Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule dendritiche e cellule epiteliali dal timo umano. Questo viene ottenuto frammentando innanzitutto il tessuto dissezionato mediante dissociazione meccanica. Successivamente, i frammenti di tessuto vengono ulteriormente digeriti enzimaticamente per produrre una sospensione di singole cellule.

Infine, la sospensione cellulare viene arricchita per la frazione di cellule a bassa densità mediante separazione su gradiente Percoll. In definitiva, le cellule dendritiche ed epiteliali possono essere isolate da questa frazione mediante sorting magnetico o FACS, oppure una combinazione di entrambi i metodi. Il metodo qui presentato fornisce una procedura efficiente, riproducibile ed economica per l'isolamento con successo e lo studio successivo di popolazioni cellulari rare come le cellule dendritiche e le cellule epiteliali timiche presenti nel timo umano.

Un nostro studente laureando, I rotta, illustrerà la procedura. Iniziare ponendo il tessuto timico in una piastra di Petri contenente PBS sterile a temperatura ambiente e risciacquare eventuali residui di sangue. Quindi aggiungere PBS fresco nella piastra di Petri e utilizzare pinzette e forbici per rimuovere eventuali coaguli di sangue, tessuto connettivo e adiposo, e tutte le parti del tessuto che non appaiono sane.

Una volta che il tessuto del timo è pulito, pesatelo come riferimento e quindi tagliate il tessuto in pezzi uniformi di un centimetro cubo. Coprite ora i pezzi con PBS e poneteli sul ghiaccio. Utilizzate quindi la parte posteriore dello stantuffo di una siringa sterile da 10 a 20 millilitri per applicare rapidamente una leggera pressione sul tessuto, in modo da rimuovere la maggior parte dei timociti e ridurre il volume complessivo del tessuto da digerire.

La soluzione diventerà visibilmente torbida. Mentre i timociti vengono rilasciati, agitare delicatamente la piastra e quindi utilizzare un aspiratore di vetro per rimuovere il soprannatante contenente il timo, avendo cura di non aspirare accidentalmente i pezzi di tessuto. Può essere utile utilizzare un raschietto sterile per colture cellulari per concentrare tutti i pezzi di tessuto su un lato della piastra, quindi inclinare la piastra a un angolo di 45 gradi ed aspirare il soprannatante rimanente.

Risciacquare la piastra con PBS fresco e continuare a raccogliere il sopranatante fino a quando il PBS risulti relativamente trasparente. Eseguire un ultimo lavaggio con RPMI, quindi utilizzare forbici affilate per tritare i pezzi di tessuto nel modo più fine possibile, riducendoli almeno a dimensioni sufficientemente piccole da poter entrare in una pipetta da cinque millilitri per isolare le cellule dendritiche o dc. Inserire innanzitutto fino a 10 grammi di pezzi di tessuto in maglie in provette da 50 millilitri con 10 millilitri di soluzione di collaghenasi-DNA e 10 millilitri di RPMI ogni cinque grammi di tessuto.

Quindi incubare la sospensione tissutale per 40 minuti sotto rotazione lenta in un incubatore termico a 37 gradi Celsius. La soluzione enzimatica diventerà torbida man mano che le cellule vengono rilasciate al suo interno. Al termine della digestione, centrifugare la sospensione cellulare per due minuti a 110 G e a temperatura ambiente per sedimentare i frammenti tissutali, raccogliere il soprannatante e quindi pellettizzare la sospensione cellulare.

In questa fase, scartare il soprannatante e risospendere le cellule in 10-50 millilitri di RPMI completo. In base alle dimensioni del pellet, determinare il numero di cellule vitali mediante esclusione al trian blu, quindi collocare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius con tappo allentato per isolare le cellule epiteliali timiche o t. Successivamente, risospendere i residui di tessuto in 10 millilitri di soluzione fresca di collaghenasi e DNA, più 10 millilitri di RPMI e tripsina EDTA.

Digerire ulteriormente i frammenti di tessuto per 40 minuti a 37 gradi Celsius con rotazione delicata. Durante gli ultimi 10-15 minuti dell'incubazione, aggiungere siero di vitello fetale in rapporto di uno a cinque per neutralizzare la tripsina. Dopo aver centrifugato i frammenti di tessuto, raccogliere il soprannatante e centrifugare nuovamente la sospensione cellulare.

In questa fase aspirare con attenzione e scartare il soprannatante, avendo cura di preservare il pellet morbido. Dopo aver contato il numero di cellule vitali, mantenere questa sospensione cellulare a 37 gradi Celsius. Per arricchire la frazione a bassa densità o le cellule LDF, iniziare centrifugando le sospensioni cellulari precedentemente messe da parte per l'arricchimento di DC e tech, mentre le cellule sedimentano.

Impostare un gradiente di densità di 1,07 grammi per millilitro per soluzione cellulare. Secondo questa tabella, risospendere entrambi i pellet fino a 1 × 10⁹ cellule in sei millilitri della soluzione per cellule preparata. Mescolare adeguatamente la soluzione cellulare per ottenere una sospensione omogenea, quindi trasferire le soluzioni in provette da centrifuga in policarbonato Oakridge da 50 millilitri con tappo a vite.

Successivamente, utilizzare una pipetta per stratificare lentamente 30 millilitri di RPMI completo per provetta sulla sospensione cellulare di perca. Avendo cura di non mescolare gli strati, trasferire con attenzione le provette in una centrifuga preraffreddata con rotore ad angolo fisso e separare le cellule per 35 minuti. Quindi, utilizzare pipette sterili posteriori per trasferire con attenzione le frazioni cellulari a bassa densità arricchite dall'interfaccia tra la perca e il mezzo in provette da 50 millilitri contenenti RPMI completo freddo.

Successivamente, aggiungo ulteriore RPMI completo nei tubi per diluire il per cellula rimanente. Infine, lavo le cellule arricchite due volte con RPMI incompleto, risospendo quindi il pellet in mezzo fresco e determinando il numero di cellule vitali in questo primo grafico. Viene mostrato un pezzo di tessuto piuttosto grande, di nove centimetri, ottenuto da un bambino di 6 anni, come appena illustrato.

Un importante primo passo consiste nel pulire il tessuto dalle parti indesiderate. Come indicato dalle frecce bianche, si è quindi ottenuta una sospensione di singole cellule del tessuto timico, arricchita per le cellule della frazione a bassa densità. Mentre una tipica sospensione di singole cellule contiene circa il 3% di cellule positive per H-L-A-D-R dopo la separazione mediante gradiente di densità, questa percentuale aumenta dal 15 al 40% nelle cellule di grandi dimensioni.

Frazione a bassa densità nella frazione ad alta densità, che consiste principalmente di timociti di piccole dimensioni e uniformi. Non esistono praticamente cellule di questo tipo nel timo.

I globuli dendritici mieloidi possono essere identificati mediante l'espressione di diversi marcatori di superficie, tra cui CD11c. Questa figura mostra l'isolamento efficiente di cellule positive per CD11c mediante un protocollo modificato di separazione cellulare magnetica dopo l'isolamento. La purezza dei DC positivi per CD11c era del 93%, come stabilito mediante immunomarcatura delle cellule isolate. In media, il recupero delle cellule positive per CD11c isolate è compreso tra 5 × 10⁵ e 5 × 10⁶ globuli dendritici mieloidi ogni 10⁹ cellule timiche totali.

In questa tabella vengono mostrati dati rappresentativi ottenuti da diversi campioni individuali di timo di età e peso tissutale diversi, con un intervallo di sospensioni cellulari singole in ingresso, nonché il numero totale di cellule della frazione a bassa densità e la resa e purezza successive di CD11c positiva, nella frazione arricchita in cellule presentanti l'antigene. Circa lo 0,5% delle cellule sono cellule epiteliali corticali CD45, EPCA positivo a bassa intensità o CD45 negative e cellule epiteliali midollari EPAM positive, che possono essere separate dai cellule stromali arricchite CD45 negative a bassa intensità digerite con tripsina come epam, CDR2 positivo a bassa intensità e epam alto CD2 negativo rispettivamente. L'isolamento di cellule dendritiche e sottopopolazioni di cellule epiteliali timiche da timo umano.

È un procedimento sensibile al tempo. Più rapida è la procedura di ululazione, migliore sarà lo stato delle cellule. Una volta padroneggiato questo protocollo, le cellule dendritiche possono essere isolate entro cinque-sei ore e le cellule epiteliali timiche entro otto-dieci ore.

Dopo aver visto questo video oggi, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare il tessuto timico umano per un'efficace isolazione di cellule dendritiche e cellule epiteliali timiche. Le cellule isolate possono quindi essere utilizzate in molteplici applicazioni successive per ulteriori studi, al fine di caratterizzare meglio le cellule e comprenderne la biologia.