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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Isolare gli acidi nucleici dal lievito

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Isolating Nucleic Acids from Yeast

3.9: C. elegans Development and Reproduction

3.13: Yeast Transformation and Cloning

38,163 Views

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06:49 min

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April 30, 2023

Overview

Uno dei molti vantaggi dell’utilizzo del lievito come sistema modello è che grandi quantità di biomacromolecole, compresi gli acidi nucleici (DNA e RNA), possono essere purificate dalle cellule coltivate.

Questo video affronterà i passaggi necessari per eseguire l’estrazione dell’acido nucleico. Inizieremo delineando brevemente la crescita e la raccolta e la lisi delle cellule di lievito, che sono i primi passi comuni all’isolamento di tutte le biomacromolecole. Successivamente, discuteremo due metodi di purificazione unici per la separazione degli acidi nucleici: legame della colonna e separazione di fase. Inoltre, dimostreremo diversi modi in cui questi metodi vengono applicati in laboratorio, tra cui la preparazione di acidi nucleici per tecniche di biologia molecolare come PCR e southern blotting, quantificazione dell’espressione genica in risposta a stimoli ambientali e purificazione di grandi quantità di proteine ricombinanti.

Procedure

Oggi ti mostreremo come purificare gli acidi nucleici da Saccharomyces cerevisiae, noto anche come lievito di birra. Gli acidi nucleici possono includere DNA o RNA. Questo video discuterà l’isolamento di queste molecole dalle cellule di lievito mediante separazione di fase e cromatografia.

Sebbene esistano molti metodi diversi per purificare gli acidi nucleici dal lievito, la maggior parte di essi condivide gli stessi passaggi iniziali.

Le cellule di lievito vengono prima propagate selezionando una singola colonia da una piastra e inoculando in mezzi YPD. La miscela deve essere coltivata durante la notte a 30 °C in un’incubatrice vibrante o rotante.

Le cellule di lievito dovrebbero essere raccolte nella fase intermedia della crescita per ottimizzare la resa. Il lievito nella fase logaritrica della crescita di solito ha una densità ottica o un valore “OD” di 0,5-1 se misurato a una lunghezza d’onda di 600 nm. Una volta che le cellule hanno raggiunto la densità ottica appropriata, vengono centrifugate per formare un pellet e riconsocie in un tampone di lisi in modo che le cellule si rompono.

Uno degli aspetti più impegnativi dell’isolamento degli acidi nucleici dal lievito è l’interruzione delle sue pareti cellulari dure. Le pareti cellulari possono essere distrutte con una combinazione di tecniche enzimatiche e fisiche. La distruzione della parete cellulare fa sì che il lievito formi cellule sferoidi chiamate sferoplasti che possono essere lizzate tramite tecniche standard di lisi cellulare.

Gli sferoplasti sono tipicamente lisati con detergenti chimici come il solfato di sodio dodecile o SDS, che lyse le membrane cellulari. Le cellule possono anche essere omogeneizzate. Ad esempio, le perle di vetro possono essere aggiunte alle cellule e le cellule omogeneizzate mediante vortice. Oppure le pareti cellulari possono essere interrotte con un suono ad altissima frequenza, utilizzando un sonicatore, per aiutare nel processo di lisi.

Come accennato, tutte le procedure di purificazione degli acidi nucleici eseguite nel lievito avranno passaggi simili per la crescita, la raccolta e la lisi delle cellule di lievito, tuttavia una volta che le cellule sono state lizzate, è possibile utilizzare diversi metodi per isolare gli acidi nucleici. Gli acidi nucleici possono essere purificati attraverso il legame della colonna o la separazione di fase.

Il DNA e l’RNA sono meglio isolati usando il legame della colonna di silice. Gli acidi nucleici si legano alla colonna attraverso lo scambio anionico e possono essere eluiti dalla colonna una volta separati da altri componenti cellulari.

La separazione di fase utilizza il principio secondo cui soluzioni con proprietà diverse possono essere utilizzate per purificare o concentrare determinate proteine o acidi nucleici in base alla loro solubilità. L’aggiunta di cloroformio differenzia un impasto di componenti cellulari in due diverse fasi, quella acquosa e quella organica. La fase organica contiene proteine mentre la fase aqueos contiene acidi nucleici. Il DNA può quindi essere precipitato dalla fase organica con l’aggiunta di etanolo.

Gli acidi nucleici possono essere isolati dal lievito utilizzando un protocollo di legame a colonna. In primo luogo, le cellule vengono coltivate e raccolte mediante centrifugazione.

Il surnatante viene rimosso e scartato mentre il pellet cellulare viene risussoso in un tampone contenente enzimi, vorticoso e incubato fino a quando le pareti cellulari non vengono digerite. La digestione della parete cellulare e la formazione di sferoplasti possono essere verificate con la microscopia quando si ottimizza il trattamento enzimatico. Dopo la digestione della parete cellulare, il tampone di lisi viene aggiunto alle cellule e la miscela viene vorticosa.

Le cellule lizzate devono essere centrifugate per chiarire la miscela di detriti, lasciando DNA e piccoli particolati e proteine solubili nel surnatante. Il surnatante viene caricato su una colonna di silice e gli acidi nucleici vengono quindi lasciati legare dopo la centrifugazione, che rimuoverà una massa delle impurità solubili.

Le fasi di lavaggio vengono eseguite con etanolo o tampone ad alto contenuto salino per rimuovere le impurità residue dagli acidi nucleici legati. Infine, il DNA o l’RNA viene eluito con acqua o un tampone a basso contenuto di sale. Assicurati di utilizzare un tampone o acqua priva degli enzimi DNAse e RNAse.

Gli acidi nucleici isolati dal lievito hanno una varietà di usi a seconda del tuo specifico obiettivo sperimentale. Il DNA isolato dal lievito può essere utilizzato per una serie di diverse tecniche di biologia molecolare tra cui: PCR, southern blotting o digestione enzimatica di restrizione.

I cambiamenti nell’espressione genica possono essere identificati da un processo noto come analisi microarray, che utilizza array di geni come questo.

Se abbiamo due colture di lievito, una esposta al perossido di idrogeno e una di controllo, l’mRNA può essere isolato da queste colture e ibridato su vetrini di microarray. I vetrini vengono analizzati e i geni che vengono modificati dallo stress ossidativo possono essere identificati.

In questo video, i ricercatori fanno uso di un sistema robotico per preparare una libreria di mutanti di lievito a livello di genoma, che vengono utilizzati per valutare la funzione genica. A causa dell’inserimento di sequenze specificamente ingegnerizzate, chiamate codici a barre genetici, nei geni il DNA genomico da ceppi mutanti può essere estratto da 4.000 a 6.000 individui contemporaneamente e sottoposto ad analisi o sequenziamento di microarray. Sulla base dell’abbondanza relativa delle sequenze di codici a barre, la forma fisica di ciascun mutante può essere determinata in più condizioni sperimentali.

Hai appena visto il video di JoVE sull’isolamento degli acidi nucleici dal lievito. Ora dovresti capire gli aspetti di base della purificazione degli acidi nucleici come preparare le cellule di lievito per la lisi e come eseguire diverse procedure di estrazione e isolamento. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Today we will be showing you how to purify nucleic acids from Saccharomyces cerevisiae, also known as baker’s yeast. Nucleic acids can include DNA or RNA. This video will discuss the isolation of these molecules from yeast cells by phase separation and chromatography.

Though many different methods exist to purify nucleic acids from yeast, most of them share the same initial steps.

Yeast cells are first propagated by selecting a single colony from a plate and inoculating into YPD media. The mixture should be grown overnight at 30 °C in a shaking or rotating incubator.

Yeast cells should be harvested in the mid-log phase of growth to optimize yield. Yeast in the log phase of growth will usually have an optical density or “OD” value of 0.5-1 when measured at a wavelength of 600 nm. Once cells have reached the appropriate optical density, they are centrifuged to form a pellet, and resuspended in lysis buffer so that cells are broken open.

One of the most challenging aspects of isolating nucleic acids from yeast is disrupting its tough cell walls. Cell walls can be destroyed with a combination of enzymatic and physical techniques. The destruction of the cell wall causes yeast to form spheroid cells called spheroplasts that can be lysed via standard cell lysis techniques.

Spheroplasts are typically lysed with chemical detergents such as sodium dodecyl sulfate or SDS, which lyse cellular membranes. Cells can also be homogenized. For instance, glass beads can be added to cells and cells homogenized by vortexing. Or cell walls can be disrupted with ultra-high frequency sound, using a sonicator, to aid in the lysis process.

As mentioned all nucleic acid purification procedures done in yeast will have similar steps for growing up, harvesting, and lysing yeast cells, however once cells are lysed, several different methods can be used to isolate nucleic acids. Nucleic acids can be purified through column binding or phase separation.

DNA and RNA are best-isolated using silica column binding. Nucleic acids will bind to the column through anion exchange and can be eluted from the column once separated from other cellular components.

Phase separation uses the principle that solutions with different properties can be used to purify or concentrate certain proteins or nucleic acids based on their solubility. The addition of chloroform differentiates a slurry of cell components into two different phases, the aqueous and organic. The organic phase contain proteins while the aqueos phase contains nucleic acids. The DNA can then be precipitated from the organic phase with the addition of ethanol.

Nucleic acids can be isolated from yeast using a column binding protocol. First, cells are grown up and harvested by centrifugation.

The supernatant is removed and discarded while the cell pellet is resuspended in enzyme-containing buffer, vortexed, and incubated until cell walls are digested. Cell wall digestion and spheroplast formation can be verified with microscopy when optimizing enzyme treatment. After cell wall digestion, lysis buffer is added to the cells and the mixture is vortexed.

The lysed cells should be centrifuged to clarify the mixture of debris, leaving DNA and small particulates and soluble proteins in the supernatant. The supernatant is loaded onto a silica column and nucleic acids are then allowed to bind following centrifugation, which will remove a bulk of the soluble impurities.

Washing steps are performed with ethanol or high salt buffer to remove residual impurities from the bound nucleic acids. Finally, the DNA or RNA is eluted with water or a buffer low in salt. Be sure to use a buffer or water that is free of the enzymes DNAse and RNAse.

Nucleic acids isolated from yeast have a variety of uses depending on your specific experimental goal. DNA isolated from yeast can be used for a number of different molecular biology techniques including: PCR, southern blotting, or restriction enzyme digestion.

Changes in gene expression can be identified by a process known as microarray analysis, which uses gene arrays like this one.

If we have two yeast cultures, one exposed to hydrogen peroxide and one a control, mRNA can be isolated from these cultures and hybridized on microarray slides. The slides are analyzed and the genes that are modified by oxidative stress can be identified.

In this video, researchers make use of a robotic system to prepare a library of genome-wide yeast mutants, which are used to evaluate gene function. Due to the insertion specifically-engineered sequences, called genetic barcodes, into genes genomic DNA from mutant strains can be extracted from 4,000 to 6,000 individuals simultaneously and subjected to microarray analysis or sequencing. Based on the relative abundance of the barcode sequences, the fitness, of each mutant can be determined under multiple experimental conditions.

You’ve just watched JoVE’s video on isolating nucleic acids from yeast. You should now understand the basic aspects of purifying nucleic acids such how to prepare yeast cells for lysis and how to perform different extraction and isolation procedures. As always, thanks for watching!

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