Name: Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Scopri le proprietà meccaniche dei cellulosome con spettroscopia di forza molecolare singola basata su AFM. Questo metodo rivela barriere energetiche strutturali e interazioni recettore-ligando per applicazioni biotecnologiche.

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Gli autori riconoscono il finanziamento di una sovvenzione avanzata del Consiglio Europeo della Ricerca a Hermann Gaub. Michael A. Nash ringrazia con gratitudine il finanziamento da parte di Society in Science - The Branco Weiss Fellowship program. Gli autori ringraziano Edward A. Bayer, Yoav Barak e Daniel B. Fried del Weizmann Institute of Science per aver generosamente fornito le proteine utilizzate in questo studio. Gli autori ringraziano Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner e Stefan W. Stahl per le utili discussioni.

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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Per ottenere dati significativi dagli esperimenti di spettroscopia di forza di una singola molecola, è fondamentale ottenere geometrie di trazione ben definite e riproducibili. Il protocollo qui utilizzato si traduce nell'immobilizzazione sito-specifica di complessi proteici in una geometria di trazione definita.
I cantilever utilizzati in questo studio sono stati scelti per la loro sensibilità alla forza e l'elevata frequenza di risonanza in acqua. Inoltre, la piccola curvatura della punta di...

I cellulosomi sono grandi complessi multienzimatici visualizzati sulla superficie di batteri cellulolitici anaerobi (ad es. C. thermocellum) che si sono evoluti per depolimerizzare in modo efficiente la lignocellulosa della parete cellulare vegetale in oligosaccaridi solubili1. Un attributo centrale dei cellulosomi è l'interazione coesina-dockerina ad alta affinità. Nel paradigma più importante, un modulo di docherina altamente conservato di 60-75 aminoacidi di tipo I è visualizzato all'estremità C-terminale dei vari enzimi batterici. Il modulo dockerin dirige l'assemblaggio di combinazioni sinergiche di enzimi sulla proteina scaffold non catalitica ("scaffoldin"), che comprende una poliproteina di domini di coesina specifici per il modulo dockerin di tipo I. A livelli più elevati, l'architettura cellulosomiale può diventare molto complessa, incorporando coppie alternative di coesina e dockerin (ad esempio tipo II, tipo III) che ancorano le strutture alla superficie cellulare e consentono l'assemblaggio di strutture ramificate contenenti più impalcature2. I vari tipi di coesina-dockerina, pur avendo strutture correlate, mostrano specificità di legame differenziali che sopprimono la reattività crociata con impalcature non intenzionali o componenti di altre specie batteriche produttrici di cellulosoma. Mentre gli approcci bioinformatici hanno identificato con successo migliaia di componenti cellulosomiali unici a livello genetico, sono note relativamente poche strutture proteiche e i meccanismi al lavoro nella determinazione della specificità coesina-dockerina rimangono un'area attiva della ricerca di biologia strutturale.
Dall'invenzione del microscopio a forza atomica (AFM) da parte di Binnig et al.3, varie modalità operative AFM sono state sviluppate e continuamente migliorate, tra cui l'imaging senza contatto, l'imaging in modalità di oscillazione4 e la spettroscopia di forza a singola molecola (SMFS)5,6. La SMFS si è evoluta in una tecnica ampiamente utilizzata per sondare direttamente le singole proteine7-11, gli acidi nucleici12-15 e i polimeri sintetici16-19. In un tipico esperimento SMFS per studiare il legame recettore-ligando20,21, una punta a sbalzo AFM viene modificata con uno dei partner di legame, mentre una superficie di vetro piatta viene modificata con il partner di legame complementare. Il cantilever modificato viene portato a contatto con la superficie permettendo ai partner di legarsi. La base del cantilever viene quindi ritirata a velocità costante e la forza viene misurata utilizzando il metodo di deflessione ottica della leva. Le tracce di dati forza-distanza risultanti mostrano picchi simili a denti di sega se il legame è stato stabilito. Nei casi in cui i partner di legame sono fusi a più domini proteici, ogni picco nella traccia forza-distanza può essere correlato al dispiegamento di un singolo dominio proteico o sottodominio ripiegato, mentre l'ultimo picco corrisponde alla rottura dell'interfaccia di legame proteico. Le posizioni specifiche degli elementi resistenti alla forza possono essere utilizzate come impronta digitale per identificare i vari domini proteici di interesse. Questo metodo può essere utilizzato per interrogare importanti amminoacidi coinvolti nel ripiegamento e nella stabilizzazione delle proteine. In letteratura sono stati riportati molti modelli per trattare il comportamento caratteristico di estensione della forza osservato negli esperimenti SMFS. I modelli più comunemente usati includono la catena a giunzione libera (FJC) modello22, la catena a vite senza fine (WLC) modello18,23-25 e la catena a rotazione libera (FRC) modello25,26.
Nel nostro precedente lavoro11, abbiamo utilizzato la spettroscopia di forza a singola molecola per studiare l'interazione dei moduli di coesina e dockerina. Qui, presentiamo un protocollo sperimentale per la funzionalizzazione di superfici in vetro e cantilever con costrutti proteici enzima-dockerina e CBM-coesina. Presentiamo anche un protocollo SMFS basato su AFM che include procedure di acquisizione e analisi dei dati. Il protocollo descritto può essere facilmente generalizzato ad altri sistemi molecolari e dovrebbe rivelarsi particolarmente utile per i ricercatori interessati a coppie di ligandi recettoriali ad alta affinità.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropil dimetil etossisilano</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimmide</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel riducente del disolfuro</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)aminometano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini cantilever in nitruro di silicio</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lotti morbidi</td></tr><tr><td>XYZ Attuatori piezoelettrici</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarossi " ampio spettro" Laser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Controller</td><td>Ricerca Asilo</td><td></td><td></td></tr>: <tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Acquisizione e analisi dati</td></tr><tr><td>: Cloruro</td><td></td><td></td><td></td>di</tr><tr><td>sodio, Cloruro</td><td></td><td></td><td></td>di calcio</tr>, <tr><td>pHmetro</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Borato</td><td></td><td></td><td></td> di sodio</tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copriocchiali</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm di diametro, 0,5 mm di spessore</td></tr><tr><td>PTFE portacampioni</td><td></td><td></td><td>su misura</td></tr><tr><td>Bagno</td><td></td><td></td><td></td>sonicatore</tr><tr><td>Purezza analitica</td><td>dell'etanolo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico (concentrato)</td><td></td><td></td> <td>purezza analitica</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (30%)</td><td></td><td></td> <td>purezza analitica</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td></td><td></td><td>purezza analitica Carta</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>da filtro</td></tr><tr><td>Vetrini Microprovette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td>adatta per microprovette</td></tr><tr><td>Rotatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Piastre <td></td><td></td><td></td><td>di Petri</td></tr><tr><td>Bicchieri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td> ottico</tr></tbody></table>

indagare sistemi recettore-ligando del cellulosome con sede a afm singola molecola di forza spettroscopia

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

I cellulosomi sono complessi multienzimatici discreti utilizzati da un sottoinsieme di batteri e funghi anaerobi per digerire substrati lignocellulosici. L'assemblaggio degli enzimi sulla proteina scaffold non catalitica è diretto dalle interazioni tra una famiglia di coppie recettore-ligando correlate che comprendono moduli interagenti di coesina e dockerina. Il legame estremamente forte tra i moduli coesina e dockerin si traduce in costanti di dissociazione nell'intervallo da picomolare a nanomolare, che può ostacolare misure accurate fuori velocità con i metodi di massa convenzionali. La spettroscopia di forza a singola molecola (SMFS) con il microscopio a forza atomica misura la risposta delle singole biomolecole alla forza e, a differenza di altri metodi di manipolazione a singola molecola (ad esempio le pinzette ottiche), è ottimale per lo studio delle interazioni recettore-ligando ad alta affinità grazie alla sua capacità di sondare il regime ad alta forza (>120 pN). Qui presentiamo il nostro protocollo completo per lo studio degli assemblaggi di proteine cellulosomiali a livello di singola molecola. Utilizzando una topologia proteica derivata dal cellulosoma nativo, abbiamo lavorato con proteine di fusione enzima-dockerina e modulo di legame dei carboidrati (CBM-coesina), ciascuna con un gruppo tiolico libero accessibile in un residuo di cisteina ingegnerizzato. Presentiamo il nostro protocollo di immobilizzazione superficiale sito-specifico, insieme alla nostra procedura di misurazione e analisi dei dati per ottenere parametri di legame dettagliati per il complesso ad alta affinità. Dimostriamo come quantificare le forze di dispiegamento di un singolo sottodominio, le forze di rottura complesse, gli off-rate cinetici e le larghezze potenziali del pozzo di legame. Viene ulteriormente descritta l'applicazione di successo di questi metodi nella caratterizzazione dell'interazione coesina-dockerina responsabile dell'assemblaggio di complessi cellulolitici multidominio.

Abbiamo utilizzato la procedura descritta per studiare una coppia coesina-dockerina di tipo I proveniente da C. thermocellum. Dopo il legame riuscito tra la coppia coesina-dockerina, i tracciati forza-distanza registrati hanno mostrato schemi caratteristici di picchi. Un tracciato tipico è mostrato in Figura 4a. Ogni picco nel tracciato rappresenta lo svolgimento di un singolo sottodominio proteico, con l'ultimo picco che corrisponde alla dissociazione del complesso recettore-legante.
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I cellulosomi sono complessi multienzimatici progettati per digerire la cellulosa. La SMFS basata su AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche e la configurazione di ripiegamento degli assemblaggi proteici associati al cellulosoma. Presentiamo un flusso di lavoro completo per l'immobilizzazione delle proteine, l'acquisizione e l'analisi dei dati per studiare le interazioni dei singoli complessi recettore-ligando coinvolti nell'assemblaggio del cellulosoma.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le proprietà meccaniche e gli stati di ripiegamento dei partner di legame delle proteine di fusione mediante spettroscopia di forza a singola molecola basata su FM. Questo viene ottenuto immobilizzando covalentemente i partner di legame proteici su un vetrino di vetro e su una mensola portante AFM per ottenere una geometria di trazione ben definita come secondo passaggio. La superficie di vetro viene indentata con la mensola portante, permettendo così l'instaurarsi del legame recettore-ligando.Successivamente, la mensola viene ritratta a velocità costante al fine di svolgere singoli domini proteici e associare il complesso recettore-legante; i risultati ottenuti rivelano elementi strutturali terziari che agiscono come barriere energetiche lungo il percorso di svolgimento, evidenziati nei modelli di elasticità dei polimeri. Ulteriori informazioni cinetiche ed energetiche riguardo alle coppie di legame possono essere ottenute adattando modelli cinetici allo spettro dinamico della forza. L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i percorsi di svolgimento delle proteine sotto l'azione di una forza.Questo metodo può fornire informazioni sulla stabilità meccanica delle proteine. Può essere applicato a qualsiasi sistema proteina-recettore-legante che possa essere modificato con un gruppo funzionale accessibile. I ricercatori che utilizzano per la prima volta questo metodo possono incontrare difficoltà poiché i tempi sono cruciali e la manipolazione delle leve può risultare complessa.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biofisica, ad esempio in che modo si svolge una proteina multifunzionale. Per iniziare, posizionare due lamelline di vetro di 24 millimetri di diametro e 0,5 millimetri di spessore nel supporto A-P-T-F-E, quindi sottoporre le lamelline a ultrasuoni in una miscela 50 a 50 di etanolo e acqua ultrapura per 15 minuti.Al termine della sonificazione, risciacquare le lamelle con acqua ultrapura ed etcherizzarle in una soluzione piranha per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimuovere le lamelle, risciacquarle con acqua ultrapura e asciugarle con un flusso delicato di azoto. Successivamente, immergere le lamelle in una miscela di etanolo, acqua ultrapura e tre amino propil dimetil ahoy in rapporto 45:5:1.Posizionare i campioni immersi su un agitatore a temperatura ambiente per 60 minuti a circa 50 rotazioni al minuto. Successivamente immergere il vetrino in etanolo al 100%, seguito da acqua ultrapura, due volte ciascuno. Asciugare nuovamente i vetrini sotto un flusso delicato di azoto.Una volta asciutte, cuocere le lamelle in forno a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Conservare le lamelle non utilizzate sotto Argonne per un massimo di sei settimane per eseguire l'amminoizzazione delle punte in silicio. Posizionare innanzitutto quattro cantilever in silicio su un vetrino pulito e trattarli con ozono UV per 15 minuti.Quindi immergere le leve per tre minuti in una soluzione al 50 a 50 di etanolo e trimetossipropilsilano, insieme a punto 25% di acqua ultrapura. Successivamente, risciacquare le leve sequenzialmente per 60 secondi in becker di toluene, etanolo e acqua ultrapura. Asciugare con attenzione le leve su carta da filtro tra i risciacqui dopo l'ultimo risciacquo.Posizionare le leve su un vetrino pulito e riscaldarle a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Preparare due T di perle riducenti di TEP diss solfuro tagliando prima la punta di una punta da pipetta da 200 microlitri per allargarne il diametro, quindi trasferendo 100 microlitri della soluzione madre di perle in ciascun microtubo da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere un millilitro di TBS alla sospensione di perle TEP nei microtubi, e lavare le perle agitando brevemente i microtubi con un vortex.Quindi, centrifugare i campioni a 850 G per tre minuti per formare il pellet delle perle. Rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante utilizzando una pipetta micrometrica e risciacquare le perle due volte con un millilitro di TBS. Dopo ogni risciacquo, eseguire una centrifugazione. Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere una soluzione proteica concentrata a tre milligrammi per millilitro alle perle TEP in un rapporto di uno a due e mescolare delicatamente la sospensione agitando con la punta di una pipetta micrometrica, evitando di introdurre bolle d'aria.Quindi posizionare la sospensione di perle di proteina TEP su un agitatore rotante per 2,5 ore. Immergere le leve a occhi amminici e i coprioggetti in un tampone di boro di sodio a pH 8,5 per 45 minuti per deprotonare i gruppi amminici primari sulla superficie. Successivamente, portare il composto in polvere di N-H-S-P-E-G malam a temperatura ambiente e preparare 210 microlitri di soluzione a 25 micromolare agitandolo con vortex nel tampone di boro di sodio 8.La soluzione deve essere utilizzata il più rapidamente possibile a causa della durata estremamente breve della vita media di NHS. A pH 8,5, depositare rapidamente gocce di 30 microlitri di soluzione di N-H-S-P-E-G malam su una piastra di Petri e 90 microlitri su ogni altro coprioggetto di vetro. Posizionare con attenzione le levette all'interno delle gocce di 30 microlitri.Quindi capovolgere il vetrino senza la goccia su un altro contenente soluzione di N-H-S-P-E-G malam, in modo da formare un sandwich con la soluzione di N-H-S-P-E-G MALAM. Al centro, incubare le cantilever e i vetri di copertura con la soluzione di N-H-S-P-E-G MALAM a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare la perla TEP e la soluzione proteica ridotta a 100 GS per un minuto e raccogliere il surnatante.Successivamente, diluire la soluzione proteica con TBS. Mirare a una concentrazione proteica durante la coniugazione sulla superficie compresa tra 0,5 e due milligrammi per millilitro. Poi mettere da parte le soluzioni proteiche ridotte e diluite per alcuni minuti mentre si procede al risciacquo dei cantilever e dei coverslip.Risciacquare le lamelle in tre becker successivi contenenti acqua ultrapura. Rimuovere il liquido residuo dalle lamelle toccando con attenzione i bordi con carta da filtro. Quindi montare le lamelle in un portacampioni appropriato compatibile con lo strumento di microscopia a forza atomica (AFM) ed eliminare il liquido residuo con un flusso delicato di azoto.Applicare 20 microlitri della soluzione proteica diluita sotto forma di goccia al centro dei coverslip. Quindi risciacquare i cantilever in tre becher consecutivi contenenti acqua ultrapura, seguiti da gocce di 30 microlitri della seconda soluzione proteica diluita. Incubare i coverslip pegilati e i cantilever con le rispettive soluzioni proteiche diluite a temperatura ambiente per uno-due ore in una camera umida.Successivamente, utilizzare una pipetta per risciacquare le lamelle almeno 10 volte con un millilitro di TBS, quindi conservarle in TBS fino alla misurazione. Risciacquare anche le levette utilizzando tre becher contenenti TBS in successione per rimuovere le proteine non legate e conservarle anch'esse in TBS. Montare le levette funzionalizzate e le lamelle di vetro su un modello di microscopio a forza atomica (AFM) adatto alle misurazioni in liquido e che supporti un intervallo di velocità accessibile sul pietoelettrico Z di circa 200 a 5.000 nanometri al secondo.Quando si monta il sistema per ridurre al minimo l'esposizione all'aria, assicurarsi che le superfici rimangano ricoperte di tampone durante l'intero processo dopo un corretto allineamento del fascio laser. Far equilibrare il sistema per almeno 30 minuti per ridurre eventuali effetti di deriva e riaggiustare se necessario. Quindi iniziare a effettuare le misurazioni dopo un corretto legame della coesina.Docker in coppia i tracciati registrati di forza-distanza mostrati qui. Presentano un tipico andamento a picchi. Ogni picco nel tracciato rappresenta lo svolgimento di un singolo dominio proteico, con l'ultimo picco che corrisponde alla dissociazione del complesso recettore-legante.I tracciati registrati di forza-distanza sono quindi stati trasformati nello spazio forza-lunghezza del contorno e assemblati in un istogramma di posizione delle barriere. I dati mostrano un incremento della lunghezza del contorno di circa 89 nanometri, che può essere attribuito in modo univoco allo svolgimento del dominio xin per esplorare il paesaggio energetico del docker coesivo e delle interazioni. Un totale di 186 tracciati di dati è stato ottenuto a quattro diverse velocità di accumulo.Lo spettro di forza dinamico risultante, mostrato come grandi cerchi blu, rappresenta le forze di rottura più probabili a un determinato tasso di carico. Questi valori sono stati quindi adattati al modello di Bell Evans; l'adattamento ha fornito i valori di Koff e delta X, risultati in buon accordo con risultati precedentemente pubblicati. Una volta acquisita padronanza, la parte sperimentale di questa tecnica può essere completata in otto o nove ore.Successivamente a questo procedimento, una mutagenesi sito-specifica può essere eseguita in un esperimento successivo per determinare gli amminoacidi cruciali per il legame dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biofisica delle singole molecole per esplorare i paesaggi di ripiegamento proteico. La utilizziamo per studiare le proprietà meccaniche delle SOE della cellulosa, che sono tra i sistemi proteici più stabili meccanicamente conosciuti.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la spettroscopia di forza a singola molecola su coppie di recettore proteico e ligando.

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