Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il grado di organizzazione dei miofibrilli nei larve traslucide di pesce zebra e quantificare la loro distanza di nuoto in risposta a stimolazione tattile per entrambi i metodi. Questo viene realizzato innanzitutto accoppiando i pesci zebra e successivamente raccogliendo uova vitali nel secondo passaggio del saggio per valutare la struttura muscolare. Un embrione di pesce zebra anestetizzato e ricoperto viene posizionato direttamente tra due lenti polarizzate su un microscopio stereoscopico in modo che il pesce sia orientato lungo l'asse laterale del suo corpo e in un'orientazione il più possibile piatta.

La birifrangenza viene quindi visualizzata e l'integrità muscolare viene quantificata. Nel secondo passaggio del saggio di fuga indotto dal tocco, una singola larva rivestita viene posizionata in una capsula di Petri profonda e quindi centrata nel campo visivo del microscopio stereoscopico. Uno stimolo sensoriale meccanico viene somministrato alle larve toccando la coda con un ago per insetti, e la reazione dell'animale viene registrata fino a quando l'embrione smette di nuotare o esce dal campo visivo.

In definitiva, le differenze nell'organizzazione muscolare e nelle risposte locomotorie possono essere quantificate. I principali vantaggi di queste tecniche non invasive sono che un elevato numero di pesci può essere analizzato rapidamente e i difetti del muscolo scheletrico nello stesso pesce possono essere monitorati in vivo per diversi giorni. Le dimostrazioni visive del posizionamento delle lenti polarizzate e del corretto orientamento delle larve sono fondamentali per garantire il successo.

Con questi saggi, rimuovere le uova non vitali da tutte le covate raccolte da pesci adulti accoppiati. Queste appaiono generalmente bianche e opache ad occhio nudo, oppure come un ammasso di cellule scure e disorganizzate al microscopio; reinserire quindi gli embrioni nell'incubatrice per una crescita ulteriore da tre a sette giorni dopo la fecondazione. Se l'embrione di interesse è ancora all'interno della coriona, utilizzare un paio di pinzette affilate per praticare delicatamente una piccola lacerazione nella coriona dell'embrione di interesse, quindi capovolgerlo in modo che l'embrione ne cada fuori.

Anestetizzare gli embrioni rivestiti con trica per facilitarne il posizionamento corretto, quindi dotare un microscopio stereoscopico di una lente polarizzata che possa essere ruotata per regolare l'angolo della luce polarizzata. Una volta che gli embrioni si sono raddrizzati, posizionare una seconda lente polarizzata sul piatto del microscopio direttamente al di sotto della lente superiore e collocare gli embrioni direttamente sopra la seconda lente. Ciascun embrione di interesse dovrà quindi essere posizionato lungo l'asse laterale del proprio corpo.

Ruotare la lente superiore con l'embrione di interesse in vista fino a quando l'asse di polarizzazione delle due lenti è orientato a 90 gradi l'uno rispetto all'altro e lo sfondo è completamente scuro. Spostare il pesce per assicurarsi che giaccia il più piatto possibile. Se un pesce è curvo, solo i segmenti con orientamento piatto lasceranno passare la luce polarizzata e mostreranno il frt.

Ora, osservare il fenotipo di birifrangenza dei pesci di tipo selvatico. I muscoli scheletrici altamente organizzati mostrano una marcata birifrangenza poiché l'indice di rifrazione della luce parallela ai filamenti miici è superiore a quello della luce polarizzata perpendicolare a queste strutture. I pesci con muscolatura scheletrica disorganizzata, indicativa di una miopatia neurodegenerativa o di un difetto dello sviluppo, mostrano tipicamente una riduzione complessiva della birifrangenza nei pesci con muscolatura scheletrica disorganizzata.

Caratteristico della distrofia muscolare. Presentano comunemente un modello a chiazze di birifrangenza, con aree scure che rappresentano la degenerazione muscolare tra aree luminose di architettura muscolare normale. Acquisire immagini del pesce in luce polarizzata per la quantificazione della birifrangenza.

Salvare le immagini come file tiff. Aprire le immagini di birifrangenza in un programma di elaborazione delle immagini. Se si utilizza ImageJ, come mostrato qui, per ogni immagine utilizzare innanzitutto lo strumento di selezione poligonale per tracciare una linea attorno al corpo del pesce, definendo così l'area del muscolo del pesce zebra su cui effettuare le misurazioni.

Quindi, nel menu a discesa Analizza, scegliere Imposta misurazioni per selezionare le statistiche richieste per l'immagine. Selezionare le caselle per area, valore medio di grigio e valore minimo e massimo di grigio per impostare il test del comportamento di fuga evocato dal tocco da due a sette giorni dopo la fecondazione. Posizionare individualmente i pesci rivestiti di interesse in piatti di Petri profondi, lavorando con un solo embrione alla volta.

Centrare il pesce nel campo visivo di un microscopio stereoscopico dotato di un sistema di videocamera digitale e iniziare l'acquisizione sequenziale di immagini utilizzando una frequenza di acquisizione maggiore o uguale a 30 hertz. Successivamente, utilizzando un ago per insetti, toccare la coda dell'embrione per somministrare lo stimolo sensoriale meno, interrompendo l'acquisizione quando l'embrione ha smesso di nuotare o è uscito dal campo visivo. Infine, convertire le immagini sequenziali in un file video oppure analizzare i singoli fotogrammi delle immagini in time-lapse.

La birifrangenza offline può essere utilizzata come un saggio non invasivo ed efficiente per analizzare lo stato dell'organizzazione dei miofibrilli negli embrioni di pesce zebra vivi. I pesci zebra di tipo selvatico a cinque giorni post-fecondazione mostrano muscoli scheletrici altamente ordinati in luce polarizzata, grazie alla disposizione regolare dei loro miofilamenti. Al contrario, embrioni della stessa età omozigoti per una mutazione patogena nel gene distroglicano o DAG1 mostrano una birifrangenza irregolare, indicativa di aree di degenerazione muscolare. Questo modello a chiazze e la rapida progressione della degenerazione muscolare durante lo sviluppo precoce sono coerenti con altri modelli di pesce distrofico.

La quantificazione della birifrangenza a cinque giorni post-fecondazione nei mutanti distrofici DAG1 rivela una riduzione significativa della luminosità al 27,9 ± 5,3% della birifrangenza massima osservata nei loro fratelli di tipo selvatico. Questa riduzione è più grave rispetto al calo al 52,4 ± 5,5% osservato a tre giorni post-fecondazione nei modelli di pesce miopatici mtm1. I modelli di pesce miopatici tendono invece a mostrare una riduzione complessiva della birifrangenza rispetto al tipo selvatico, poiché spesso si riscontra una disorganizzazione dei miofibrilli nei principali muscoli scheletrici assiali, ma non vi è evidenza di cambiamenti degenerativi. Comportamenti di fuga indotti da stimolazione tattile possono essere utilizzati per dimostrare che i modelli di zebrafish di malattie del muscolo scheletrico presentano difetti locomotori e difficoltà di nuoto.

Questo primo video mostra un saggio del comportamento di fuga evocato dal tocco su zebrafish di tipo selvatico. Osservare come, a cinque giorni dalla fecondazione, i normali avannotti nuotino via molto rapidamente. In risposta al tocco, in questo secondo video, è stato registrato il comportamento di fuga evocato dal tocco negli avannotti del primo giorno.

Si noti come gli embrioni mutanti al quinto giorno post-fecondazione mostrino una risposta compromessa al tocco e non riescano a uscire dal campo visivo dopo la stimolazione. I video sono stati quindi analizzati fotogramma per fotogramma per confermare che i mutanti DAG uno presentano un movimento compromesso rispetto ai controlli di tipo selvatico in risposta a stimoli tattili. Le distanze percorse da entrambi i tipi di embrioni entro un intervallo di tempo fisso sono state mediate e indicano una funzione motoria ridotta nei mutanti DAG uno.

Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere eseguite su grandi quantità di pesci in un breve periodo di tempo, il che è fondamentale quando si conducono schermate ad alto rendimento di sostanze chimiche o mutagenesi. Dopo questa procedura, è possibile adottare approcci più invasivi, come l'immunohistochimica o la microscopia elettronica, per studiare i difetti del muscolo scheletrico a livelli molecolari e strutturali.