Name: Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Scopri le proprietà meccaniche dei cellulosome con spettroscopia di forza molecolare singola basata su AFM. Questo metodo rivela barriere energetiche strutturali e interazioni recettore-ligando per applicazioni biotecnologiche.

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Gli autori riconoscono il finanziamento di una sovvenzione avanzata del Consiglio Europeo della Ricerca a Hermann Gaub. Michael A. Nash ringrazia con gratitudine il finanziamento da parte di Society in Science - The Branco Weiss Fellowship program. Gli autori ringraziano Edward A. Bayer, Yoav Barak e Daniel B. Fried del Weizmann Institute of Science per aver generosamente fornito le proteine utilizzate in questo studio. Gli autori ringraziano Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner e Stefan W. Stahl per le utili discussioni.

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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Per ottenere dati significativi dagli esperimenti di spettroscopia di forza di una singola molecola, è fondamentale ottenere geometrie di trazione ben definite e riproducibili. Il protocollo qui utilizzato si traduce nell'immobilizzazione sito-specifica di complessi proteici in una geometria di trazione definita.
I cantilever utilizzati in questo studio sono stati scelti per la loro sensibilità alla forza e l'elevata frequenza di risonanza in acqua. Inoltre, la piccola curvatura della punta di...

I cellulosomi sono grandi complessi multienzimatici visualizzati sulla superficie di batteri cellulolitici anaerobi (ad es. C. thermocellum) che si sono evoluti per depolimerizzare in modo efficiente la lignocellulosa della parete cellulare vegetale in oligosaccaridi solubili1. Un attributo centrale dei cellulosomi è l'interazione coesina-dockerina ad alta affinità. Nel paradigma più importante, un modulo di docherina altamente conservato di 60-75 aminoacidi di tipo I è visualizzato all'estremità C-terminale dei vari enzimi batterici. Il modulo dockerin dirige l'assemblaggio di combinazioni sinergiche di enzimi sulla proteina scaffold non catalitica ("scaffoldin"), che comprende una poliproteina di domini di coesina specifici per il modulo dockerin di tipo I. A livelli più elevati, l'architettura cellulosomiale può diventare molto complessa, incorporando coppie alternative di coesina e dockerin (ad esempio tipo II, tipo III) che ancorano le strutture alla superficie cellulare e consentono l'assemblaggio di strutture ramificate contenenti più impalcature2. I vari tipi di coesina-dockerina, pur avendo strutture correlate, mostrano specificità di legame differenziali che sopprimono la reattività crociata con impalcature non intenzionali o componenti di altre specie batteriche produttrici di cellulosoma. Mentre gli approcci bioinformatici hanno identificato con successo migliaia di componenti cellulosomiali unici a livello genetico, sono note relativamente poche strutture proteiche e i meccanismi al lavoro nella determinazione della specificità coesina-dockerina rimangono un'area attiva della ricerca di biologia strutturale.
Dall'invenzione del microscopio a forza atomica (AFM) da parte di Binnig et al.3, varie modalità operative AFM sono state sviluppate e continuamente migliorate, tra cui l'imaging senza contatto, l'imaging in modalità di oscillazione4 e la spettroscopia di forza a singola molecola (SMFS)5,6. La SMFS si è evoluta in una tecnica ampiamente utilizzata per sondare direttamente le singole proteine7-11, gli acidi nucleici12-15 e i polimeri sintetici16-19. In un tipico esperimento SMFS per studiare il legame recettore-ligando20,21, una punta a sbalzo AFM viene modificata con uno dei partner di legame, mentre una superficie di vetro piatta viene modificata con il partner di legame complementare. Il cantilever modificato viene portato a contatto con la superficie permettendo ai partner di legarsi. La base del cantilever viene quindi ritirata a velocità costante e la forza viene misurata utilizzando il metodo di deflessione ottica della leva. Le tracce di dati forza-distanza risultanti mostrano picchi simili a denti di sega se il legame è stato stabilito. Nei casi in cui i partner di legame sono fusi a più domini proteici, ogni picco nella traccia forza-distanza può essere correlato al dispiegamento di un singolo dominio proteico o sottodominio ripiegato, mentre l'ultimo picco corrisponde alla rottura dell'interfaccia di legame proteico. Le posizioni specifiche degli elementi resistenti alla forza possono essere utilizzate come impronta digitale per identificare i vari domini proteici di interesse. Questo metodo può essere utilizzato per interrogare importanti amminoacidi coinvolti nel ripiegamento e nella stabilizzazione delle proteine. In letteratura sono stati riportati molti modelli per trattare il comportamento caratteristico di estensione della forza osservato negli esperimenti SMFS. I modelli più comunemente usati includono la catena a giunzione libera (FJC) modello22, la catena a vite senza fine (WLC) modello18,23-25 e la catena a rotazione libera (FRC) modello25,26.
Nel nostro precedente lavoro11, abbiamo utilizzato la spettroscopia di forza a singola molecola per studiare l'interazione dei moduli di coesina e dockerina. Qui, presentiamo un protocollo sperimentale per la funzionalizzazione di superfici in vetro e cantilever con costrutti proteici enzima-dockerina e CBM-coesina. Presentiamo anche un protocollo SMFS basato su AFM che include procedure di acquisizione e analisi dei dati. Il protocollo descritto può essere facilmente generalizzato ad altri sistemi molecolari e dovrebbe rivelarsi particolarmente utile per i ricercatori interessati a coppie di ligandi recettoriali ad alta affinità.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropil dimetil etossisilano</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimmide</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel riducente del disolfuro</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)aminometano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini cantilever in nitruro di silicio</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lotti morbidi</td></tr><tr><td>XYZ Attuatori piezoelettrici</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarossi " ampio spettro" Laser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Controller</td><td>Ricerca Asilo</td><td></td><td></td></tr>: <tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Acquisizione e analisi dati</td></tr><tr><td>: Cloruro</td><td></td><td></td><td></td>di</tr><tr><td>sodio, Cloruro</td><td></td><td></td><td></td>di calcio</tr>, <tr><td>pHmetro</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Borato</td><td></td><td></td><td></td> di sodio</tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copriocchiali</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm di diametro, 0,5 mm di spessore</td></tr><tr><td>PTFE portacampioni</td><td></td><td></td><td>su misura</td></tr><tr><td>Bagno</td><td></td><td></td><td></td>sonicatore</tr><tr><td>Purezza analitica</td><td>dell'etanolo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico (concentrato)</td><td></td><td></td> <td>purezza analitica</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (30%)</td><td></td><td></td> <td>purezza analitica</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td></td><td></td><td>purezza analitica Carta</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>da filtro</td></tr><tr><td>Vetrini Microprovette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td>adatta per microprovette</td></tr><tr><td>Rotatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Piastre <td></td><td></td><td></td><td>di Petri</td></tr><tr><td>Bicchieri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td> ottico</tr></tbody></table>

indagare sistemi recettore-ligando del cellulosome con sede a afm singola molecola di forza spettroscopia

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

I cellulosomi sono complessi multienzimatici discreti utilizzati da un sottoinsieme di batteri e funghi anaerobi per digerire substrati lignocellulosici. L'assemblaggio degli enzimi sulla proteina scaffold non catalitica è diretto dalle interazioni tra una famiglia di coppie recettore-ligando correlate che comprendono moduli interagenti di coesina e dockerina. Il legame estremamente forte tra i moduli coesina e dockerin si traduce in costanti di dissociazione nell'intervallo da picomolare a nanomolare, che può ostacolare misure accurate fuori velocità con i metodi di massa convenzionali. La spettroscopia di forza a singola molecola (SMFS) con il microscopio a forza atomica misura la risposta delle singole biomolecole alla forza e, a differenza di altri metodi di manipolazione a singola molecola (ad esempio le pinzette ottiche), è ottimale per lo studio delle interazioni recettore-ligando ad alta affinità grazie alla sua capacità di sondare il regime ad alta forza (>120 pN). Qui presentiamo il nostro protocollo completo per lo studio degli assemblaggi di proteine cellulosomiali a livello di singola molecola. Utilizzando una topologia proteica derivata dal cellulosoma nativo, abbiamo lavorato con proteine di fusione enzima-dockerina e modulo di legame dei carboidrati (CBM-coesina), ciascuna con un gruppo tiolico libero accessibile in un residuo di cisteina ingegnerizzato. Presentiamo il nostro protocollo di immobilizzazione superficiale sito-specifico, insieme alla nostra procedura di misurazione e analisi dei dati per ottenere parametri di legame dettagliati per il complesso ad alta affinità. Dimostriamo come quantificare le forze di dispiegamento di un singolo sottodominio, le forze di rottura complesse, gli off-rate cinetici e le larghezze potenziali del pozzo di legame. Viene ulteriormente descritta l'applicazione di successo di questi metodi nella caratterizzazione dell'interazione coesina-dockerina responsabile dell'assemblaggio di complessi cellulolitici multidominio.

Abbiamo utilizzato la procedura descritta per studiare una coppia coesina-dockerina di tipo I proveniente da C. thermocellum. Dopo il legame riuscito tra la coppia coesina-dockerina, i tracciati forza-distanza registrati hanno mostrato schemi caratteristici di picchi. Un tracciato tipico è mostrato in Figura 4a. Ogni picco nel tracciato rappresenta lo svolgimento di un singolo sottodominio proteico, con l'ultimo picco che corrisponde alla dissociazione del complesso recettore-legante.
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I cellulosomi sono complessi multienzimatici progettati per digerire la cellulosa. La SMFS basata su AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche e la configurazione di ripiegamento degli assemblaggi proteici associati al cellulosoma. Presentiamo un flusso di lavoro completo per l'immobilizzazione delle proteine, l'acquisizione e l'analisi dei dati per studiare le interazioni dei singoli complessi recettore-ligando coinvolti nell'assemblaggio del cellulosoma.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le proprietà meccaniche e gli stati di ripiegamento dei partner di legame delle proteine di fusione mediante spettroscopia di forza a singola molecola basata su FM. Questo viene ottenuto immobilizzando covalentemente i partner di legame proteici su un vetrino di vetro e su una mensola portante AFM per ottenere una geometria di trazione ben definita come secondo passaggio. La superficie di vetro viene indentata con la mensola portante, permettendo così l'instaurarsi del legame recettore-ligando.Successivamente, la mensola viene ritratta a velocità costante al fine di svolgere singoli domini proteici e associare il complesso recettore-legante; i risultati ottenuti rivelano elementi strutturali terziari che agiscono come barriere energetiche lungo il percorso di svolgimento, evidenziati nei modelli di elasticità dei polimeri. Ulteriori informazioni cinetiche ed energetiche riguardo alle coppie di legame possono essere ottenute adattando modelli cinetici allo spettro dinamico della forza. L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i percorsi di svolgimento delle proteine sotto l'azione di una forza.Questo metodo può forn

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Viene presentato un protocollo per accoppiare covalentemente una grande varietà di singole molecole su una punta AFM. Vengono fornite procedure ed esempi per determinare la forza di adesione e l'energia libera di queste molecole su supporti solidi e bio-interfacce.

Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Descriviamo un protocollo per la preparazione di doppi strati lipidici supportati e la sua caratterizzazione utilizzando la microscopia a forza atomica e la spettroscopia a forza.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Descriviamo una tecnica per misurare contemporaneamente la cinetica di legame del singolo recettore-ligando regolata dalla forza e l'imaging in tempo reale della segnalazione del calcio in un singolo linfocita T.

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Vi presentiamo un metodo per ottenere immagini a risoluzione sub-nanometrica con (modalità tapping) modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in un liquido. Il metodo è dimostrata su microscopi commerciali a forza atomica. Spieghiamo la logica alla base delle nostre scelte di parametri e di suggerire strategie per l'ottimizzazione risoluzione.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Descriviamo le procedure dettagliate e le strategie per misurare le proprietà meccaniche e percorsi meccanici spiegamento di singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica. Mostriamo anche risultati rappresentativi come riferimento per la selezione e giustificazione delle registrazioni di buona singola proteina molecola.

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

Questo protocollo descrive l'immobilizzazione covalente di proteine con un eterobifunzionali silanico per superfici di ossido di silicio progettati per la spettroscopia della forza singola molecola basata di microscopia forza atomica che è esemplificato dalla interazione di RrgA (adesina pilus-1 punta di S. pneumoniae) con fibronectina.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare i cantilever a forza atomica (AFM) con una singola cellula T e particelle di perline per studi immunologici. Vengono mostrate le procedure per sondare il legame di cellula-cellula T a una singola coppia da parte di AFM e per monitorare la risposta cellulare in tempo reale dei macrofagi a una singola particella solida da AFM con imaging a fluorescenza.

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Qui, presentiamo un protocollo per coniugare il monomero proteico mediante enzimi formando polimeri proteici con una sequenza controllata e immobilizzandolo sulla superficie per studi di spettroscopia di forza singola molecola.

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

L'attaccamento covalente delle molecole della sonda alle punte a sbalzo a forza atomica (AFM) è una tecnica essenziale per lo studio delle loro proprietà fisiche. Questo ci permette di determinare la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza dei polimeri tramite la spettroscopia a forza singola a singola molecola basata su AFM con elevata riproducibilità.

Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) fornisce una potente piattaforma per studi batterici, consentendo di raggiungere una risoluzione su scala nanometrica. Sia la mappatura dei cambiamenti subcellulari (ad esempio, sulla divisione cellulare) che gli studi comparativi della composizione chimica (ad esempio, derivanti dalla resistenza ai farmaci) possono essere condotti a livello di singola cellula nei batteri.

Microscopia a forza atomica combinata con la spettroscopia infrarossa come strumento per sondare la chimica del singolo batterio

Scopri le proprietà meccaniche dei cellulosome con spettroscopia di forza molecolare singola basata su AFM. Questo metodo rivela barriere energetiche strutturali e interazioni recettore-ligando per applicazioni biotecnologiche.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

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