un chemio-attrattivo al posto dei batteri, aggiungere il chemio-attrattivo a 0,6 millilitri di RPMI meno nella piastra a 24 pozzetti preparata. Il passo successivo per entrambi gli esperimenti è quello di scrivere i supporti permeabili nella piastra di attacco bassa a 24 pozzetti. Quindi aggiungere 0,1 millilitri del PMN preparato nel serbatoio superiore di ciascun supporto permeabile.

Aggiungere 0,1 millilitri di PMN direttamente nei pozzetti contenenti 0,5 millilitri di RPMI meno incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per un'ora. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri. Sciacquare la parte inferiore della membrana del supporto permeabile con il terreno dal serbatoio inferiore utilizzando una pinza sterile, raschiare delicatamente la membrana contro il bordo del pozzetto.

Per rimuovere ulteriore PMN dal lato apicale, raccogliere il PMN raschiando delicatamente il fondo di ciascun pozzetto con il puntale della pipetta da 1000 microlitri. E il trasferimento delle sospensioni PMN su tubi micro fuge. Enumerare il PMN utilizzando un emocitometro per calcolare il numero totale di PMN nel serbatoio inferiore.

Moltiplica il numero di PMN in un millimetro quadrato per 6.000. I dati possono essere riportati come percentuale del PMN di input o quando i numeri PMN si normalizzano da 10 al sesto. L'adesione del PMN al protocollo delineato in questo video con attenzione ai dettagli consente l'enumerazione della migrazione del PMN in risposta agli stimoli, tra cui l'infezione da batteri e sostanze chemio-attrattive con il ceppo non patogeno di e coli MG 1655.

Il calore ha ucciso MG 1655 o un mutante PEC suscita significativamente più migrazione di pm n rispetto a un'infezione simulata o all'infezione con il ceppo pec di tipo selvatico UTI 89 un isolato di cistite. L'aggiunta di chemioattrattivi, FMLF o IL otto al serbatoio inferiore si traduce in una quantità significativamente maggiore di PM e migrazione rispetto al trattamento simulato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la migrazione dei neutrofili attraverso una barriera epiteliale in risposta a stimoli chemiotattici.