Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare le proprietà meccaniche e gli stati di ripiegamento dei partner di legame delle proteine di fusione utilizzando una spettroscopia di forza a singola molecola basata su FM. Ciò si ottiene immobilizzando covalentemente i partner di legame delle proteine su un vetrino e su un cantilever A FM per ottenere una geometria di trazione ben definita come secondo passo. La superficie del vetro è rientrata con il cantilever, il che consente di stabilire il legame del ligando del recettore.

Successivamente, il cantilever viene retratto a velocità costante per dispiegare i singoli domini proteici e associare il complesso del ligando recettoriale si ottengono risultati che rivelano elementi strutturali terziari che fungono da barriere energetiche lungo il percorso di dispiegamento, che vengono rivelati in modelli di elasticità polimerica. Ulteriori informazioni cinetiche ed energetiche sui partner di legame possono essere ottenute adattando modelli cinetici allo spettro delle forze dinamiche. L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i percorsi di dispiegamento delle proteine sotto forza.

Questo metodo può fornire informazioni sulla stabilità meccanica delle proteine. Può essere applicato a qualsiasi sistema di ligandi del recettore proteico che può essere ingegnerizzato con un gruppo di file accessibile. I ricercatori che utilizzano questo metodo per la prima volta hanno difficoltà perché il tempismo è fondamentale e maneggiare i cantilever può essere difficile.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biofisica, come ad esempio come si sviluppa una proteina multi-dominio Per iniziare il luogo. Due coperture in vetro di 24 millimetri di diametro e 0,5 millimetri di spessore scivolano nel supporto A-P-T-F-E e quindi sonicano. Il coperchio scivola in una miscela da 50 a 50 di etanolo e acqua ultrapura per 15 minuti.

Al termine della sonicazione, sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura e inciderli in una soluzione di piranha per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimuovere i vetrini coprioggetti e sciacquarli con acqua ultrapura e asciugarli sotto un leggero getto di azoto. Successivamente immergere Il coperchio scivola in una miscela 45 a cinque a uno di acqua ultrapura di etanolo e tre amminopropil dimetile ahoy.

Posizionare i campioni sommersi su un agitatore a temperatura ambiente per 60 minuti a circa 50 rotazioni al minuto. Quindi immergere il vetrino coprioggetto in sequenza in etanolo al 100%, seguito da acqua ultrapura due volte ciascuno. Ancora una volta, asciugare i vetrini coprioggetto sotto un leggero getto di azoto.

Una volta asciutti, cuocete i vetrini in forno a 80 gradi per 30 minuti. Conservare i vetrini coprioggetti inutilizzati sotto Argonne per un massimo di sei settimane per eseguire l'amminizzazione delle punte a sbalzo in silicone. Per prima cosa, posizionare quattro cantilever in silicone su un vetrino pulito e trattarli con ozono UV per 15 minuti.

Quindi immergere i cantilever per tre minuti e una soluzione da 50 a 50 di etanolo e tre amminopropil dimetil oxis Ilene, insieme a un punto 25% di acqua ultrapura. Quindi, sciacquare i cantilever in sequenza per 60 secondi in fornai di toluene, etanolo e acqua ultrapura. Asciugare accuratamente i cantilever su carta da filtro tra i RIN dopo il risciacquo finale.

Posizionare i cantilever su un vetrino pulito e cuocerli a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Preparare due T di microsfere di riduzione del solfuro di diss TEP tagliando prima la punta di una punta per pipetta da 200 microlitri per allargarne il diametro e quindi pipettando 100 microlitri della soluzione di perline madre in ciascuna microprovetta da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere un millilitro di TBS agli OTT del liquame di perline TEP e sciacquare le perle facendo scorrere brevemente il microtubo.

Quindi pellettare le perle centrifugando i campioni a 850 Gs per tre minuti. Rimuovere e scartare con cura il surnatante con una micropipetta e sciacquare le perle altre due volte con un millilitro di TBS. La centrifugazione tra i risciacqui avviene dopo il risciacquo finale, aggiungere una soluzione proteica concentrata a tre milligrammi per millilitro alle perle TEP in un rapporto uno a due e mescolare delicatamente l'impasto mescolando con una punta di micropipetta per evitare l'introduzione di bolle d'aria.

Quindi posizionare la miscela di liquame di perle proteiche TEP su un rotatore per 2,5 ore. Immergere gli occhi amminici, i cantilever e i vetrini di copertura nel tampone bate di sodio a un pH di 8,5 per 45 minuti per deprotonare i gruppi amminici primari sulla superficie. Quindi scaldare la polvere di malam N-H-S-P-E-G a temperatura ambiente e prepararne 210 microlitri a 25 micromolari facendola vorticare nel tampone di sodio boy eight.

La soluzione deve essere utilizzata il più rapidamente possibile a causa dell'emivita estremamente breve del NHS. A pH 8,5, depositare rapidamente 30 microlitri di goccioline di N-H-S-P-E-G di soluzione di malam su una piastra di Petri e 90 microlitri su ogni altro vetrino coprioggetti. Posizionare con cura i cantilever all'interno delle goccioline da 30 microlitri.

Quindi capovolgere il vetrino coprioggetti senza gocciolina su uno con la soluzione di N-H-S-P-E-G malam per formare un sandwich con la soluzione N-H-S-P-E-G MALAM. Al centro, incubare i cantilever e i vetrini coprioggetti con la soluzione N-H-S-P-E-G MALAM a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare la perlina di TEP e la soluzione proteica ridotta a 100 GS per un minuto e raccogliere lo snat.

Quindi, diluire la soluzione proteica con TBS. Puntare a una concentrazione proteica durante la coniugazione superficiale in un intervallo compreso tra 0,5 e due milligrammi per millilitro. Quindi mettere da parte le soluzioni proteiche ridotte e diluite per alcuni minuti mentre si risciacquano i cantilever e i vetrini.

Sciacquare i vetrini coprioggetto in tre bicchieri sequenziali di acqua ultrapura. Rimuovere il liquido residuo dai vetrini coprioggetto toccando con cura i bordi della carta da filtro. Quindi montare i vetrini coprioggetto in un supporto per campioni appropriato compatibile con lo strumento A FM e asciugare il liquido residuo sotto un leggero flusso di azoto.

Applicare 20 microlitri della soluzione proteica diluita sotto forma di gocciolina al centro dei vetrini. Quindi sciacquare i cantilever in tre becher sequenziali di acqua ultrapura, seguiti da 30 microlitri di goccioline della seconda soluzione proteica diluita. Incubare vetrini coprioggetti pegilati e cantilever con rispettive soluzioni proteiche diluite a temperatura ambiente per una o due ore in una camera di umidità.

Successivamente, utilizzare una pipetta per sciacquare i vetrini coprioggetti almeno 10 volte con un millilitro di TBS e quindi conservarli in TBS fino alla misurazione. Sciacquare anche i cantilever utilizzando tre becher sequenziali contenenti TBS per rimuovere le proteine non legate e conservarle anche in TBS. Monta i vetrini funzionalizzati, a sbalzo e in vetro in un modello A FM adatto alla misurazione in liquidi e che supporta un intervallo di velocità accessibile sul pieto Z di circa 200-5.000 nanometri al secondo.

Quando si monta la bomboletta per ridurre al minimo l'esposizione all'aria, assicurarsi che le superfici rimangano coperte da tampone durante l'intero processo dopo la corretta regolazione del raggio laser. Lasciare che il sistema si equilibri per almeno 30 minuti per ridurre eventuali effetti di deriva e regolare nuovamente se necessario. Quindi iniziare a prendere le misure dopo aver legato con successo la coesione.

Docker in coppia le tracce di distanza della forza registrate mostrate qui. Presenta un modello di picco caratteristico. Ogni picco nella traccia rappresenta il dispiegamento di un sottodominio proteico con l'ultimo picco corrispondente alla dissociazione del complesso ligando recettore.

Le tracce di distanza della forza registrate sono state quindi trasformate in spazio di lunghezza del contorno di forza e assemblate in un istogramma della posizione della barriera. I dati mostrano un incremento della lunghezza del contorno di circa 89 nanometri, che può essere assegnato in modo inequivocabile allo sviluppo del dominio xin per sondare il panorama energetico del docker coesivo e dell'interazione. Sono state ottenute un totale di 186 tracce di dati a quattro diverse velocità di pooling.

Lo spettro delle forze dinamiche risultante, mostrato come grandi cerchi blu, rappresenta le forze di rottura più probabili a una data velocità di carico. Questi valori sono stati poi adattati al modello di Bell Evans, l'adattamento ha prodotto valori per Koff e delta X, che sono stati trovati in buon accordo con i risultati precedentemente pubblicati. Una volta padroneggiata, la parte sperimentale di questa tecnica può essere eseguita in otto-nove ore.

Seguendo questa procedura, la mutagenesi sito-specifica può essere eseguita in un esperimento di follow-up per determinare gli amminoacidi cruciali per il legame dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biofisica delle singole molecole per esplorare i paesaggi di ripiegamento delle proteine. Lo usiamo per studiare le proprietà meccaniche delle SOE di cellulosa, che sono tra i sistemi proteici meccanicamente più stabili conosciuti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la spettroscopia di forza di una singola molecola su coppie di ligandi del recettore proteico.