3.10: Isolare gli acidi nucleici dal lievito

Oggi vi mostreremo come purificare gli acidi nucleici dal Saccharomyces cerevisiae, noto anche come lievito di birra. Gli acidi nucleici possono includere DNA o RNA. Questo video discuterà l'isolamento di queste molecole dalle cellule di lievito mediante separazione di fase e cromatografia.

Sebbene esistano molti metodi diversi per purificare gli acidi nucleici dal lievito, la maggior parte di essi condivide gli stessi passaggi iniziali.

Le cellule di lievito vengono prima propagate selezionando una singola colonia da una piastra e inoculandole in terreni YPD. La miscela deve essere coltivata durante la notte a 30 ? C in un'incubatrice agitante o rotante.

Le cellule di lievito dovrebbero essere raccolte nella fase di crescita a metà log per ottimizzare la resa. Il lievito nella fase logaritmica di crescita di solito ha una densità ottica o un valore di "OD" di 0,5-1 se misurato a una lunghezza d'onda di 600 nm. Una volta che le cellule hanno raggiunto la densità ottica appropriata, vengono centrifugate per formare un pellet e risospese in un tampone di lisi in modo che le cellule vengano aperte.

Uno degli aspetti più impegnativi dell'isolamento degli acidi nucleici dal lievito è la rottura delle sue dure pareti cellulari. Le pareti cellulari possono essere distrutte con una combinazione di tecniche enzimatiche e fisiche. La distruzione della parete cellulare provoca la formazione di cellule sferoidi chiamate sferoplasti che possono essere lisate con tecniche standard di lisi cellulare.

Gli sferoplasti sono tipicamente lisati con detergenti chimici come il dodecil solfato di sodio o SDS, che lisa le membrane cellulari. Le cellule possono anche essere omogeneizzate. Ad esempio, le perle di vetro possono essere aggiunte alle celle e le celle omogeneizzate mediante vortex. Oppure le pareti cellulari possono essere interrotte con suoni ad altissima frequenza, utilizzando un sonicatore, per facilitare il processo di lisi.

Come accennato, tutte le procedure di purificazione degli acidi nucleici eseguite nel lievito avranno passaggi simili per la crescita, la raccolta e la lisizzazione delle cellule di lievito, tuttavia una volta che le cellule sono state lisate, è possibile utilizzare diversi metodi per isolare gli acidi nucleici. Gli acidi nucleici possono essere purificati attraverso il legame della colonna o la separazione di fase.

Il DNA e l'RNA sono meglio isolati utilizzando il legame della colonna di silice. Gli acidi nucleici si legano alla colonna attraverso lo scambio anionico e possono essere eluiti dalla colonna una volta separati dagli altri componenti cellulari.

La separazione di fase utilizza il principio secondo cui soluzioni con proprietà diverse possono essere utilizzate per purificare o concentrare determinate proteine o acidi nucleici in base alla loro solubilità. L'aggiunta di cloroformio differenzia un impasto di componenti cellulari in due diverse fasi, quella acquosa e quella organica. La fase organica contiene proteine mentre la fase acquosa contiene acidi nucleici. Il DNA può quindi essere precipitato dalla fase organica con l'aggiunta di etanolo.

Gli acidi nucleici possono essere isolati dal lievito utilizzando un protocollo di legame della colonna. In primo luogo, le cellule vengono coltivate e raccolte mediante centrifugazione.

Il surnatante viene rimosso e scartato mentre il pellet cellulare viene risospeso in un tampone contenente enzima, vortexato e incubato fino a quando le pareti cellulari non vengono digerite. La digestione della parete cellulare e la formazione di sferoplasti possono essere verificate con la microscopia durante l'ottimizzazione del trattamento enzimatico. Dopo la digestione della parete cellulare, il tampone di lisi viene aggiunto alle cellule e la miscela viene agitata.

Le cellule lisate devono essere centrifugate per chiarire la miscela di detriti, lasciando il DNA e le piccole particelle e le proteine solubili nel surnatante. Il surnatante viene caricato su una colonna di silice e gli acidi nucleici vengono quindi lasciati legare dopo la centrifugazione, che rimuoverà la maggior parte delle impurità solubili.

Le fasi di lavaggio vengono eseguite con etanolo o tampone ad alto contenuto di sale per rimuovere le impurità residue dagli acidi nucleici legati. Infine, il DNA o l'RNA viene eluito con acqua o un tampone a basso contenuto di sale. Assicurati di utilizzare un tampone o acqua priva degli enzimi DNAsi e RNAsi.

Gli acidi nucleici isolati dal lievito hanno una varietà di usi a seconda dell'obiettivo sperimentale specifico. Il DNA isolato dal lievito può essere utilizzato per una serie di diverse tecniche di biologia molecolare, tra cui: PCR, southern blotting o digestione con enzimi di restrizione.

I cambiamenti nell'espressione genica possono essere identificati da un processo noto come analisi dei microarray, che utilizza array di geni come questo.

Se abbiamo due colture di lievito, una esposta al perossido di idrogeno e una di controllo, l'mRNA può essere isolato da queste colture e ibridato su vetrini di microarray. I vetrini vengono analizzati e possono essere identificati i geni che vengono modificati dallo stress ossidativo.

In questo video, i ricercatori utilizzano un sistema robotico per preparare una libreria di mutanti di lievito a livello di genoma, che vengono utilizzati per valutare la funzione genica. Grazie all'inserimento di sequenze appositamente ingegnerizzate, chiamate codici a barre genetici, nei geni, il DNA genomico di ceppi mutanti può essere estratto da 4.000 a 6.000 individui contemporaneamente e sottoposto ad analisi o sequenziamento di microarray. Sulla base dell'abbondanza relativa delle sequenze di codici a barre, l'idoneità di ciascun mutante può essere determinata in molteplici condizioni sperimentali.

Hai appena visto il video di JoVE sull'isolamento degli acidi nucleici dal lievito. A questo punto è necessario comprendere gli aspetti di base della purificazione degli acidi nucleici, come preparare le cellule di lievito per la lisi e come eseguire diverse procedure di estrazione e isolamento. Come sempre, grazie per la visione!