Name: Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri l'analisi non invasiva della muscolatura scheletrica in larve di Danio rerio mediante birifrangenza e saggi di fuga evocati dal tatto. Questi metodi permettono di valutare l'organizzazione miofibrillare e le risposte locomotorie in vivo.

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Ringraziamo Behzad Moghadaszadeh per il suo meraviglioso aiuto con la quantificazione delle immagini di birifrangenza. Questo lavoro è stato finanziato dalla Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) e dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345), oltre al generoso sostegno di A Foundation Building Strength, Cure CMD e AUism Charitable Foundation. VAG è supportato da K01 AR062601 del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, e LLS è supportato da F31 NS081928 del National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

1. Analisi in vivo della struttura del muscolo scheletrico mediante birifrangenza
<ol>
	<li>Prepara le gabbie di accoppiamento che separano i maschi dalle femmine della linea o delle linee di pesce zebra desiderate nel tardo pomeriggio dopo l'alimentazione.
	<ol>
		<li>Distingui le femmine dal ventre più grande e dalla leggera colorazione blu/bianca, e i maschi dalla forma del corpo snella e dalle sfumature rosa/gialle.</li>
		<li>Il successo con gli incroci a coppie (un maschio e una femmina) può essere solo del 50% circa. Per un tasso di successo più elevato, accoppia un maschio con 2-3 femmine.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rimuovete i divisori della gabbia la mattina successiva, poco dopo l'inizio della luce, e lasciate che il pesce si riproduca indisturbato.</li>
	<li>Raccogli le uova usando un colino quando un numero sufficiente di uova fecondate è deposto sul fondo della vasca.</li>
	<li>Trasferisci gli embrioni in una capsula di Petri profonda sciacquando il colino con acqua di pesce e rimetti i pesci genitori nelle loro vasche. Mettere i piatti di embrioni in un'incubatrice a 28,5 °C.</li>
	<li>Pulisci le uova e i detriti inviabili più tardi quel giorno o la mattina seguente e rimetti gli embrioni nell'incubatrice per un'ulteriore crescita.</li>
	<li>Gli embrioni/larve raggiungono l'età appropriata per osservare la birifrangenza a 3-7 giorni dopo la fecondazione (dpf), poiché i risultati precedenti al 3 dpf possono potenzialmente soffrire di un contrasto limitato. Gli embrioni wild-type si schiudono dai loro corioni tra le 48 e le 60 ore dopo la fecondazione (hpf), seguita da un raddrizzamento dell'asse del corpo. Gli embrioni selvatici o mutanti a schiusa tardiva possono richiedere la decorionazione manuale.
	<ol>
		<li>Fai delicatamente uno strappo nel corion con una pinza affilata e capovolgilo in modo che l'embrione cada.</li>
		<li>Lasciare raddrizzare gli embrioni dechorionati prima di iniziare il test.</li>
		<li>Anestetizzare gli embrioni con tricaina (0,04% nell'acqua di pesce) per facilitare il loro corretto posizionamento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montare un microscopio da dissezione con una lente polarizzata che può essere ruotata per regolare l'angolo della luce polarizzata (Figura 1A).</li>
	<li>Posizionare gli embrioni dechorionati e anestetizzati direttamente sopra una seconda lente polarizzata lungo l'asse laterale del corpo. La seconda lente deve essere posizionata sotto la lente superiore, sul tavolino del microscopio (Figura 1B). Non utilizzare piastre di Petri in plastica in nessun momento durante il test di birifrangenza, poiché la plastica non è un mezzo appropriato per la trasmissione della luce rifratta.</li>
	<li>Ruotare la lente superiore con l'embrione di interesse in vista fino a quando gli assi di polarizzazione delle due lenti sono orientati a 90° l'uno dall'altro e lo sfondo è completamente scuro.</li>
	<li>L'output ottimale del test dipende dall'orientamento del pesce tra due lenti polarizzate. Sposta i pesci per assicurarti che siano sdraiati il più distesi possibile.
	<ol>
		<li>Se il pesce è curvo, solo i segmenti con questo orientamento piatto passeranno la luce polarizzata e mostreranno birifrangenza. In tali casi, misurare la birifrangenza nelle aree pianeggianti e registrare la birifrangenza dell'area corrispondente nei pesci selvatici (ad esempio somiti 1-10 sia nei pesci selvatici che nei pesci mutanti).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osservare il fenotipo birifrangente del pesce.
	<ol>
		<li>I pesci selvatici con muscolo scheletrico altamente organizzato mostrano una birifrangenza brillante, poiché l'indice di rifrazione per la luce parallela ai miofilamenti è superiore alla luce polarizzata perpendicolare a queste strutture.</li>
		<li>I pesci con muscolo scheletrico disorganizzato, suggestivo di una miopatia non degenerativa o di un difetto dello sviluppo, mostrano tipicamente una riduzione complessiva della birifrangenza.</li>
		<li>I pesci con muscolo scheletrico disorganizzato, caratteristico di una distrofia muscolare, mostrano comunemente un modello di birifrangenza simile a una macchia, con aree scure che rappresentano la degenerazione muscolare tra le aree luminose della normale architettura muscolare.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Quantifica la birifrangenza scattando immagini di pesci selvatici e mutanti sotto luce polarizzata con le stesse impostazioni di esposizione e ingrandimento. Salva le immagini come file .tiff.
	<ol>
		<li>Apri le immagini di birifrangenza nel software ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Per ogni immagine, seleziona l'area del muscolo del pesce zebra disegnando una linea attorno al corpo utilizzando l'opzione "Selezioni poligonali" dalla barra degli strumenti.</li>
		<li>Utilizzare "Imposta misure" nel menu a discesa "Analizza" per selezionare le statistiche richieste per l'immagine.
		<ol>
			<li>La selezione minima richiede che le caselle "Area", "Valore medio di grigio" e "Valore minimo e massimo di grigio" siano selezionate.</li>
			<li>Un valore massimo di grigio di >255 indicherà la saturazione dei pixel. Pertanto, utilizzare immagini con valori di grigio massimi inferiori a 255.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Normalizzare l'intensità media con l'area selezionata e ripetere la stessa procedura di quantificazione per ogni immagine di birifrangenza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Saggio del comportamento di fuga evocato dal tocco
<ol>
	<li>Prepara le coppie di accoppiamento delle linee di pesce zebra appropriate e raccogli gli embrioni come descritto sopra nei passaggi 1.1-1.5.</li>
	<li>A 2-7 giorni dalla fecondazione, posizionare gli embrioni/larve dechorionati singolarmente in una capsula di Petri profonda o nelle camere delle piastre multipozzetto.</li>
	<li>Lavorando con un solo embrione alla volta, centrare l'embrione nel campo visivo di uno stereomicroscopio Nikon SMZ1500 con un sistema di fotocamera digitale SPOT RT3 o simile e iniziare l'imaging sequenziale.
	<ol>
		<li>La stessa frequenza di imaging dovrebbe essere utilizzata sia per i pesci selvatici che per quelli mutanti. Si consigliano frame rate >30 Hz, poiché in genere non sono sufficienti per catturare il nuoto veloce dei pesci selvatici.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fornire stimoli meccanosensoriali all'embrione toccando la coda con uno spillo da insetto.</li>
	<li>Interrompi l'imaging quando l'embrione ha smesso di nuotare o ha nuotato fuori dal campo visivo.</li>
	<li>Converti immagini sequenziali in un file video o analizza singoli fotogrammi di immagini time-lapse off-line, utilizzando il software SPOT 5.1 Advanced. Pacchetti software simili includono Open Lab, NIS Elements o ImageJ disponibile gratuitamente (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
	<li>Quantificare il comportamento di nuoto eseguendo la risposta evocata dal tatto in più embrioni.
	<ol>
		<li>Ciò può essere ottenuto calcolando la media della distanza in cui gli embrioni sono in grado di nuotare entro un intervallo di tempo fisso utilizzando un software o un righello metrico per contrassegnare i punti di inizio e fine dell'incontro di nuoto.</li>
		<li>Evita che gli embrioni si abituino allo stimolo tattile nel tempo eseguendo il test con un nuovo embrione per ogni ripetizione sperimentale. I comportamenti nei modelli mutanti wild-type e affidabili tendono ad essere altamente riproducibili.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

I disturbi neuromuscolari primari sono tradizionalmente classificati come processi distrofici o non distrofici. Le distrofie muscolari sono caratterizzate da degenerazione delle miofibre seguita da ripetuti cicli di rigenerazione, che alla fine porta a un processo allo stadio terminale caratterizzato da fibrosi e sostituzione con tessuto adiposo14. Le miopatie non distrofiche, al contrario, non sono associate a necrosi o cambiamenti rigenerativi, ma provocano miofibre disorganizzate e debolezza generale del mu...

<table><tbody><tr><td>Tricaina </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Spillo per insetti</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Lenti polarizzate</td><td>Ritz Camera</td><td>Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Fischer Incubatore scientifico</td><td>Isotemp Modello 630D</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments Inc.</td>Strumenti diagnostici <td>per telecamere SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Inc.</td><td>Software di imaging SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Strumenti diagnostici Inc.</td><td>SPOT 5.1 Avanzato</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale zebrafish da birifrangenza e touch-evocare fuga risposta saggi

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

I pesci zebra (Danio rerio) sono diventati uno strumento particolarmente efficace per modellare le malattie umane che colpiscono il muscolo scheletrico, comprese le distrofie muscolari1-3, le miopatie congenite4,5 e le interruzioni nell'assemblaggio sarcomerico6,7, a causa dell'elevata conservazione genomica e strutturale con i mammiferi8. La disorganizzazione muscolare e la compromissione della locomotiva possono essere rapidamente valutate nel pesce zebra nei primi giorni dopo la fecondazione. Due saggi per aiutare a caratterizzare i difetti del muscolo scheletrico nel pesce zebra sono la birifrangenza (strutturale) e la risposta di fuga evocata dal tatto (comportamentale).
La birifrangenza è una proprietà fisica in cui la luce viene ruotata mentre passa attraverso la materia ordinata, come la matrice pseudo-cristallina dei sarcomeri muscolari9. Si tratta di un approccio semplice e non invasivo per valutare l'integrità muscolare nelle larve di zebrafish traslucide all'inizio dello sviluppo. I pesci zebra wild-type con muscoli scheletrici altamente organizzati appaiono molto luminosi in mezzo a uno sfondo scuro quando vengono visualizzati tra due filtri di luce polarizzati, mentre i mutanti muscolari hanno modelli di birifrangenza specifici per il disturbo muscolare primario che modellano. Le distrofie muscolari modellate da zebrafish, malattie caratterizzate da degenerazione delle miofibre seguite da ripetuti cicli di rigenerazione, mostrano macchie scure degenerative nel muscolo scheletrico sotto luce polarizzata. Le miopatie non distrofiche non sono associate a necrosi o alterazioni rigenerative, ma provocano miofibre disorganizzate e debolezza muscolare scheletrica. Il pesce zebra miopatico mostra tipicamente una riduzione complessiva della birifrangenza, riflettendo la disorganizzazione dei sarcomeri.
Il saggio di fuga evocato dal tatto prevede l'osservazione del comportamento di nuoto di un embrione in risposta alla stimolazione tattile10-12. Rispetto alle larve wild-type, le larve mutanti mostrano spesso una debole contrazione di fuga, seguita da un nuoto lento o da un altro tipo di movimento alterato che non riesce a spingere le larve più di una breve distanza12. Il vantaggio di questi saggi è che la progressione della malattia nello stesso tipo di pesce può essere monitorata in vivo per diversi giorni e che un gran numero di pesci può essere analizzato in breve tempo rispetto ai vertebrati superiori.

La birifrangenza può essere utilizzata come un saggio efficiente e non invasivo per analizzare lo stato dell'organizzazione dei miofibrilli in embrioni di pesce zebra vivi. Vengono presentati esempi di pesce zebra selvatico, nonché di pesce zebra con espressione ridotta di geni fondamentali per lo sviluppo e la funzione del muscolo scheletrico. Il pesce zebra selvatico a 5 dpf mostra muscoli scheletrici altamente birifrangenti in luce polarizzata, a causa dell'ordinata disposizione dei miofilamenti (Figure 2A-B</...

Il pesce zebra è ora uno strumento consolidato e potente per modellare distrofie muscolari, miopatie congenite e malattie neuromuscolari correlate. La birifrangenza e il comportamento di fuga evocato dal tatto sono due comuni test non invasivi utilizzati per determinare il grado di disorganizzazione muscolare e compromissione locomotiva degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo precoce.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il grado di organizzazione dei miofibrilli nei larve traslucide di pesce zebra e quantificare la loro distanza di nuoto in risposta a stimolazione tattile per entrambi i metodi. Questo viene realizzato innanzitutto accoppiando i pesci zebra e successivamente raccogliendo uova vitali nel secondo passaggio del saggio per valutare la struttura muscolare. Un embrione di pesce zebra anestetizzato e ricoperto viene posizionato direttamente tra due lenti polarizzate su un microscopio stereoscopico in modo che il pesce sia orientato lungo l'asse laterale del suo corpo e in un'orientazione il più possibile piatta.La birifrangenza viene quindi visualizzata e l'integrità muscolare viene quantificata. Nel secondo passaggio del saggio di fuga indotto dal tocco, una singola larva rivestita viene posizionata in una capsula di Petri profonda e quindi centrata nel campo visivo del microscopio stereoscopico. Uno stimolo sensoriale meccanico viene somministrato alle larve toccando la coda con un ago per insetti, e la reazione dell'animale viene registrata fino a quando l'embrione smette di nuotare o esce dal campo visivo.In definitiva, le differenze

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Questo video descrive il test di risposta all'evocazione tattile, che misura la risposta della larva di pesce zebra agli stimoli tattili.

Escape Response Assay: un metodo per studiare la risposta della larva di zebrafish agli stimoli tattili

Il video descrive l'evitamento e il test della tigmotassi delle larve di pesce zebra. Il video esamina il comportamento delle larve di pesce zebra in risposta a uno stimolo visivo avversivo.

Saggio di evitamento e tigmotassi del pesce zebra: un metodo ad alto rendimento per esaminare il comportamento larvale in risposta a uno stimolo visivo avversivo

Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

Misure di forza possono essere utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella funzione muscolare a causa di sviluppo, infortunio, malattia, trattamento o tossicità chimica. In questo video, dimostriamo un metodo per misurare la forza durante una contrazione massimale di zebrafish muscolare tronco larvale.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Presentiamo un metodo per l'analisi elettroretinografica (ERG) delle larve di zebrafish utilizzando tecniche di micromanipolazione ed elettroretinografia. Questo è un metodo semplice e diretto per saggiare la funzione visiva delle larve di zebrafish in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra.  Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

I pesci zebra sono un modello eccellente per studiare la funzione muscolare e le malattie. Durante l'embriogenesi precoce, il pesce zebra inizia contrazioni muscolari regolari producendo un comportamento ritmico di nuoto, che viene alterato quando il muscolo viene interrotto. Qui descriviamo una risposta evocata al tatto e un saggio di locomozione per esaminare le prestazioni di nuoto come misura della funzione muscolare.

Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la caratterizzazione di un modello di epilessia zebrafish derivante dall'inibizione transitoria del gene DEPDC5.

Analisi comportamentale e fisiologica in un modello di zebrafish di epilessia

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

Scopri l'analisi non invasiva della muscolatura scheletrica in larve di Danio rerio mediante birifrangenza e saggi di fuga evocati dal tatto. Questi metodi permettono di valutare l'organizzazione miofibrillare e le risposte locomotorie in vivo.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

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