A Novel tridimensionale del flusso Camera dispositivo per studiare Chemokine-diretto stravaso di cellule circolanti in condizioni di flusso fisiologici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare quantitativamente la migrazione di cellule circolanti lungo un gradiente chemiotattico. In condizioni di stress fisiologico da taglio, ciò si ottiene coltivando prima un monostrato di cellule endoteliali su inserti microporosi rivestiti di collagene, quindi assemblando questi inserti in una camera a flusso, dove essi ricoprono un compartimento statico separato contenente chemochine. Successivamente, viene applicato alle cellule uno stress da taglio per mimare le condizioni fisiologiche presenti nel sistema vascolare.

Come secondo passaggio, si permette a cellule di interesse, come cellule staminali emopoietiche, leucociti o cellule tumorali, di circolare nel sistema 3D durante il flusso. I componenti presenti nel compartimento statico influenzano l'efficienza delle interazioni tra le cellule circolanti e le cellule endoteliali e, di conseguenza, la velocità di trasimigrazione delle cellule test attraverso lo strato endoteliale. Successivamente, il sistema 3D viene smontato e le cellule test trasimigrate vengono raccolte dal compartimento statico inferiore al fine di misurare quantitativamente l'adesione cellulare mediante diversi metodi all'avanguardia; i risultati ottenuti mostrano la capacità delle cellule test circolanti di interagire con le cellule endoteliali in condizioni di flusso fisiologico e di uscire dalla circolazione in base alla concentrazione di chemochine presente nel compartimento statico.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'utilizzo di camere a flusso lamellare parallelo e saggi di trasferimento statico, è che combina sia lo stress di taglio nel compartimento superiore sia il gradiente di chemoattrattanti nel compartimento inferiore statico. Ciò consente ai ricercatori di misurare quantitativamente l'esternalizzazione delle cellule circolanti lungo il gradiente di chemoattrattanti e in condizioni di flusso fisiologico. Questo metodo può inoltre essere utilizzato per studiare l'effetto del dialogo tra le cellule del microambiente locale e le cellule endoteliali sull'extravasamento delle cellule circolanti.

Aiutando un ulteriore strato di cellule su un inserto separato posizionato al di sotto delle cellule endoteliali, la procedura verrà dimostrata da Valentina contro rova, una tecnica del mio laboratorio. Per iniziare, calcolare il numero di inserti necessari per l'esperimento e posizionare ciascun inserto in una piastra di Petri sterile separata. Sterilizzarli mediante irradiazione gamma fino a quando la dose totale raggiunge 11 gray, in base alle singole configurazioni.

Quindi diluire la soluzione stock di collagene di tipo I a 50 microgrammi per millilitro utilizzando acido cloridrico 0,01 molare conservato a quattro gradi Celsius e preparare aliquote da 154 microlitri della soluzione finale per ogni inserto. Successivamente, posizionare alcune gocce provenienti da un singolo Eloqua sulla superficie dell'inserto in un modello circolare.

Quindi aggiungere il resto dell’aliquota per formare una goccia più grande sulla superficie dell’inserto. Assicurarsi che la punta della pipetta non tocchi mai l’inserto e che il collagene ricopra l’intera superficie dell’inserto, senza scivolare via. Una volta che l’inserto è completamente ricoperto, posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e appoggiarla con cura su una superficie piana.

Incubare gli inserti per un'ora a temperatura ambiente; al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di collagene e lavare la membrana con 160 microlitri di PBS. Quindi aspirare il PBS. Riposizionare il coperchio e avvolgere la piastra con parafilm.

Se gli inserti verranno utilizzati nello stesso giorno, posizionare la piastra di Petri in un luogo asciutto a temperatura ambiente. In caso contrario, conservare la piastra a quattro gradi Celsius e utilizzare l'inserto entro sette giorni. Raccogliere le cellule endoteliali venose umbelicali umane coltivate immediatamente prima dell'uso e ri-sospendere in mezzo di coltura desiderato a 2,5 milioni di cellule per millilitro.

Quando si contano le cellule, assicurarsi che la vitalità cellulare sia superiore al 98% utilizzando il blu di tripano, quindi aggiungere 160 microlitri di sospensione cellulare su ciascun inserto. Posizionare dapprima alcune piccole gocce sulla superficie dell'inserto rivestito di collagene disponendole in cerchio, quindi aggiungere con attenzione il resto della sospensione cellulare in modo da formare una goccia più grande. Al termine, sostituire i coperchi e posizionare con cura le piastre in un incubatore con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius, incubando per 30 minuti per consentire alle cellule di aderire alla membrana.

Dopo 30 minuti, rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere delicatamente cinque millilitri di mezzo di coltura preriscaldato su ciascun inserto. Avere cura di assicurarsi che l'inserto rimanga sul fondo della piastra ed sia completamente ricoperto dal mezzo. Quindi, sostituire i coperchi e riposizionare con attenzione le piastre nell'incubatore per la coltura.

Le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Per assemblare la camera di flusso, avvitare innanzitutto le piastre superiore e inferiore. Successivamente, collegare le piastre all'unità di scambio gassoso utilizzando un tubo in PVC con diametro interno di 1,42 millimetri e pareti spesse 0,8 millimetri.

Successivamente, posizionare il dispositivo assemblato in un sacchetto di plastica pulito e sterilizzarlo mediante irradiazione gamma fino a quando la dose totale raggiunge 11 gray. Il passo successivo consiste nel rimuovere un vassoio dell'incubatrice, posizionarlo in una cappa sterile per colture cellulari e sterilizzarlo con etanolo al 70%. Quindi coprire il vassoio con un grande tovagliolo sterile.

Successivamente, rimuovere il dispositivo dal sacchetto di plastica e posizionarlo sul vassoio sterile dell'incubatore. Quindi collegare il dispositivo alla pompa peristaltica e programmare la pompa affinché funzioni alla velocità di 0,2 millilitri al minuto. Pipettare da cinque a sette millilitri del mezzo di coltura desiderato in un tubo sterile da 15 millilitri da utilizzare come ingresso.

Quindi, scollegare il tubo di ingresso da quello di uscita estraendo l'ago metallico dal tubo utilizzando piccoli tamponi sterili per mantenere la sterilità del tubo, inserire l'ago metallico di ingresso nel tubo da 15 millilitri contenente il mezzo e posizionare il tubo di uscita nel tubo vuoto da 15 millilitri. Successivamente, accendere la pompa in modo che il flusso sia in senso antiorario. Lasciare che la pressione negativa aspiri il mezzo dal tubo di ingresso da 15 millilitri all'interno del tubo e arrestare la pompa quando il mezzo raggiunge l'estremità del tubo, appena prima che entri nel dispositivo.

Quindi aprire il dispositivo svitando le piastre del tubo ed estrarre con attenzione la pipetta della piastra superiore da 1500 a 1550 microlitri di mezzo nelle pozzette inferiori, assicurandosi che le pozzette contengano una quantità sufficiente di mezzo da formare un emisfero che raggiunga da uno a due millimetri al di sopra della piastra inferiore. Successivamente, trasferire gli inserti preparati dalle piastre di Petri alle pozzette della piastra inferiore. Utilizzando una pinzetta sterile, assicurarsi che non rimangano bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti ed aspirare qualsiasi mezzo che compaia sulla superficie della piastra inferiore.

Quindi rimettere la piastra superiore su quella inferiore e ricollegarle. Utilizzando le viti, accendere immediatamente la pompa peristaltica e far scorrere il mezzo attraverso il dispositivo 3D. Sollevare l'estremità di uscita del dispositivo e mantenere la camera in questa posizione per evitare la formazione di bolle nello spazio tra le piastre.

Continuare a riempire il tubo che collega la camera all'unità di scambio gassoso con il mezzo fino a quando quest'ultimo non raggiunge l'unità di scambio gassoso. Successivamente, versare tre millilitri di mezzo nell'unità di scambio gassoso. Accendere la pompa e permettere alle bolle d'aria di fuoriuscire attraverso di essa.

Sollevare l'unità in modo che il mezzo riempia il tubo in uscita e arrestare la pompa quando il mezzo si trova a due-tre centimetri dalla fine. Una volta completamente iniziata la circolazione, collegare l'ago di ingresso al tubo di uscita utilizzando piccoli tamponi sterili. Invertire quindi la pompa in modo che il mezzo fluisca in senso orario verso l'unità di scambio gassoso ed assicurarsi che vengano eliminate eventuali bolle d'aria residue.

Con la pompa nuovamente in flusso in senso antiorario, aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare in prova all'unità di scambio gassoso. Quindi chiudere il coperchio del respiratore.

Riposizionare il vassoio nell'incubatrice e lasciare circolare le cellule in prova nel dispositivo a 37 gradi Celsius. Trascorso il tempo desiderato, rimuovere il vassoio con il sistema operativo dall'incubatrice e posizionarlo nella cappa. Arrestare la pompa, scollegare l'ingresso e l'uscita e inserire le estremità in provette sterili vuote da 15 millilitri.

Quindi accendere la pompa e raccogliere la sospensione cellulare dal sistema. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio fino all'uso. Successivamente, smontare la camera rimuovendo le viti e sollevando la piastra superiore.

Rimuovere gli inserti dalla piastra inferiore e trasferirli in piatti di Petri per la colorazione o il recupero delle cellule. Infine, rimuovere la sospensione cellulare dai pozzetti inferiori e trasferirla in provette da 15 millilitri. Lavare ogni pozzetto due volte con 1,5 millilitri di mezzo e aggiungerlo alla rispettiva provetta.

Quindi centrifugare i tubi per cinque minuti a 200 G ed elaborare le cellule in base agli obiettivi sperimentali specifici, come indicato nel protocollo testuale allegato. Di seguito è riportato un esempio di uno dei numerosi test che possono essere eseguiti utilizzando questo sistema. Il sistema è costituito da cellule endoteliali derivate dal midollo osseo coltivate su inserti con pori di cinque micron, al di sotto dei quali è stato aggiunto il fattore stromale derivato dalle cellule (stromal cell derived factor one o SDF one) a concentrazioni di 0,5 o 50 nanogrammi per millilitro.

È stato consentito alle cellule del midollo osseo di circolare nel sistema 3D. Le cellule che hanno migrato attraverso l'inserzione sono state raccolte e successivamente coltivate in piastre con terreno al metilcellulosa. In presenza di fattori di crescita ematopoietici che inducono le cellule progenitrici a formare colonie, il numero di colonie è stato determinato dopo 14 giorni per valutare il numero di progenitori in ogni pozzetto e per rivelare la loro capacità di migrare verso lo sdf.

Uno in condizioni di flusso fisiologico. Con l'aggiunta di fibroblasti stromali coltivati sull'inserto inferiore nella camera statica, un numero maggiore di cellule ematopoietiche migrò dalla circolazione all'interno della camera con l'aggiunta di SDF-1 a 50 nanogrammi per millilitro, rispetto all'aggiunta di SDF-1 da solo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in diversi settori delle scienze mediche e biologiche per modellare in vitro le reti vascolari specifiche per tessuto ed esplorare i meccanismi cellulari e molecolari che mediano la migrazione delle cellule circolanti verso tessuti normali rispetto a tessuti malati.