Name: In situ TEM di assemblee biologiche in liquido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Scopri l'imaging TEM in situ di complessi virali in liquido con risoluzione nanometrica. Questo metodo con microchip al nitruro di silicio e superfici di cattura affinità permette di osservare i comportamenti dinamici delle particelle di rotavirus.

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Gli autori riconoscono il Dr. Michael J. Friedlander, direttore del Virginia Tech Carilion Research Institute per aver incoraggiato i nostri sforzi di ricerca. Questo progetto è stato sostenuto da fondi di sviluppo per S.M.M e D.F.K. e in parte dall'iniziativa Nano-Bio dell'Institute for Critical Technology and Applied Science di Virginia Tech.

1. Preparare i dispositivi di acquisizioneaffinità 16
<ol><li>Pulire gli E-chips di nitruro di silicio incubandoli in 15 ml di acetone per 2 minuti seguiti da 15 ml di metanolo per 2 min(Figura 1A). Lasciare asciugare i trucioli sotto il flusso d'aria laminare.</li>
	<li>Incubare i trucioli essiccati su una piastra di agitazione riscaldata (senza mescolare) per 1,5 ore a 150 °C, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Utilizzare siringhe Hamilton per comporre miscele lipidiche in piccoli tubi di vetro per contenere il 25% di cloroformio, 55% DLPC (1,2-dilauroil-fosfocolina) in cloroformio (1 mg/ml) e 20% lipide Ni-NTA (1,2-dioleoil-iminodiacetico acido-succinil-nichel sale) in cloroformio (1 mg/ml) per un volume totale di 40 μl.</li>
	<li>Applicare un'aliquota di 1 μl della miscela su ogni goccia di 15 μl di acqua Milli-Q su un pezzo di Parafilm in una piastra di Petri umida (Figura 1B). Incubare campioni sul ghiaccio per almeno 60 minuti.</li>
</ol>2. Cattura macromolecole17
<ol><li>Posizionare un E-chip con un distanziale integrato di 150 nm sopra un campione monostrato e incubare per 1 min(Figura 1C).</li>
	<li>Sollevare delicatamente il truciolo dal campione e aggiungere un'aliquota di 3 μl di proteina A. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente(Figura 1D).</li>
	<li>Asciugare la goccia in eccesso usando Whatman #1 carta da filtro e aggiungere immediatamente un'aliquota di 3 μl di soluzione anticorpale. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione in eccesso utilizzando una siringa Hamilton e aggiungere immediatamente un'aliquota di 1 μl di DSP rotavirus (0,1 mg/ml) in soluzione tampone contenente 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 e 10 mM CaCl2. Incubare per almeno 2 minuti a temperatura ambiente. La preparazione dei DPP è stata descritta in precedenza18.
</li>
</ol>3. Assemblare la camera microfluidica e caricare il portabocca in situ
<ol><li>Caricare l'E-chip umido contenente il campione virale nella punta del portacampioni microfluidico. Scarica a bagliore un secondo chip elettronico piatto per 1 minuto quindi caricato sopra il chip del distanziale(Figura 2, pannelli 1-5).</li>
	<li>In alternativa, per aumentare il contrasto delle macromolecole biologiche, è possibile aggiungere macchie di metallipesanti (ad esempio lo 0,2% di formato uro-ranil) ai campioni bagnati prima di posizionare il secondo chip E sul campione bagnato. Tuttavia, il chip elettronico contenente il campione dovrà essere lavato con acqua Milli-Q prima di aggiungere il reagente di contrasto.</li>
	<li>Mettere insieme l'intero assieme per formare un involucro sigillato, tenuto in posizione meccanicamente all'interno del supporto da 3 viti di ottone(Figura 2,pannelli 6-8).</li>
	<li>Dopo il montaggio, la punta del supporto viene pompata a10-6 Torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbopompata prima di posizionare il supporto all'interno del TEM.</li>
</ol>4. Imaging in liquido utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione
<ol><li>Caricare il porta campioni in situ in un microscopio elettronico a trasmissione (FEI Company) dotato di filamento LaB6 e operante a 120 kV.</li>
	<li>Accendere il filamento TEM e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione wobbler per inclinare il campione da -15° a +15° avanti e indietro nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione z per aiutare a tenere conto del corretto spessore della camera liquida. Questo passaggio garantisce inoltre che durante la registrazione delle immagini si usi un ingrandimento accurato.</li>
	<li>Registrare prima le immagini lungo i bordi e nelle regioni angolari della camera microfluidica. Queste aree contengono in genere la soluzione più sottile. Registra immagini di campioni in condizioni a basso consumo (1-3 elettroni/Å2)utilizzando una telecamera CCD. Utilizzare ingrandimenti nominali da 6.000X a 30.000X.</li>
	<li>Determinare il valore di defocalizzazione corretto concentrandosi sul bordo della camera fluidica. Utilizzare un valore di -1,5 μm per registrare immagini con ingrandimento 30.000X. Se si incontra una soluzione spessa o se l'agente di contrasto non viene utilizzato nella preparazione del campione, utilizzare valori di defocus più elevati nell'intervallo da -2 a -4 μm.</li>
	<li>Per garantire che la soluzione sia contenuta nella camera microfluidica durante gli esperimenti, mettere a fuoco il fascio di elettroni fino a quando le bolle non si formano nel liquido all'interno del dispositivo.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

L'autrice, Madeline J. Dukes, è un dipendente della Protochips, Inc.

Nel nostro lavoro presentato, abbiamo utilizzato l'approccio di acquisizione dell'affinità per tether rotavirus DLL a una piattaforma microfluidica. Ciò ha permesso l'imaging in situ di complessi macromolecolari in un microambiente liquido. L'approccio di cattura è significativo rispetto ad altre tecniche di imaging microfluidico perché localizza campioni biologici nella finestra di imaging per negare grandi problemi diffusivi che sorgono durante la registrazione di immagini in liquido. Tuttavia,...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Un obiettivo comune di biologi e ingegneri è quello di comprendere il funzionamento interno delle macchine molecolari. I microscopi elettronici a trasmissione (TEM) sono strumenti ideali per visualizzare questi dettagli intricati a risoluzione quasi atomica1-2. Al fine di sostenere il sistema ad alto vuoto di un TEM, i campioni biologici sono tipicamente incorporati in sottili pellicole di ghiacciovitreo 3,zuccheri 4,sali di metallopesante 5o qualche combinazionedi essi 6. Di conseguenza, le immagini di campioni incorporati possono rivelare solo istantanee limitate di processi dinamici.
I primi tentativi di mantenere campioni biologici idratati in camere liquide ambientali furono intrapresi da Parsons e colleghi utilizzando stadi di pompaggio differenziali. I modelli di diffrazione elettronica dei cristalli di catalasi non macchiati sono stati registrati con successo con una risoluzione di 3 Å in uno statoidratato 7-8. Inoltre, i domini lipidici separati in fase potrebbero essere esaminati in membrane idratate di erytrocitiumani 9-10. Tuttavia, il movimento causato dalla diffusione del liquido e dalla sua interferenza con il fascio di elettroni, ha portato a una grave perdita di risoluzione e ulteriori esperimenti utilizzando campioni biologici non sono stati tentati fino a poco tempo fa.
Sono stati introdotti supporti di campioni microfluidici di nuova sviluppo che utilizzano microchip semiconduttori per formare una camera ambientale micro-scalata. Questi dispositivi possono mantenere i campioni in liquido mentre sono posizionati in una colonnaTEM 11-12. Questa svolta tecnica nell'imaging TEM ha permesso ai ricercatori di vedere, per la prima volta, eventi progressivi a livello molecolare13. Ci riferiamo a questa nuova modalità come"microscopia molecolare in situ" in quanto gli esperimenti possono ora essere eseguiti "all'interno" della colonnaEM 14-15. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di immaginiare gli assemblaggi biologici in liquido al fine di osservare i loro comportamenti dinamici a risoluzione nanometrica. La logica alla base della tecnica sviluppata è registrare osservazioni in tempo reale ed esaminare nuove proprietà dei macchinari biologici in soluzione. Questa metodologia espande l'uso dei TEM per scopi più ampi in biologia cellulare e molecolare12-16.
Nell'attuale articolo video, presentiamo un protocollo completo per assemblare e utilizzare un porta campioni microfluidici disponibile in commercio. Questi supporti specializzati utilizzano microchip di nitruro di silicio prodotti con distanziali integrati per formare una camera liquida che racchiude volumi minimi di soluzione. Finestre sottili e trasparenti vengono incise nei microchip per scopi di imaging12. Dimostriamo l'uso corretto di un supporto microfluidico per esaminare le particelle a doppio strato del rotavirus simiano (DSP) in liquido utilizzando un TEM. Per garantire che gli assemblaggi biologici, come i DSP, non si disffondono rapidamente su grandi distanze durante l'imaging, utilizziamo l'approccio Affinity Capture per li intempare sulla superficie della camera microfluidica16. Questo passaggio di cattura molecolare ha un grande vantaggio rispetto alle tecniche alternative per l'imaging di campioni biologici in liquido perché consente l'acquisizione di immagini che verranno utilizzate per le routine di elaborazione a valle. Questo passaggio di acquisizione utilizzato in combinazione con l'imaging microfluidico è unico per le nostreprocedure 17. I lettori che utilizzano applicazioni di biologia strutturale utilizzando camere di imaging TEM o microfluidiche possono considerare l'uso di tecniche di cattura dell'affinità quando le osservazioni dinamiche a livello molecolare sono l'obiettivo finale.

<table><tbody><tr><td>E-chip, chip distanziatore</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m finestra</td></tr><tr><td>E-chip, chip superiore</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m finestra</td></tr><tr><td>Ni-NTA lipidi</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>Polvere in polvere</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) lipidi</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>Polvere in polvere</td></tr><tr><td>Palloni volumetrici&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml</td></tr><tr><td>Siringhe Hamilton</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 &mu; l; 1-25 &mu; l</td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman #1</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 pezzi, 90 mm</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Provette per coltura in vetro</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Cloroformio&nbsp;</td><td>Scienze della microcopia elettronica</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteina A con etichetta His,</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Milli-Q sistema idrico</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Acqua Ultrapura</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Attrezzatura&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidon In situ portacampioni</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; FEI</td></tr><tr><td>compatibile FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td> Telecamera CCD <td>120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp; &Aring;/pixel di campionamento a 30.000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 Stazione di pompaggio a secco</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Punta porta pompa a 10-6&nbsp; range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, unità di scarica a bagliore</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Modalità di polarità negativa</td></tr><tr><td>Piastra di agitazione riscaldata Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Heat a 150 &ordm; C per 1,5 ore</td></tr></tbody></table>

in situ tem di assemblee biologiche in liquido

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

I ricercatori utilizzano regolarmente microscopi elettronici a trasmissione (TM) per esaminare entità biologiche e valutare nuovi materiali. Qui descriviamo un'applicazione aggiuntiva per questi strumenti: la visualizzazione di assemblaggi virali in un ambiente liquido. Questo metodo eccitante e nuovo di visualizzazione delle strutture biologiche utilizza un porta campioni a base microfluidica recentemente sviluppato. Il nostro video articolo dimostra come assemblare e utilizzare un supporto microfluidico per immagini campioni liquidi all'interno di un TEM. In particolare, utilizziamo il rotavirus simiano particelle a doppio strato (DSP) come sistema modello. Descriviamo anche passaggi per rivestire la superficie della camera liquida con biofilm di affinità che lether DLP alla finestra di visualizzazione. Questo ci consente di immaginiare gli assiemi in modo adatto per la determinazione della struttura 3D. Quindi, presentiamo un primo scorcio di particelle subvirali in un ambiente liquido nativo.

Le immagini rappresentative dei DSP in liquido che utilizzano chip elettronici scaricati in bagliore (Figura 3A) mostrano meno DSP in una determinata area di visualizzazione, presumibilmente a causa della diffusione, rispetto ai DSP arricchiti sui dispositivi Affinity Capture (Figura 3B). L'aggiunta di formato uranil nella camera di imaging migliora il contrasto del campione e quindi la visibilità dei singoli DSP in soluzione(Figura 3C,pannello superiore). Un migliore co...

Qui descriviamo una procedura per l'immagine di complessi virali in liquido a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a trasmissione.

In situ TEM di assemblee biologiche in liquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

L'obiettivo generale di questa procedura è acquisire immagini di assemblaggi biologici e liquidi per osservarne i comportamenti dinamici con risoluzione nanometrica. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando microchip in nitruro di silicio dotati di una superficie con capacità di cattura per affinità, che consente di ancorare le macromolecole alla superficie del microchip, impedendone la diffusione nel liquido. Il secondo passaggio consiste nel caricare i campioni biologici sul microchip al fine di reclutare particelle di rotavirus.Successivamente, il microchip contenente le particelle virali viene lavato con un agente di contrasto e quindi caricato sul supporto per campioni microfluidico. L'ultimo passaggio consiste nel caricare il chip superiore e la piastra frontale per formare un contenitore chiuso che racchiuda il campione liquido. Infine, vengono acquisite immagini al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) per rivelare le caratteristiche del campione virale all'interno della microcamera liquida.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti per esaminare entità in fase liquida è che i nostri campioni non si diffondono rapidamente su grandi distanze durante l'imaging, grazie al rivestimento di cattura per affinità applicato sui microchip. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle valutazioni in tempo reale dei sistemi di somministrazione di farmaci basati su nanoparticelle o allo sviluppo di vaccini contro agenti patogeni virali, poiché possiamo osservare per la prima volta come cambiano in soluzione le nanostrutture dinamiche. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla visualizzazione di macromolecole biologiche, può essere applicato anche ad altri sistemi, come ad esempio applicazioni di elettrochimica.Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la preparazione dei dispositivi di cattura per affinità e il caricamento del portacampioni microfluidico potrebbero rappresentare una difficoltà per l'utente inesperto. Per iniziare, pulire le chip di nitruro di silicio immergendole in 15 millilitri di acetone per due minuti, seguiti da 15 millilitri di metanolo per due minuti.Per rimuovere il residuo di fotoresist utilizzato nel processo di produzione, lasciare asciugare rapidamente le chip sotto flusso laminare. Una volta asciutte, incubare le chip su una piastra riscaldata a 150 gradi Celsius per 1,5 ore. Successivamente, lasciarle raffreddare a temperatura ambiente.Successivamente, utilizzare siringhe Hamilton per preparare una miscela lipidica in un piccolo tubo di vetro. Aggiungere prima il 25% di cloroformio, quindi aggiungere il 55% di DLPC in cloroformio a una concentrazione di un milligrammo per millilitro. Infine, utilizzando una siringa separata, aggiungere il 20% di lipide nickel NTA in cloroformio a una concentrazione di un milligrammo per millilitro, per un volume totale di 40 microlitri.Quindi ritagliare un pezzo di parafilm delle dimensioni adatte a contenere una capsula di Petri in vetro di 100 per 15 millimetri e aggiungere nove gocce da 15 microlitri di acqua Milli Q sulla superficie del parafilm. Applicare un'aliquote da un microlitro della miscela lipidica su ciascuna goccia da 15 microlitri di acqua Milli Q e posizionare la piastra su ghiaccio in un ambiente umido per almeno 60 minuti, durante i quali si formerà un monolayer lipidico sulla superficie delle gocce. Posizionare un EIP con uno spaziatore integrato da 150 nanometri sulla goccia del monolayer e incubare insieme per un minuto.Successivamente, sollevare delicatamente il chip dalla goccia e aggiungere tre microlitri di proteina A con tag istidina a 0,01 milligrammi per millilitro direttamente sulla superficie del chip. Incubare il chip e la proteina A per un minuto a temperatura ambiente. Quindi asciugare il liquido in eccesso utilizzando carta da filtro Watman numero uno e aggiungere immediatamente tre microlitri di soluzione di anticorpo IgG a 0,01 milligrammi per millilitro.Incubare il campione per un minuto a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione in eccesso utilizzando una siringa Hamilton e aggiungere immediatamente un'aliquote di un microlitro di rotavirus, particelle a doppio strato a 0,1 milligrammi per millilitro in una soluzione tampone heaps, e incubare il chip per almeno due minuti a temperatura ambiente. Un secondo IP piatto viene preparato mediante scarica al plasma per un minuto; assemblare la camera microfluidica utilizzando uno ST.Stereoscopio caricando prima la punta della camera del campione con anelli O.Quindi caricare l’E IP umido contenente il campione virale nella punta del supporto per campioni microfluidico. Successivamente, aggiungere l’EIP piatto sottoposto a glow discharge sulla parte superiore del campione, assemblando l’intera struttura per formare un alloggiamento sigillato, mantenuto in posizione meccanicamente all’interno del supporto da tre viti in ottone. Dopo l’assemblaggio, portare la punta del supporto a una pressione di 10 alla meno sei torr.Utilizzando una stazione di pompaggio a pompa turbo prima di inserire il portacampioni nel TEM, caricare il portacampioni I due nel microscopio elettronico a trasmissione dotato di un filamento Lab Six funzionante a 120 chilovolt. Successivamente, accendere il filamento del TEM e regolare l'altezza centrata del campione rispetto allo stadio del microscopio utilizzando la funzione wobbler per inclinare il campione da meno 15 gradi a più 15 gradi avanti e indietro. Nella colonna registrare immagini con ingrandimento da 6.000 a 30.000 volte lungo i bordi e nelle zone angolari della camera microfluidica.Prima immagine acquisita con una telecamera CCD in condizioni di basso dosaggio, da uno a tre elettroni per angstrom quadrato. Determinare il valore corretto di defocalizzazione mettendo a fuoco sul bordo della camera fluidica. In generale, utilizzare un valore di defocalizzazione di meno 1,5 micrometri per registrare immagini a un’ingrandimento di 30.000 volte, assicurando così che la soluzione sia contenuta all’interno della camera microfluidica.Durante tutti gli esperimenti, focalizzare il fascio di elettroni finché non si formano bolle nel liquido all'interno del dispositivo. L'immagine mostrata qui è stata acquisita dopo due minuti con cinque elettroni per angstrom quadrato. Dopo cinque minuti, si sono formate ulteriori bolle; il trattamento a scarica al plasma consente il legame dei microchip.Pochissime particelle a doppio strato in soluzione, presumibilmente a causa della diffusione. Per confronto, le particelle a doppio strato sono arricchite sui microchip funzionalizzati per affinità; le immagini mostrate qui sono rappresentative e mostrano una ricostruzione tridimensionale di particelle a doppio strato in liquido contenente un agente di contrasto. Il diametro della ricostruzione è di 80 nanometri.Le medie di classe delle particelle a doppio strato e del liquido hanno rivelato caratteristiche ben definite lungo la loro superficie esterna. I singoli pannelli misurano 110 nanometri. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di centrare l'E IPS nella punta del portacampioni e di preparare il portacampioni prima di inserirlo nel microscopio elettronico.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la valutazione dell'attività trascrizionale, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio: in che misura il fascio di elettroni ha influenzato la capacità funzionale dei complessi virali? Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre dispositivi per il recupero per affinità, decorarli con adattatori molecolari, caricare campioni virali nel portacampioni microfluidico per TEM e acquisire le immagini utilizzando procedure di microscopia cche. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni virali può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare guanti e occhiali protettivi, quando si eseguono procedure con agenti patogeni di livello di biosicurezza 2 (BSL 2).

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