Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come In Vitro Trauma cranico modello della barriera ematoencefalica

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso della lesione da stiramento come modello di lesione cerebrale traumatica. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule endoteliali microvascolari speculari e i pozzetti dei fondi flessibili. Il secondo passo consiste nel differenziare le cellule mediante riduzione del siero fetale di vitello nel terreno di coltura.

Successivamente, le cellule vengono ferite utilizzando il dispositivo di barella cellulare. Il passo finale consiste nel valutare il grado di lesione nelle cellule. In definitiva, la lesione indotta da stiramento nelle cellule endoteliali cerebrali viene utilizzata per mostrare lesioni nella barriera emato-encefalica in vitro.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della lesione cerebrale traumatica perché modella l'impatto effettivo che si verifica durante il trauma cranico nella barriera emato-encefalica utilizzando la lesione da stiramento delle cellule endoteliali cerebrali marine. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Elaine Salvador, una postdoc del mio laboratorio. Iniziare questa procedura coltivando le cellule endoteliali microvascolari del cervello marino in un pallone di coltura T 75.

Cambiare il fluido due volte a settimana fino a raggiungere la confluenza. Quindi, lavare le celle con PBS. Quindi rimuovere il PBS e i tryps.

Anizzare le cellule con due millilitri di soluzione calda di tryin EDTA. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando lo strato cellulare non si disperde. Dopodiché, a otto millilitri di terreno di coltura nelle cellule, picchiettare più volte il pallone per staccare le cellule.

Visualizzare le cellule al microscopio per garantire il completo distacco dal pallone. Quindi pipettare il terreno con le cellule staccate su e giù. Agitare il pallone per mescolare la sospensione cellulare in seguito.

Aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare in un emocitometro e contare il numero di cellule. Determinare la densità cellulare e vedere 20.000 cellule per centimetro quadrato nel pozzetto. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in collagene.

Uno sei precodificato. Piastre di coltura con fondo ben flessibili in un volume totale di tre millilitri per pozzetto. Cambiare il terreno di coltura due volte a settimana e far crescere le cellule a 37 gradi Celsius per una settimana fino a quando non diventano confluenti.

Per la differenziazione cellulare, cambiare il terreno di coltura delle cellule con il mezzo di differenziazione e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore. In questa procedura, accendere il dispositivo di controllo delle lesioni cellulari, impostare il ritardo su 50 millisecondi. Quindi, impostare la pressione del regolatore su 15 PSI e premere il grilletto un paio di volte fino a quando la pressione di picco registrata non diventa stabile.

Quindi impostare la pressione del regolatore sul valore desiderato. Successivamente, posizionare la piastra di coltura a sei fondi ben flessibili nel supporto del vassoio. Assicurarsi che il selettore del pozzetto sia impostato sulla dimensione corretta del pozzetto.

Quindi posizionare saldamente la spina dell'adattatore sopra il, tenere bene la spina saldamente in posizione con una mano con l'altra mano che preme il grilletto per registrare la pressione di picco generata in seguito. Rimettere immediatamente la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per il periodo di tempo desiderato, oppure utilizzarla immediatamente per esperimenti o valutazioni successive per valutare la lesione da stiramento mediante saggio di captazione DI. Subito dopo, le cellule vengono allungate a 30 microlitri di milligrammo per millilitro della colorazione di vitalità che funge da marcatore di citotossicità per il terreno di coltura cellulare.

Valutare la lesione da allungamento mediante rilascio di lattato deidrogenasi. Dopo l'allungamento, le cellule rimuovono immediatamente 200 microlitri di terreno di coltura cellulare dal, beh, fai lo stesso per ogni punto temporale post-infortunio che vorresti includere nella tua indagine sul rilascio di LDH. Quindi, centrifugare il terreno di coltura cellulare all'impostazione massima di una microcentrifuga per cinque minuti.

Per rimuovere eventuali detriti cellulari, rimuovere il surnatante e utilizzarlo per i passaggi successivi. Una volta prelevati i campioni necessari da vari punti temporali, lisare le cellule utilizzando la soluzione di lisi inclusa nel kit di analisi LDH. Successivamente, aggiungere 100 microlitri del terreno di coltura incluso nel kit di analisi a ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti fornita nel kit.

Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare privo di cellule in due pozzetti paralleli del 96. Pozzetti, la piastra, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti e leggere l'assorbanza a 492 nanometri. Qui è mostrato l'esame al microscopio ottico della normalità contro le cellule lesionate.

Il normale monostrato di celle a confluenza non allungate è strettamente impacchettato e allungato quando le celle vengono allungate applicando un impulso di pressione di picco da 1,8 a 2,0 PSI, appaiono meno compatte. Quando le cellule sono moderatamente danneggiate con un impulso di pressione di picco da 2,5 a 3,0, alcune di esse appaiono gonfie e deformate. Le cellule si retraggono con un grave allungamento da 3,5 a 4,5 PSI.

Ecco l'esame microscopico a fluorescenza delle cellule normali contro quelle danneggiate. Le cellule sono state trattate con una colorazione di vitalità due ore dopo la lesione. Queste sono le cellule di controllo non allungate, le cellule moderatamente allungate e le cellule gravemente allungate.

Questa figura mostra il rilascio dell'enzima LDH nella trappola dopo la lesione da stiramento che LDH ha rilasciato nella coltura. Il terreno è stato misurato a vari intervalli di tempo dopo la lesione indotta dall'allungamento ed è stato espresso come percentuale del totale di L-D-H-L-D-H rilasciabile rilasciato da cellule sottoposte a stretching basso e moderato. Non differivano in modo significativo da quello dei controlli non allungati e l'uno dall'altro.

Le cellule che sono state gravemente allungate hanno rilasciato una quantità significativamente maggiore di LDH rispetto a tutti gli altri campioni, ad eccezione del campione moderatamente allungato a un'ora dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare le lesioni cerebrali traumatiche nelle cellule endoteliali cerebrali marine in vitro.