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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila melanogaster Raccolta e preparazione di embrioni e larve

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila melanogaster Embryo and Larva Harvesting and Preparation

3.9: C. elegans Development and Reproduction

3.15: C. elegans Chemotaxis Assay

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08:14 min

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April 30, 2023

Overview

Gli embrioni e le larve di Drosophila melanogaster sono facili da manipolare e sviluppare rapidamente con meccanismi analoghi ad altri organismi, compresi i mammiferi. Per questi motivi, molti ricercatori utilizzano embrioni di mosca e larve per rispondere a domande in diversi campi che vanno dalla biologia comportamentale a quella dello sviluppo. Prima della sperimentazione, tuttavia, gli embrioni e le larve devono prima essere raccolti.

Questo video dimostrerà innanzitutto come le “coppe per la deposizione delle uova” vengono utilizzate per raccogliere embrioni di Drosophila su piastre di agar. Verrà quindi descritta la raccolta e la deconionezione degli embrioni. Successivamente, il video dimostrerà come identificare e manipolare La Drosophila in uno dei tre stadi larvali che seguono lo stadio embrionale. Infine, vengono forniti esempi di alcuni dei modi in cui gli embrioni di mosca e le larve vengono utilizzati nella ricerca biologica.

Procedure

Gli embrioni e le larve di Drosophila melanogaster sono facili da manipolare e il loro sviluppo è guidato da meccanismi che esistono in altri organismi, compresi i mammiferi. Imparare a raccogliere e preparare embrioni e larve è un passo preliminare in molti processi sperimentali dalla biologia comportamentale a quella dello sviluppo. Questo video coprirà i metodi standard per la raccolta e la raccolta di embrioni e larve di Drosophila, procedure essenziali nell’uso di questo versatile organismo modello.

Lo studio dell’embrione di Drosophila ha fornito una grande comprensione del modo in cui i geni regolano lo sviluppo, dall’mRNA che è espresso come gradiente nell’ovocita, ai geni che formano il piano corporeo segmentato anteriore-posteriore. Alcuni di questi geni, come i geni dell’omeobox, sono altamente conservati tra questo insetto e i mammiferi.

La natura sostanziosa degli embrioni di Drosophila consente loro di resistere all’esposizione ad ambienti difficili e sostanze chimiche, il che li rende estremamente pratici da studiare.

Dopo la fecondazione una mosca femmina può deportare fino a 100 embrioni al giorno, che si schiuderanno in larve dopo 12-15 ore.

Al fine di manipolare gli embrioni di Drosophila, devono prima essere raccolti.

Gli embrioni vengono raccolti in camere di deposizione delle uova spesso indicate come “coppe per la deposizione delle uova”.

Per assemblare la tazza di posa, prima praticare dei fori o ritagliare parte di un contenitore e coprirlo con materiale poroso per consentire la ventilazione. Quindi ottenere un piatto di agar di mela o succo d’uva, strisciarlo con pasta di lievito e graffiare i piatti al centro. La presenza di pasta di lievito indurrà la deposizione delle uova.

Aggiungi rapidamente le mosche alla camera di deposizione delle uova, inverti la camera in modo che la piastra sia sul fondo e lasciala incubare. Dopo il tempo di incubazione desiderato invertire la camera dell’uovo e sbatterla sul banco un paio di volte. Le mosche cadono sul fondo e sono brevemente disorientate. Sostituire rapidamente il vecchio piatto di agar con il piatto fresco stratificato con la pasta di lievito. Per acquisire gli embrioni più invecchiati cambiare le piastre ogni 1-3 ore.

Le piastre avranno centinaia di embrioni, specialmente vicino ai graffi e al lievito.

20 mosche di ogni sesso dovrebbero produrre 100-200 embrioni all’ora. Ora gli embrioni possono essere raccolti.

Gli strumenti necessari per la raccolta degli embrioni sono un colino o un setaccio, che può variare notevolmente in termini di dimensioni e complessità, un pennello e acqua distillata.

In primo luogo, allentare gli embrioni immergendo il piatto con acqua distillata, spazzolando delicatamente la superficie con un pennello. Quindi, filtrare il liquido versando la miscela nel setaccio. Risciacquare gli embrioni con acqua.

Il risciacquo è spesso seguito dalla decoriolazione – la rimozione della membrana esterna dura dell’embrione o corion.

La decoionazione può essere eseguita manualmente tramite una dissezione dell’embrione dalla guaine corionica. In alternativa, gli embrioni possono essere inseriti in candeggina al 50%. Ci vogliono 2-10 minuti perché il corion si dissolva, come notato dalla scomparsa delle appendici dorsali. Risciacquare abbondantemente con acqua distillata per assicurarsi che l’embrione nudo non sia danneggiato dalla candeggina. La decoerazione è un prerequisito per tecniche come la microiniezione e l’imaging di cellule vive.

Ora che hai avuto un senso della biologia, della raccolta e della raccolta degli embrioni, passiamo alla fase successiva del ciclo di vita della Drosophila: le larve.

Le larve di Drosophila hanno tre stadi “instar”, o muta. Il primo instar dura un giorno, il secondo un altro giorno e il terzo altri due giorni. La prima e la seconda larva instar si trovano nel cibo della fiala 1-3 giorni dopo aver impostato una croce. Il 4 ° giorno, le larve della terza stella migrano verso l’alto, o “vagano” sui lati del contenitore, dove alla fine formeranno bozzoli chiamati pupe.

Le larve sono spesso utilizzate per la sperimentazione a causa dei loro dischi immaginali. I dischi immaginali sono organi parzialmente sviluppati che sono noti per diventare parti intere della mosca adulta. Ad esempio, un disco oculare immaginale diventerà un occhio adulto, i dischi antennali diventeranno antenne e i dischi alari immaginali diventeranno ali. Lo studio dei dischi immaginali ha portato a importanti scoperte in Drosophila, come il ruolo dei geni omeobox nella formazione del pattern.

La raccolta delle larve è più semplice della raccolta degli embrioni, perché non richiede il trasferimento delle mosche in alloggi speciali.

La singola larva può essere rimossa con una pinzetta o una spatola. Quando si raccoglie un gran numero di larve in fase iniziale è possibile utilizzare un metodo di raccolta alternativo utilizzando una soluzione di saccarosio, che è più densa delle larve e le fa galleggiare.

Aggiungere la soluzione di saccarosio alla fiala, che galleggia le larve verso l’alto. Rimuovere il cibo posizionando la fiala su un rotatore. Quindi rimuovere le larve con un pennello o una pipetta e raccogliere per esperimenti.

Ora che abbiamo trattato le tecniche di raccolta e raccolta di embrioni e larve, ora vediamo come applicarle alla sperimentazione.

Poiché sono mobili, le larve di Drosophila possono essere utilizzate per esperimenti comportamentali.

Qui si vede un “test di strisciamento”, che viene utilizzato per valutare il comportamento locomotore di Drosophila in condizioni specifiche. Il test strisciante misura la distanza percorsa dalla larva, al fine di osservare gli effetti di un farmaco sulla funzione motoria. Le larve raccolte sono immerse in una soluzione di saccarosio drogato che si prevede interferisca con la motilità.

La microiniezione è una procedura per la creazione di moscerini della frutta geneticamente modificati, noti come mutanti transgenici, inserendo materiale genetico personalizzato sotto forma di plasmide circolare del DNA.

Questi embrioni vengono deconizionati arrotolandoli fisicamente su nastro biadesivo in modo che le sostanze chimiche non li danneggino. Gli embrioni possono quindi essere iniettati con plasmidi che codificano proteine, come la tubulina, fuse con proteine reporter fluorescenti, come la GFP. Gli esperimenti possono quindi essere eseguiti per visualizzare i processi cellulari come la mitosi da linee di mosca transgenica stabilite.

Gli embrioni possono essere utilizzati per visualizzare la presenza di trascritti attraverso l’ibridazione fluorescente in situ.

In questo esperimento, si osservano embrioni interi per la presenza di un trascritto di mRNA desiderato tramite microscopia a fluorescenza. Gli embrioni vengono fissati utilizzando una soluzione bifasica che decoiona e quindi prepara l’embrione per la colorazione. Gli embrioni nudi si trovano sullo strato inferiore. Dopo la colorazione immunofluorescente, la presenza della proteina desiderata può essere vista usando la microscopia a fluorescenza.

Hai appena visto il video di raccolta e preparazione di embrioni e larve di JoVE. Abbiamo esaminato la raccolta, la raccolta e la preparazione di embrioni e larve e alcune importanti applicazioni applicate agli organismi in fase iniziale. Grazie per l’attenzione!

Transcript

Drosophila melanogaster embryos and larvae are easy to manipulate and their development is guided by mechanisms that exist in other organisms, including mammals. Learning to harvest and prepare embryos and larvae is a preliminary step in many experimental processes from behavioral to developmental biology. This video will cover the standard methods for collecting and harvesting Drosophila embryos and larvae, essential procedures in the use of this versatile model organism.

The study of the Drosophila embryo has provided great insight into the manner by which genes regulate development, from the mRNA that is expressed as a gradient in the oocyte, to the genes that form the anterior-to-posterior segmented body plan. Some of these genes, like the homeobox genes are highly conserved between this insect and mammals.

The hearty nature of Drosophila embryos allows them to withstand exposure to harsh environments and chemicals, which makes them extremely practical to study.

After fertilization one female fly can lay up to 100 embryos per day, which will hatch into larvae after 12-15 hours.

In order to manipulate Drosophila embryos, they must first be collected.

Embryos are collected in egg-laying chambers often referred to as “egg-laying cups”.

To assemble the laying cup, first poke holes or cut out part of a container and cover it with porous material to allow for ventilation. Then obtain an apple or grape juice agar plate, streak it with yeast paste, and scratch the plates in the center. The presence of yeast paste will induce egg laying.

Quickly add flies to the egg-laying chamber, invert the chamber so the plate is at the bottom, and allow it to incubate. After the desired incubation time invert the egg chamber and bang it on the bench top a few times. The flies fall to the bottom and are briefly disoriented. Quickly replace the old agar plate with the fresh plate layered with the yeast paste. To acquire the best-aged embryos change the plates every 1-3 hours.

Plates will have hundreds of embryos, especially near the scratches and yeast.

20 flies of each sex should produce 100-200 embryos per hour. Now the embryos can be harvested.

The tools needed for embryo harvesting are a strainer or sieve, which can vary greatly in size and complexity, a paintbrush, and distilled water.

First, loosen embryos by immersing the plate with distilled water, gently brushing the surface with a paintbrush. Next, filter out liquid by pouring the mixture into the sieve. Rinse the embryos with water.

Rinsing is often followed by dechorionation — the removal of the hard outer membrane of the embryo, or chorion.

Dechorionation can be done manually via a dissection of the embryo out of the chorionic sheath. Alternatively, embryos can be placed into 50% bleach. It takes 2-10 minutes for the chorion to dissolve, as noted by the disappearance of the dorsal appendages. Rinse thoroughly with distilled water to make sure the naked embryo is undamaged by bleach. Dechorionation is a prerequisite to techniques like microinjection and live cell imaging.

Now that you have gotten a sense of embryo biology, collection, and harvesting, let’s move on to the next stage in the Drosophila life cycle: larvae.

Drosophila larvae have three “instar,” or molting, stages. The first instar lasts one day, the second another day, and the third two more days. First and second instar larvae are found in the food of the vial 1-3 days after setting up a cross. On the 4th day, third instar larvae migrate up, or “wander” up the sides of the container, where they will ultimately form cocoons called pupae.

Larvae are often used for experimentation because of their imaginal discs. Imaginal discs are partially developed organs that are known to become whole parts of the adult fly. For example, an imaginal eye disc will become an adult eye, antennal discs will become antennae, and imaginal wing discs will become wings. The study of imaginal discs has led to important discoveries in Drosophila, such as the role of homeobox genes in pattern formation.

Larvae collection is simpler than embryo collection, because it does not require the transfer of flies into special housing.

Individual larva can be removed with tweezers or a spatula. When collecting a large number of early stage larvae you can employ an alternative collection method using a sucrose solution, which is more dense than the larvae and causes them to float.

Add sucrose solution to the vial, which buoys larvae to the top. Dislodge the food by placing the vial on a rotator. Then remove larvae with a brush or pipette and harvest for experiments.

Now that we’ve covered collection and harvesting techniques for embryos and larvae, now let’s see how to apply them to experimentation.

Since they are mobile, Drosophila larvae can be used for behavioral experiments.

Here you see a “crawling assay”, which is used to evaluate Drosophila locomotor behavior under specific conditions. The crawling assay measures the distance the larva travels, in order to observe the effects of a drug on motor function. Collected larvae are immersed in a drugged sucrose solution that is predicted to interfere with motility.

Microinjection is a procedure for creating genetically modified fruit flies, known as transgenic mutants, by inserting customized genetic material in the form of a circular DNA plasmid.

These embryos are dechorionated by physically rolling them on double-sided tape so chemicals won’t damage them. Embryos can then be injected with plasmids that encode proteins, like tubulin, fused with fluorescent reporter proteins, like GFP. Experiments can then be performed to visualize cellular processes like mitosis from established transgenic fly lines.

Embryos can be used to visualize the presence of transcripts through fluorescent in situ hybridization.

In this experiment, whole embryos are observed for the presence of a desired mRNA transcript via fluorescence microscopy. The embryos are fixed using a biphasic solution that dechorionates, and therefore prepares the embryo for staining. The naked embryos are on the bottom layer. After immunofluorescent staining, the presence of the desired protein can be seen using fluorescence microscopy.

You’ve just watched JoVE’s embryo and larva harvesting and preparation video. We reviewed the collection, harvesting, and preparation of embryos and larvae and some important applications applied to the early stage organisms. Thanks for watching!

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