Drosophila melanogaster Raccolta e preparazione di embrioni e larve

Gli embrioni e le larve di Drosophila melanogaster sono facili da manipolare e il loro sviluppo è guidato da meccanismi che esistono in altri organismi, compresi i mammiferi. Imparare a raccogliere e preparare embrioni e larve è un passo preliminare in molti processi sperimentali dalla biologia comportamentale a quella dello sviluppo. Questo video coprirà i metodi standard per la raccolta e la raccolta di embrioni e larve di Drosophila, procedure essenziali nell'uso di questo versatile organismo modello.

Lo studio dell'embrione di Drosophila ha fornito una grande comprensione del modo in cui i geni regolano lo sviluppo, dall'mRNA che è espresso come gradiente nell'ovocita, ai geni che formano il piano corporeo segmentato anteriore-posteriore. Alcuni di questi geni, come i geni dell'omeobox, sono altamente conservati tra questo insetto e i mammiferi.

La natura sostanziosa degli embrioni di Drosophila consente loro di resistere all'esposizione ad ambienti difficili e sostanze chimiche, il che li rende estremamente pratici da studiare.

Dopo la fecondazione una mosca femmina può deportare fino a 100 embrioni al giorno, che si schiuderanno in larve dopo 12-15 ore.

Al fine di manipolare gli embrioni di Drosophila, devono prima essere raccolti.

Gli embrioni vengono raccolti in camere di deposizione delle uova spesso indicate come "coppe per la deposizione delle uova".

Per assemblare la tazza di posa, prima praticare dei fori o ritagliare parte di un contenitore e coprirlo con materiale poroso per consentire la ventilazione. Quindi ottenere un piatto di agar di mela o succo d'uva, strisciarlo con pasta di lievito e graffiare i piatti al centro. La presenza di pasta di lievito indurrà la deposizione delle uova.

Aggiungi rapidamente le mosche alla camera di deposizione delle uova, inverti la camera in modo che la piastra sia sul fondo e lasciala incubare. Dopo il tempo di incubazione desiderato invertire la camera dell'uovo e sbatterla sul banco un paio di volte. Le mosche cadono sul fondo e sono brevemente disorientate. Sostituire rapidamente il vecchio piatto di agar con il piatto fresco stratificato con la pasta di lievito. Per acquisire gli embrioni più invecchiati cambiare le piastre ogni 1-3 ore.

Le piastre avranno centinaia di embrioni, specialmente vicino ai graffi e al lievito.

20 mosche di ogni sesso dovrebbero produrre 100-200 embrioni all'ora. Ora gli embrioni possono essere raccolti.

Gli strumenti necessari per la raccolta degli embrioni sono un colino o un setaccio, che può variare notevolmente in termini di dimensioni e complessità, un pennello e acqua distillata.

In primo luogo, allentare gli embrioni immergendo il piatto con acqua distillata, spazzolando delicatamente la superficie con un pennello. Quindi, filtrare il liquido versando la miscela nel setaccio. Risciacquare gli embrioni con acqua.

Il risciacquo è spesso seguito dalla decoriolazione - la rimozione della membrana esterna dura dell'embrione o corion.

La decoionazione può essere eseguita manualmente tramite una dissezione dell'embrione dalla guaine corionica. In alternativa, gli embrioni possono essere inseriti in candeggina al 50%. Ci vogliono 2-10 minuti perché il corion si dissolva, come notato dalla scomparsa delle appendici dorsali. Risciacquare abbondantemente con acqua distillata per assicurarsi che l'embrione nudo non sia danneggiato dalla candeggina. La decoerazione è un prerequisito per tecniche come la microiniezione e l'imaging di cellule vive.

Ora che hai avuto un senso della biologia, della raccolta e della raccolta degli embrioni, passiamo alla fase successiva del ciclo di vita della Drosophila: le larve.

Le larve di Drosophila hanno tre stadi "instar", o muta. Il primo instar dura un giorno, il secondo un altro giorno e il terzo altri due giorni. La prima e la seconda larva instar si trovano nel cibo della fiala 1-3 giorni dopo aver impostato una croce. Il 4 ° giorno, le larve della terza stella migrano verso l'alto, o "vagano" sui lati del contenitore, dove alla fine formeranno bozzoli chiamati pupe.

Le larve sono spesso utilizzate per la sperimentazione a causa dei loro dischi immaginali. I dischi immaginali sono organi parzialmente sviluppati che sono noti per diventare parti intere della mosca adulta. Ad esempio, un disco oculare immaginale diventerà un occhio adulto, i dischi antennali diventeranno antenne e i dischi alari immaginali diventeranno ali. Lo studio dei dischi immaginali ha portato a importanti scoperte in Drosophila, come il ruolo dei geni omeobox nella formazione del pattern.

La raccolta delle larve è più semplice della raccolta degli embrioni, perché non richiede il trasferimento delle mosche in alloggi speciali.

La singola larva può essere rimossa con una pinzetta o una spatola. Quando si raccoglie un gran numero di larve in fase iniziale è possibile utilizzare un metodo di raccolta alternativo utilizzando una soluzione di saccarosio, che è più densa delle larve e le fa galleggiare.

Aggiungere la soluzione di saccarosio alla fiala, che galleggia le larve verso l'alto. Rimuovere il cibo posizionando la fiala su un rotatore. Quindi rimuovere le larve con un pennello o una pipetta e raccogliere per esperimenti.

Ora che abbiamo trattato le tecniche di raccolta e raccolta di embrioni e larve, ora vediamo come applicarle alla sperimentazione.

Poiché sono mobili, le larve di Drosophila possono essere utilizzate per esperimenti comportamentali.

Qui si vede un "test di strisciamento", che viene utilizzato per valutare il comportamento locomotore di Drosophila in condizioni specifiche. Il test strisciante misura la distanza percorsa dalla larva, al fine di osservare gli effetti di un farmaco sulla funzione motoria. Le larve raccolte sono immerse in una soluzione di saccarosio drogato che si prevede interferisca con la motilità.

La microiniezione è una procedura per la creazione di moscerini della frutta geneticamente modificati, noti come mutanti transgenici, inserendo materiale genetico personalizzato sotto forma di plasmide circolare del DNA.

Questi embrioni vengono deconizionati arrotolandoli fisicamente su nastro biadesivo in modo che le sostanze chimiche non li danneggino. Gli embrioni possono quindi essere iniettati con plasmidi che codificano proteine, come la tubulina, fuse con proteine reporter fluorescenti, come la GFP. Gli esperimenti possono quindi essere eseguiti per visualizzare i processi cellulari come la mitosi da linee di mosca transgenica stabilite.

Gli embrioni possono essere utilizzati per visualizzare la presenza di trascritti attraverso l'ibridazione fluorescente in situ.

In questo esperimento, si osservano embrioni interi per la presenza di un trascritto di mRNA desiderato tramite microscopia a fluorescenza. Gli embrioni vengono fissati utilizzando una soluzione bifasica che decoiona e quindi prepara l'embrione per la colorazione. Gli embrioni nudi si trovano sullo strato inferiore. Dopo la colorazione immunofluorescente, la presenza della proteina desiderata può essere vista usando la microscopia a fluorescenza.

Hai appena visto il video di raccolta e preparazione di embrioni e larve di JoVE. Abbiamo esaminato la raccolta, la raccolta e la preparazione di embrioni e larve e alcune importanti applicazioni applicate agli organismi in fase iniziale. Grazie per l'attenzione!