Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'utilizzo della lesione da stiramento come modello di lesione cerebrale traumatica. Ciò viene ottenuto innanzitutto coltivando cellule endoteliali microvascolari su pozzetti con fondi flessibili, che fungono da modello. Il secondo passaggio consiste nel differenziare le cellule riducendo il siero di vitello fetale nel mezzo di coltura.

Successivamente, le cellule vengono danneggiate utilizzando il dispositivo distensore cellulare. L'ultimo passaggio consiste nel valutare il grado di danno nelle cellule. In definitiva, il danno indotto da stiramento nelle cellule endoteliali cerebrali viene utilizzato per dimostrare il danno alla barriera emato-encefalica in vitro.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle lesioni cerebrali traumatiche poiché modella l'impatto reale che si verifica durante il TBI nella barriera emato-encefalica, utilizzando una lesione da stiramento di cellule endoteliali cerebrali marine. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Elaine Salvador, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Iniziare questa procedura coltivando le cellule endoteliali microvascolari cerebrali marine in un flacone da coltura T 75.

Cambiare il mezzo due volte alla settimana fino al raggiungimento della confluenza. Successivamente, lavare le cellule con PBS. Poi rimuovere il PBS e la tripsina.

Incubare le cellule con due millilitri di soluzione calda di tripsina-EDTA. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando lo strato cellulare non è disperso. Successivamente, aggiungere otto millilitri di mezzo di coltura alle cellule e battere leggermente il flacone più volte per staccare le cellule.

Esaminare le cellule al microscopio per verificare il distacco completo dalla fiala. Quindi aspirare e rilasciare il mezzo con le cellule distaccate su e giù con la pipetta. Ruotare la fiala per mescolare successivamente la sospensione cellulare.

Aggiungere 20 microlitri della sospensione cellulare in un emocitometro e contare il numero di cellule. Determinare la densità cellulare e seminare 20.000 cellule per centimetro quadrato nel pozzetto. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare nel collagene.

Una piastra per colture con sei pozzetti pre-codificati e fondo flessibile, con un volume totale di tre millilitri per pozzetto. Cambiare il mezzo di coltura due volte alla settimana e coltivare le cellule a 37 gradi Celsius per una settimana fino a confluenza.

Per la differenziazione cellulare, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di differenziazione e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore. In questa procedura, accendere il dispositivo di controllo del danno cellulare e impostare il ritardo a 50 millisecondi. Successivamente, impostare la pressione del regolatore a 15 PSI e premere l'interruttore alcune volte finché la pressione massima registrata non diventa stabile.

Quindi impostare la pressione del regolatore sul valore desiderato. Successivamente, posizionare la piastra colturale a sei pozzetti con fondi flessibili nel supporto del vassoio. Assicurarsi che il selettore dei pozzetti sia impostato sulla dimensione corretta dei pozzetti.

Quindi posizionare saldamente l'adattatore sul connettore, tenendo bene fermo il connettore con una mano mentre con l'altra si preme il grilletto per registrare la pressione di picco generata. Rimettere immediatamente la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato, oppure utilizzarla immediatamente per esperimenti successivi o valutazioni, al fine di valutare il danno da stiramento mediante saggio di assorbimento DI. Immediatamente dopo che le cellule sono state stirate, aggiungere 30 microlitri di un colorante vitalizio da un milligrammo per millilitro al mezzo di coltura cellulare, che funge da marcatore di citotossicità.

Per valutare il danno da stiramento mediante il rilascio di lattato deidrogenasi. Dopo lo stiramento, prelevare immediatamente 200 microlitri di mezzo di coltura cellulare dal pozzetto, ripetendo l'operazione per ciascun punto temporale post-lesione che si desidera includere nello studio del rilascio di LDH. Successivamente, centrifugare il mezzo di coltura cellulare al massimo regime di una microcentrifuga per cinque minuti.

Per rimuovere eventuali detriti cellulari, eliminare il sopranatante e utilizzarlo per i passaggi successivi. Una volta prelevati i campioni necessari dai diversi punti temporali, lisare le cellule utilizzando la soluzione di lisi inclusa nel kit per il saggio LDH. Successivamente, aggiungere 100 microlitri del mezzo di saggio incluso nel kit in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fornita nel kit.

Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo di coltura cellulare acellulare in due pozzetti paralleli della piastra a 96 pozzetti, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti e leggere l'assorbanza a 492 nanometri. Qui è mostrata l'esame al microscopio ottico di cellule normali rispetto a cellule danneggiate.

Il monolayer cellulare normale a confluenza, non stirato, è strettamente impacchettato ed allungato; quando le cellule vengono stirate applicando un impulso di pressione massima compresa tra 1,8 e 2,0 PSI, appaiono meno compatte. Quando le cellule sono moderatamente danneggiate da un impulso di pressione massima compreso tra 2,5 e 3,0 PSI, alcune appaiono gonfie e deformate. Le cellule diventano retratte in seguito a uno stiramento severo compreso tra 3,5 e 4,5 PSI.

Ecco l'esame microscopico in fluorescenza di cellule normali rispetto a cellule danneggiate. Le cellule sono state trattate con un colorante di vitalità due ore dopo il danno. Queste sono le cellule di controllo non stirate, le cellule stirate in modo moderato e le cellule stirate in modo severo.

Questa figura mostra il rilascio dell'enzima LDH nel mezzo di coltura dopo una lesione da stiramento. Il LDH rilasciato nel mezzo di coltura è stato misurato a diversi intervalli di tempo successivi alla lesione indotta da stiramento ed è stato espresso come percentuale del totale di L-D-H-L-D-H rilasciabile dalle cellule sottoposte a stiramento lieve e moderato. Non ha mostrato differenze significative rispetto ai controlli non stirati e tra loro.

Le cellule gravemente allungate hanno rilasciato una quantità significativamente maggiore di LDH rispetto a tutti gli altri campioni, ad eccezione del campione moderatamente allungato a un'ora dopo il trattamento. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per studiare il danno cerebrale traumatico nelle cellule endoteliali cerebrali marine in vitro.