Name: Istituzione di un modello chirurgicamente indotta nei topi per indagare il ruolo protettivo di progranulina in osteoartrite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri il modello chirurgico DMM nei topi per studiare l'osteoartrite e il ruolo protettivo della progranulina. Questo metodo permette di valutare la progressione della malattia mediante analisi istopatologiche e punteggi MANKIN.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH borse di ricerca R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, e una malattia mirata Research Grant da Rheumatology Research Foundation (a CJ Liu).

Tutte le procedure chirurgiche relative agli animali devono essere approvati dalla cura degli animali e Comitato Etico della Istituzione locale, con uno sforzo fatto per ridurre al minimo il dolore e il disagio causato da un intervento chirurgico. 1. Preparazione <ol><li> Selezionare 8-12 settimane maschio C57BL / 6 topi con un peso corporeo di circa 25 g per la chirurgia. </li><li> Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di un cocktail contenente sia xilazina (5 mg / kg) e ketamina (40 mg / kg). </li><li> Shave il ginocchio con rasoi, quindi chirurgicamente drappo l&#39;animale e sterilizzare il sito chirurgico con Betadine e alcool (3x) e coprire gli occhi del mouse con unguento. </li></ol> 2. Processo chirurgico <ol><li> Fare un 1 centimetro longitudinale mediale para-rotulea incisione per esporre ginocchio. </li><li> Aprire il ginocchio dolcemente attraverso dislocazione laterale della rotula e del legamento rotuleo. <ol><li> Tagliare la capsula articolare del ginocchio longitudinalmenteattraverso l&#39;incisione mediale para-rotulea nel passo 2.1. </li><li> Sezionare capsula articolare del ginocchio con una pinza. </li><li> Afferra la parte distale del posteriore zampa con la mano sinistra, ed eseguire dislocazione laterale della rotula e del legamento rotuleo con una pinza. Tenere la zampa posteriore delicatamente e fare in modo di evitare traumi nella zampa. La migliore è la capsula articolare è sezionato, la forza di meno sarà necessario per rendere la dislocazione. </li></ol></li><li> Gocciolare salina sterile sulla superficie della cartilagine articolare durante il funzionamento per evitare l&#39;essiccamento su superficie cartilaginea. </li><li> Tagliare il legamento mediale meniscotibial che àncora menisco mediale al piatto tibiale. Evitare lesioni della cartilagine sotto il menisco mediale. <ol><li> Identificare il menisco mediale che individua tra condilo mediale del femore e plateau mediale della tibia. </li><li> Identificare il legamento meniscotibial che collega parte laterale del menisco mediale con eminenza intercondiloidea della tibia. </li><li> Tenere il hind zampa delicatamente con la mano, e tagliare il legamento mediale meniscotibial accuratamente utilizzando una lama chirurgica No. 10. Assicurarsi di non provocare ferire alla cartilagine articolare e di altri legamenti. In molti casi, il cuscinetto di grasso che copre deve essere tirato verso il lato ma non deve essere rimosso al fine di identificare il legamento. </li></ol></li><li> Chiudere la capsula articolare del ginocchio con una sutura assorbibile 6-0. </li><li> Chiudere la pelle con 6-0 sutura in seta. </li></ol> 3. Assistenza post-operatoria <ol><li> Applicare una goccia di 0,25% bupivacaina nel sito chirurgico di ogni mouse per minimizzare il dolore post-operatorio. </li><li> Lasciare i topi operati gratuitamente per ottenere acqua e cibo. </li></ol> 4. Segnare istologica di DMM chirurgico Modello <ol><li> Sacrifica il mouse nei punti indicati tempo (ad esempio 4 settimane, 8 settimane e 12 settimane. Qui abbiamo mostrato i risultati di 8 settimane come rappresentante) dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> L&#39;intero articolazioni del ginocchio sono fissi, decalcificata, embedded da paraffina e poi sezionati in serie a intervalli di 5 micron. <ol><li> Tagliare l&#39;intero arti posteriori con n ° 10 lame. </li><li> Sezionare la pelle ed i muscoli degli arti posteriori con attenzione, e fissare i campioni con PFA 4% per 3 giorni in RT. </li><li> Rimuovere il PFA, e pulire i campioni con acqua. Successivamente, disincrostare i campioni in EDTA a 4 ° C per 2 settimane. </li><li> Disidratare i campioni in un gradiente di etanolo. In dettaglio, mantenere i campioni in etanolo al 70% per 1 ora, quindi modificare l&#39;etanolo e conservare i campioni in una nuova serie di etanolo al 70% per O / N. Successivamente, mettere i campioni a 80% e 90% etanolo conseguenza, e tenerli per 1 ora, rispettivamente, seguito da 100% di etanolo per O / N. </li><li> Rimuovere l&#39;etanolo. Conservare i campioni in oxylene per 1 ora, e passare a una nuova serie di oxylene. Ripetere questa operazione 3 volte. </li><li> Incorporare i campioni in uno stampo di paraffina utilizzando il centro incorporamento Leica. Successivamente, i campioni sono sezionati a 5 micron utilizzando un microtomo rotativo (Leica RM2255, Germania) e poi raccolte su vetrini. </li><li> Sezioni sagittali seriali sono tagliati per ogni campione attraversa una regione dal centro del condilo laterale al centro del condilo mediale. </li></ol></li><li> Viene eseguita safranina O colorazione, seguita da scoring e analisi statistiche mediante sistema di punteggio OARSI come descritto in precedenza 25. <ol><li> Primo, Deparaffinare i vetrini in oxylene, e li idratare in un gradiente di etanolo all&#39;acqua distillata. Successivamente, si procede alla colorazione attraverso Ferro soluzione ematossilina di Weigert, 0,05% Verde veloce (FCF) Soluzione, 1% Acido acetico soluzione, e 0,1% safranina O Solution. Montare i vetrini con mezzo resinoso. </li><li> Punteggio ottenuto i vetrini colorati safranina O basati sulla perdita di proteoglicani (colore rosso) nella cartilagine e la percentuale di distruzione nella struttura della cartilagine, fare analisi statistica per il punteggio istologico. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Siamo qui dichiarare che non abbiamo alcun conflitto di interessi.

È stato riferito che il ceppo di topi è molto importante per il modello DMM induzione, come diversi ceppi di topi sono meno gravi di OA dopo DMM, con livello più alto nel ceppo 129/SvEv, seguita da C57BL6, 129/SvInJ e poi FVB / n 26. Una gran parte di transgeni sono stabiliti nei topi C57BL6, come PGRN-/ - mice che abbiamo usato in questo studio, che sono relativamente sensibili alla DMM. Tuttavia, se il transgene si riferiscono al ceppo insensibile come FVB / n topi, è necessario backcross questi topi con ce...

L&#39;osteoartrite (OA), noto anche come l&#39;artrite degenerativa, colpisce il 15% della popolazione mondiale e più di 46 milioni di persone negli Stati Uniti, ed è caratterizzata da sinovite, degenerazione della cartilagine, e la formazione di osteofiti 1. Può essere il risultato di una complessa interazione di fattori genetici, metabolici, biomeccanici e biochimici. I meccanismi alla base di OA continuare a sottrarsi alla comunità scientifica. Attualmente ci sono numerosi modelli animali che possono mimare la patogenesi dell&#39;OA 2,3. È importante stabilire modelli animali nei topi a causa sia della disponibilità di vari topi geneticamente modificati e la convenienza di sperimentazione. Tra i diversi tipi di modelli OA sperimentali, la destabilizzazione indotta chirurgicamente del menisco mediale (DMM) è un modello ben accettato OA per la sua buona riproducibilità e una progressione relativamente più lenta durante lo sviluppo OA. Entrambi questi attributi hannostato fondamentale per la valutazione della progressione OA in differenti trattamenti o transgeni 3-8. Tuttavia, la consistenza del modello OA chirurgica è influenzata da diversi fattori durante l&#39;intervento chirurgico e, di conseguenza, l&#39;applicazione del modello chirurgica topo è limitato. Progranulin (PGRN) è un fattore di crescita multi-funzionale espressa in varie cellule. E &#39;noto che PGRN gioca un ruolo critico in vari processi fisiologici e malattie come la guarigione delle ferite 9, tumorigenesi 10, 11-15 e infiammazione. Studi hanno anche dimostrato che l&#39;insufficienza di PGRN può causare malattie degenerative del sistema nervoso sia in esseri umani e topi 16-18. E &#39;noto che PGRN è espresso nella cartilagine articolare umana, e il suo livello è significativamente elevato nella cartilagine di pazienti con OA e artrite reumatoide 19. Inoltre, PGRN gioca un ruolo cruciale nella proliferazione di condrociti 20, differenziazione e endochondralossificazione della cartilagine di accrescimento durante lo sviluppo 21,22. Recentemente, abbiamo riportato che PGRN antagonized TNF-α attraverso il legame a recettori TNF ed espone una funzione anti-infiammatoria in modelli di artrite infiammatoria 13,14,23,24. Tuttavia, il ruolo di PGRN in OA, specialmente in vivo, resta un enigma. Qui, vi presentiamo la procedura di indurre un modello DMM chirurgico, e indagare il ruolo della PGRN nello sviluppo OA attraverso la creazione del modello DMM in WT e PGRN-/ - mice.

<table><tbody><tr><td>N. 10 lame chirurgiche</td><td>Feather</td><td>25-2976#10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura</td><td>Applied Dental</td><td>WG-N53133</td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di un modello chirurgicamente indotta nei topi per indagare il ruolo protettivo di progranulina in osteoartrite

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Destabilizzazione del menisco mediale (DMM), il modello è uno strumento importante per studiare i ruoli fisiopatologici di numerosi artrite molecole associate nella patogenesi dell&#39;osteoartrosi (OA) in vivo. Tuttavia, il dettaglio, in particolare il protocollo visualizzato per la creazione di questo modello complicato nei topi, non è disponibile. Qui abbiamo approfittato di tipo selvatico e progranulin (PGRN) - / - mice come esempi di introdurre un protocollo per indurre il modello DMM nei topi, e confrontato l&#39;insorgenza di OA in seguito all&#39;istituzione di questo modello indotta chirurgicamente. Le operazioni eseguite su topi erano o operazione simulata, che ha appena aperto capsula articolare, o il funzionamento DMM, che ha tagliato il legamento menisco-tibiale e ha causato la destabilizzazione del menisco mediale. Artrosi gravità è stata valutata utilizzando test istologico (ad es safranina O colorazione), espressioni di geni OA-associati, la degradazione della cartilagine molecole della matrice extracellulare, e osteofiti formazione. Funzionamento DMM indotto successo OA iniziazione e la progressione sia di tipo selvatico e PGRN-/ - mice, e la perdita del fattore di crescita PGNR portato ad una più grave fenotipo OA in questo modello indotta chirurgicamente.

Modello DMM è stato istituito con successo nei topi, e la carenza di PGRN esagerato sviluppo OA chirurgicamente indotto. Operazioni fittizie e DMM (Figura 1) sono stati eseguiti in WT e PGRN-/ - mice. 8 settimane dopo l&#39;operazione, i topi sono stati sacrificati, e safranina O colorazione è stata eseguita su sezioni di articolazioni del ginocchio, seguito da analisi statistica del punteggio artrite basata sulla istologia. Come mostrato in Figura 2...

Descriviamo un protocollo per la destabilizzazione del menisco mediale (DMM) modello nei topi, uno strumento efficace per l&#39;osteoartrite (OA) la ricerca. Inoltre, abbiamo dimostrato che la carenza di progranulincan esagerata sviluppo OA e progressione utilizzando questo modello, indicando che progranulin svolge un ruolo protettivo nella patogenesi di OA.

Istituzione di un modello chirurgicamente indotta nei topi per indagare il ruolo protettivo di progranulina in osteoartrite

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un modello di DMM nei topi e studiare l'insorgenza dell'osteoartrite dopo l'intervento chirurgico di DMM. Dopo aver preparato gli animali, si esegue un'incisione mediale para-rotulea longitudinale di un centimetro per esporre l'articolazione del ginocchio. Successivamente, si disseca la capsula articolare e si pratica una lussazione mediale del ginocchio.L'ultimo passaggio consiste nel recidere il legamento tibiale del menisco mediale e suturare il ginocchio. Alla fine, analisi istopatologiche vengono utilizzate per mostrare la distruzione della struttura articolare, nonché la perdita di protido, glicano e la presenza di artrosi. La gravità viene valutata mediante punteggi MANKIN di colorazione con safranina e o.Generalmente, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà a meno che non abbiano visto l'intervento chirurgico eseguito nei topi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché i passaggi dettagliati sono difficili da apprendere e attualmente vengono eseguiti al microscopio, ogni struttura dell'articolazione del ginocchio deve essere chiaramente riconoscibile.Per stabilire questo modello, preparare la destabilizzazione del menisco mediale o intervento chirurgico DMM anestetizzando un topo maschio C57 Black Six di otto-dodici settimane di età e del peso di circa 25 grammi. Applicare quindi un unguento oftalmico sugli occhi dopo aver rasato l'area intorno al ginocchio. Sterilizzare la zona con Betadine e alcol per tre volte e coprire chirurgicamente l'area.Iniziare l'intervento chirurgico praticando un'incisione longitudinale mediale para-rotulea di un centimetro per esporre l'articolazione del ginocchio. Successivamente, tagliare con attenzione la capsula articolare del ginocchio in senso longitudinale attraverso l'incisione para-rotulea mediale fino a esporre il femore. Poi, utilizzare la pinzetta per allentare la struttura capsulare allargando e approfondendo il taglio.Afferrare delicatamente la parte distale della zampa posteriore con una mano. Utilizzare una pinza per eseguire una lussazione laterale della rotula e del legamento rotuleo. La lussazione non dovrebbe richiedere molta forza se la capsula articolare è stata recisa longitudinalmente. Gocciolare soluzione salina sterile sulla superficie della cartilagine articolare per tutto il resto dell'intervento chirurgico per evitare che si secchi.Ora identificare il menisco mediale, situato tra il condilo mediale del femore e la piastra mediale della tibia. Se necessario, spostare lateralmente il cuscinetto adiposo che ricopre il legamento tibiale del menisco per esporre il legamento tibiale del menisco, che collega il lato laterale del menisco mediale all'eminenza intercondiloidea della tibia. Tenere delicatamente la zampa posteriore con una mano.Eseguire l'intervento chirurgico DMM tagliando con attenzione il legamento tibiale del menisco mediale mediante una lama chirurgica numero 10. Accertarsi di non danneggiare la cartilagine articolare né altri legamenti. Successivamente, chiudere la capsula articolare del ginocchio con una sutura riassorbibile a sei punti e chiudere la cute con una sutura in seta a sei punti.Per ridurre al minimo il dolore postoperatorio, somministrare un'iniezione sottocutanea di 10 milligrammi per chilogrammo di meloxicam e restituire il topo alla gabbia dopo che l'anestesia si è dissipata. Alcune settimane dopo l'intervento, sacrificare il topo ed asportare entrami gli arti posteriori con una lama numero 10. Successivamente, dissezionare con attenzione la pelle e i muscoli dall'arto posteriore e fissare il campione in paraformaldeide al 4% per tre giorni a temperatura ambiente.Dopo tre giorni, rimuovere il paraformaldeide e lavare i campioni con acqua distillata per tre minuti. Successivamente, decalcificare i campioni in EDTA a quattro gradi Celsius per due settimane. Trascorse due settimane, disidratare i campioni in un gradiente di etanolo.Dopo aver rimosso l'etanolo finale, mettere i campioni in tre bagni di Lene per un'ora ciascuno. Successivamente, incorporare i campioni in uno stampo di paraffina. Utilizzare un microtomo rotativo per ottenere sezioni di cinque micron e raccogliere le sezioni su un vetrino.Continuare a tagliare sezioni sagittali seriali dal centro del condilo laterale fino al centro del condilo mediale per eseguire la colorazione con safranina e o. Prima, disparaffinare i vetrini in xilene per tre-cinque minuti, ripetendo il bagno in xilene due volte.Quindi idratare i vetrini in un gradiente di etanolo fino ad arrivare all'acqua distillata. Successivamente immergere i vetrini nella soluzione di ematina ferrosa di Weigert, in una soluzione di verde brillante allo 0,05%, in una soluzione di acido acetico all'1% e in una soluzione di saffrano e O allo 0,1%. Ora montare i vetrini utilizzando un mezzo resinoso e valutare i vetrini colorati con saffrano e O in base alla perdita del colore rosso dei proteoglicani nella cartilagine e in base alla percentuale di distruzione della struttura cartilaginea.Quindi eseguire l'analisi statistica utilizzando il sistema di punteggio istologico O-A-R-S-I. Queste immagini mostrano articolazioni del ginocchio con colorazione al saffrano e all'O in topi di tipo selvaggio e topi knock-out per PG rrn otto settimane dopo un intervento fittizio o una chirurgia DMM. Non si osserva una degenerazione evidente della cartilagine in nessuno dei due genotipi dopo un intervento fittizio.Tuttavia, otto settimane dopo un intervento di DMM, si osserva una perdita di proteoglicani, evidenziata dalla riduzione del colore rosso nella cartilagine, nonché una distruzione della struttura cartilaginea indicata dalle frecce rosse sia nei topi di tipo selvaggio che nei topi knockout per PGRN, dimostrando l'induzione efficace di un fenotipo osteoartrosico. Dopo l'intervento chirurgico DMM, il confronto dei punteggi di osteoartrite tra topi di tipo selvaggio e topi knockout per PGRN mostra un punteggio significativamente più elevato nei topi knockout, dimostrando che la perdita di PGRN determina un fenotipo di osteoartrite più grave.Questa tecnica può essere eseguita in 10-15 minuti se effettuata correttamente. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'operazione DMM in massa.

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