Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le proprietà meccaniche e gli stati di ripiegamento dei partner di legame delle proteine di fusione mediante spettroscopia di forza a singola molecola basata su FM. Questo viene ottenuto immobilizzando covalentemente i partner di legame proteici su un vetrino di vetro e su una mensola portante AFM per ottenere una geometria di trazione ben definita come secondo passaggio. La superficie di vetro viene indentata con la mensola portante, permettendo così l'instaurarsi del legame recettore-ligando.

Successivamente, la mensola viene ritratta a velocità costante al fine di svolgere singoli domini proteici e associare il complesso recettore-legante; i risultati ottenuti rivelano elementi strutturali terziari che agiscono come barriere energetiche lungo il percorso di svolgimento, evidenziati nei modelli di elasticità dei polimeri. Ulteriori informazioni cinetiche ed energetiche riguardo alle coppie di legame possono essere ottenute adattando modelli cinetici allo spettro dinamico della forza. L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i percorsi di svolgimento delle proteine sotto l'azione di una forza.

Questo metodo può fornire informazioni sulla stabilità meccanica delle proteine. Può essere applicato a qualsiasi sistema proteina-recettore-legante che possa essere modificato con un gruppo funzionale accessibile. I ricercatori che utilizzano per la prima volta questo metodo possono incontrare difficoltà poiché i tempi sono cruciali e la manipolazione delle leve può risultare complessa.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biofisica, ad esempio in che modo si svolge una proteina multifunzionale. Per iniziare, posizionare due lamelline di vetro di 24 millimetri di diametro e 0,5 millimetri di spessore nel supporto A-P-T-F-E, quindi sottoporre le lamelline a ultrasuoni in una miscela 50 a 50 di etanolo e acqua ultrapura per 15 minuti.

Al termine della sonificazione, risciacquare le lamelle con acqua ultrapura ed etcherizzarle in una soluzione piranha per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimuovere le lamelle, risciacquarle con acqua ultrapura e asciugarle con un flusso delicato di azoto. Successivamente, immergere le lamelle in una miscela di etanolo, acqua ultrapura e tre amino propil dimetil ahoy in rapporto 45:5:1.

Posizionare i campioni immersi su un agitatore a temperatura ambiente per 60 minuti a circa 50 rotazioni al minuto. Successivamente immergere il vetrino in etanolo al 100%, seguito da acqua ultrapura, due volte ciascuno. Asciugare nuovamente i vetrini sotto un flusso delicato di azoto.

Una volta asciutte, cuocere le lamelle in forno a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Conservare le lamelle non utilizzate sotto Argonne per un massimo di sei settimane per eseguire l'amminoizzazione delle punte in silicio. Posizionare innanzitutto quattro cantilever in silicio su un vetrino pulito e trattarli con ozono UV per 15 minuti.

Quindi immergere le leve per tre minuti in una soluzione al 50 a 50 di etanolo e trimetossipropilsilano, insieme a punto 25% di acqua ultrapura. Successivamente, risciacquare le leve sequenzialmente per 60 secondi in becker di toluene, etanolo e acqua ultrapura. Asciugare con attenzione le leve su carta da filtro tra i risciacqui dopo l'ultimo risciacquo.

Posizionare le leve su un vetrino pulito e riscaldarle a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Preparare due T di perle riducenti di TEP diss solfuro tagliando prima la punta di una punta da pipetta da 200 microlitri per allargarne il diametro, quindi trasferendo 100 microlitri della soluzione madre di perle in ciascun microtubo da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere un millilitro di TBS alla sospensione di perle TEP nei microtubi, e lavare le perle agitando brevemente i microtubi con un vortex.

Quindi, centrifugare i campioni a 850 G per tre minuti per formare il pellet delle perle. Rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante utilizzando una pipetta micrometrica e risciacquare le perle due volte con un millilitro di TBS. Dopo ogni risciacquo, eseguire una centrifugazione. Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere una soluzione proteica concentrata a tre milligrammi per millilitro alle perle TEP in un rapporto di uno a due e mescolare delicatamente la sospensione agitando con la punta di una pipetta micrometrica, evitando di introdurre bolle d'aria.

Quindi posizionare la sospensione di perle di proteina TEP su un agitatore rotante per 2,5 ore. Immergere le leve a occhi amminici e i coprioggetti in un tampone di boro di sodio a pH 8,5 per 45 minuti per deprotonare i gruppi amminici primari sulla superficie. Successivamente, portare il composto in polvere di N-H-S-P-E-G malam a temperatura ambiente e preparare 210 microlitri di soluzione a 25 micromolare agitandolo con vortex nel tampone di boro di sodio 8.

La soluzione deve essere utilizzata il più rapidamente possibile a causa della durata estremamente breve della vita media di NHS. A pH 8,5, depositare rapidamente gocce di 30 microlitri di soluzione di N-H-S-P-E-G malam su una piastra di Petri e 90 microlitri su ogni altro coprioggetto di vetro. Posizionare con attenzione le levette all'interno delle gocce di 30 microlitri.

Quindi capovolgere il vetrino senza la goccia su un altro contenente soluzione di N-H-S-P-E-G malam, in modo da formare un sandwich con la soluzione di N-H-S-P-E-G MALAM. Al centro, incubare le cantilever e i vetri di copertura con la soluzione di N-H-S-P-E-G MALAM a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare la perla TEP e la soluzione proteica ridotta a 100 GS per un minuto e raccogliere il surnatante.

Successivamente, diluire la soluzione proteica con TBS. Mirare a una concentrazione proteica durante la coniugazione sulla superficie compresa tra 0,5 e due milligrammi per millilitro. Poi mettere da parte le soluzioni proteiche ridotte e diluite per alcuni minuti mentre si procede al risciacquo dei cantilever e dei coverslip.

Risciacquare le lamelle in tre becker successivi contenenti acqua ultrapura. Rimuovere il liquido residuo dalle lamelle toccando con attenzione i bordi con carta da filtro. Quindi montare le lamelle in un portacampioni appropriato compatibile con lo strumento di microscopia a forza atomica (AFM) ed eliminare il liquido residuo con un flusso delicato di azoto.

Applicare 20 microlitri della soluzione proteica diluita sotto forma di goccia al centro dei coverslip. Quindi risciacquare i cantilever in tre becher consecutivi contenenti acqua ultrapura, seguiti da gocce di 30 microlitri della seconda soluzione proteica diluita. Incubare i coverslip pegilati e i cantilever con le rispettive soluzioni proteiche diluite a temperatura ambiente per uno-due ore in una camera umida.

Successivamente, utilizzare una pipetta per risciacquare le lamelle almeno 10 volte con un millilitro di TBS, quindi conservarle in TBS fino alla misurazione. Risciacquare anche le levette utilizzando tre becher contenenti TBS in successione per rimuovere le proteine non legate e conservarle anch'esse in TBS. Montare le levette funzionalizzate e le lamelle di vetro su un modello di microscopio a forza atomica (AFM) adatto alle misurazioni in liquido e che supporti un intervallo di velocità accessibile sul pietoelettrico Z di circa 200 a 5.000 nanometri al secondo.

Quando si monta il sistema per ridurre al minimo l'esposizione all'aria, assicurarsi che le superfici rimangano ricoperte di tampone durante l'intero processo dopo un corretto allineamento del fascio laser. Far equilibrare il sistema per almeno 30 minuti per ridurre eventuali effetti di deriva e riaggiustare se necessario. Quindi iniziare a effettuare le misurazioni dopo un corretto legame della coesina.

Docker in coppia i tracciati registrati di forza-distanza mostrati qui. Presentano un tipico andamento a picchi. Ogni picco nel tracciato rappresenta lo svolgimento di un singolo dominio proteico, con l'ultimo picco che corrisponde alla dissociazione del complesso recettore-legante.

I tracciati registrati di forza-distanza sono quindi stati trasformati nello spazio forza-lunghezza del contorno e assemblati in un istogramma di posizione delle barriere. I dati mostrano un incremento della lunghezza del contorno di circa 89 nanometri, che può essere attribuito in modo univoco allo svolgimento del dominio xin per esplorare il paesaggio energetico del docker coesivo e delle interazioni. Un totale di 186 tracciati di dati è stato ottenuto a quattro diverse velocità di accumulo.

Lo spettro di forza dinamico risultante, mostrato come grandi cerchi blu, rappresenta le forze di rottura più probabili a un determinato tasso di carico. Questi valori sono stati quindi adattati al modello di Bell Evans; l'adattamento ha fornito i valori di Koff e delta X, risultati in buon accordo con risultati precedentemente pubblicati. Una volta acquisita padronanza, la parte sperimentale di questa tecnica può essere completata in otto o nove ore.

Successivamente a questo procedimento, una mutagenesi sito-specifica può essere eseguita in un esperimento successivo per determinare gli amminoacidi cruciali per il legame dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biofisica delle singole molecole per esplorare i paesaggi di ripiegamento proteico. La utilizziamo per studiare le proprietà meccaniche delle SOE della cellulosa, che sono tra i sistemi proteici più stabili meccanicamente conosciuti.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la spettroscopia di forza a singola molecola su coppie di recettore proteico e ligando.