Name: Modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di Parkinson (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri il ruolo delle isozime lipossigenasi nella degenerazione nigrostriatale correlata al morbo di Parkinson utilizzando topi carenti di LOX e il modello neurotossico MPTP. Questo metodo rivela effetti isozima-specifici sulla neuroinfiammazione.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health NIGMS 056062.

Non c'è nulla da rivelare.

La progettazione di questo studio di interazione gene-ambiente ci ha permesso di ottenere nuove informazioni sulla natura duale dell'isozima 5-LOX nel percorso nigrostriatale. Eseguendo HPLC per misurare le monoammine stritali dopo il trattamento saline o MPTP in transgenica priva dell'isozima 5-LOX e dei loro littermates di tipo selvatico, siamo stati in grado di notare che la sua carenza sembra essere protettiva in condizioni tossiche (Figura 1), ma in condizioni normali, la mancanza dell'enzima riduce...

L'uso di modelli di interazione gene-ambiente fornisce un approccio ai fattori di rischio imitatori che probabilmente influenzano il morbo di Parkinson idiopatico (PD) e offre l'opportunità di discernere intuizioni meccaniche che difficilmente saranno chiarite dall'uso di un solo sistema genetico o tossico1,2. Qui illustriamo questo punto e descriviamo l'applicazione del modello di topo 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) della degenerazione nigrostriatale3 per comprendere meglio la selettività dell'attività isozima lipossigenasi (LOX) sulla neuroinflammazione e tossicità4. Mentre un ruolo per gli isozimi LOX è stato ampiamente valutato nei disturbiperiferici 5,6 così come nella malattia del SNC tra cuil'ictus 7 e il morbo di Alzheimer8,9, il ruolo della famiglia degli isozimi nella funzione nigrostriatale e nella degenerazione correlata alla PD non è ben compreso e merita uno studio. La neurotossina MPTP dimostra una degenerazione preferenziale della via nigrostriatale e ricapitola l'esaurimento della dopamina striatale e la perdita di cellule dopaminergiche nigral che sono alla base delle compromissioni motorie nei pazienti con PD10. Sebbene questo modello non riproduca l'intero cadre dei comportamenti della PD non motoria e motoria e della patologia del corpo lewy positiva alla α-sinuchicina, è stato utile chiarire nuovi obiettivi meccanicistici che contribuiscono al danno nigrostritale e per i test traslazionali in fase iniziale in quanto è il modello non invasivo meglio caratterizzato disponibile per produrre in modo affidabile la morte cellulare nigrale accompagnata da perdita di dopamina stritale11-15. L'ampio utilizzo del topo MPTP, con paradigmi che vanno da acuto, subacuto acronico 16-18,ha permesso la standardizzazione del dosing per provocare danni nigrostriatali da lievi agravi 19,20 con attivazione di diversi meccanismi di tossicità a seconda del regime di trattamento18,21,22. Di conseguenza, ciò consente di prendere di mira una "finestra di lesioniing" che può comportare lesioni nigrostriali migliorate o ridotte a seconda dell'agente terapeutico o del modello transgenicoutilizzato 23-25.
Essenziali anche per gli studi di biologia traslizionale e di scoperta sono le tecniche utilizzate per valutare i danni e le prove fornite da tali metodi. Per il modello di topo MPTP, le metriche stabilite per valutare la lesioning sono la misurazione dei marcatori del tono dopaminergico striato, tra cui la dopamina e i suoi metaboliti da parte dell'HPLC, e l'analisi western blot dell'idrossilasi tirosina (TH), l'enzima limitante della velocità nella sintesi della dopamina e indicatori di eventi degenerativi come l'attivazione gliale utilizzando l'analisi western della macchia e l'immunoistochimica4. Sebbene queste siano procedure neurochimiche classiche, biochimiche e istologiche, le tecniche forniscono letture critiche e riproducibili sull'entità del danno all'interno della via dopaminergica nigrostriatale, indicano meccanismi di tossicità e si sono dimostrate strumenti preziosi per comprendere gli eventi degenerativi nella PD.

<table><tbody><tr><td>1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-idropiridina cloridrato (MPTP-HCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0896</td><td>per modellazione PD</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide (paraformaldeide) al 4%, tamponata con fosfato (PFA)</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>BUP0157</td> per fissazione per <td>immersione</td></tr><tr><td>Reagente ACS per acido perclorico, 70% (PCA)</td><td>244252 Sigma-Aldrich</td><td>per l'estrazione</td><td></td></tr> <tr><td>di acido HPLCTris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>per l'omogeneizzazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Acido etilendiaminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>per l'omogeneizzazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>per l'omogeneizzazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5726</td><td>per l'omogeneizzazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>per il saggio delle proteine di Lowry</td></tr><tr><td>Saccarosio, biologia molecolare, &ge; 99,5% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>per crioprotezione</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, polvere, pH 7,4 (per 0,01 M PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>per</td></tr><tr><td>kit di dosaggio delle proteine IHC BCA Pierce</td><td>/Thermo</td><td>23225</td><td>per la determinazione delle proteine</td></tr><tr><td>Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12 pozzetti</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>EC60052BOX</td><td>per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Tampone (4x)</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Novex Sharp Prestained Protein Standard&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5800</td><td>scala proteica</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato, elettroforesi, 98,5% (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Alcool metilico, anidro, reagente&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>SPM1057C</td><td>metanolo per il trasferimento</td></tr><tr><td>di cloruro di sodio (NaCl), reagente ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>soluzione salina e tamponi</td></tr><tr><td>Latte in polvere secco scremato</td><td>Garofano</td><td>n/a</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>Ponceau S soluzione in acido acetico al 5%...</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-tirosina idrossilasi (TH),</td><td>chemicon/milliporo</td> policlonale di pecora <td>AB1542</td><td>per immunofluorescenza.</td></tr><tr><td>Anti-tirosina idrossilasi (TH), coniglio policlonale</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101-0</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; Actina, coniglio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2066</td><td>per l'immunoblotting</td></tr><tr><td>Proteina acida fibrillare anti-gliale (GFAP), coniglio policlonale</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB5804</td><td>per l'immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Proteina acida fibrillare antigliale, monoclonale di topo</td><td>Covance Inc.</td><td>SMI-22R</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra (H+L), perossidasi coniugata&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>31462</td><td>per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>capra anti-pecora, perossidasi coniugata</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31480</td><td>per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>capra anti-topo, perossidasi coniugata</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31430</td><td>per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34078</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>CL-XPosure Film 7 pollici x 9,5 pollici</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34089</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>Ripristina il tampone di stripping Western Blot&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>21059</td><td>per immunoblotting</td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato, reagente ACS, &ge; 99,0%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Siero d'Asino Normale</td><td>Millipore</td><td>S30-100ML</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone (PVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Albumina di Siero Bovino (BSA), liofilizzato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-01</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 568 etichettato&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A10042</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-095-147</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Millipore</td><td>S26-100ML</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kit (IgG di coniglio)&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4001</td><td>per IHC; 10 &micro; l ciascuna delle soluzioni A e B per 1 ml di PBS (secondo le istruzioni)</td></tr><tr><td>DAB Perossidasi Substrate Kit, 3,3'-diaminobenzidina</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>per IHC; per 5 ml di ddH2O, aggiungere 2 gocce di soluzione madre tampone, 2 gocce di DAB e 1 goccia di H2O2 (H2 O2 viene aggiunto immediatamente prima dell'uso)</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno, 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td>per la fase di tempra in IHC</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Biocare Medicals</td><td>CP290A</td><td>per IHC</td></tr><tr><td>Cresyl Violet Solution, Regular Strength&nbsp;</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PS102-01</td><td>colorante di contrasto per Iba1 IHC</td></tr><tr><td>95% etanolo, alcool reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td>disidratazione per IHC</td></tr><tr><td>100% etanolo assoluto</td><td>Mallinckrodt</td><td>7019-10</td><td>disidratazione per IHC</td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>decolorazione per IHC</td></tr><tr><td>xilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>agente di pulizia per IHC</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522</td><td>supporto di montaggio per DAB IHC</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>EMOCTCS</td><td>terreno embeddium per il taglio del criostato</td></tr><tr><td>Permanganato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>per decontaminare la soluzione DAB</td></tr><tr><td>Dopamina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Acido 3,4-diidrossifenilacetico (DOPAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>850217</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Acido omovanillico (HVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1252</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Acido perclorico (PCA) - 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Sodio diidrogeno fosfato monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71504</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>1-Acido Tanansolfonico sale sodico (OSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8380</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Acqua deionizzata distillata di grado HPLC (ddH2O)</td><td>Millipore</td><td></td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>0.22 & micro; m Membrana GSTF</td><td>Millipore</td><td></td><td>per filtrazione</td></tr><tr><td>Corning Netwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3477</td> inserto in <td>polistirene con fondo in rete di poliestere, per IHC</td></tr><tr><td>Disgregatore cellulare ad ultrasuoni (Soniprep 150)</td><td>MSE</td><td>MSE.41371.274</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5414R</td><td></td></tr><tr><td>ESA MD-150 colonna a fase inversa&nbsp;</td>Pompa <td>HPLC ESA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Ultimate 3000)</td><td>Autocampionatore HPLC Dionex</td><td>ISO-3100BM</td><td></td></tr><tr><td>(Ultimate 3000)</td><td>Rivelatore elettrochimico Dionex</td><td>WPS-3000TSL</td><td></td></tr><tr><td>Cella</td> di protezione <td>ESA</td><td>Coulochem III</td><td></td></tr> Cella <tr><td>analitica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ESA</td><td>5020</td><td></td></tr> Software <tr><td>Chromeleon</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E400</td><td>Nikon</td><td>E400</td><td>microscopio a luce/fluorescente</td></tr><tr><td>Gabbia per mouse monouso</td><td>Ancare</td><td>N10HT</td><td></td></tr><tr><td>Microfiltro superiore</td><td>Ancare</td><td>N10MBT</td><td></td></tr><tr><td>5-LOX topi carenti</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004155</td><td></td></tr><tr><td>topi carenti di 12/15-LOX</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002778</td><td></td></tr></tbody></table>

modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di parkinson

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

L'attività della lipossigenasi (LOX) è stata implicata in disturbi neurodegenerativi come il morbo di Alzheimer, ma i suoi effetti nella patogenesi del morbo di Parkinson (PD) sono meno compresi. I modelli di interazione gene-ambiente hanno utilità nello smascherare l'impatto di specifiche vie cellulari in tossicità che non possono essere osservate usando solo un modello di malattia genetica o tossico. Per valutare se isozimi LOX distinti contribuiscono selettivamente alla neurodegenerazione correlata alla PD,i topi transgenici (cioè 5-LOX e 12/15-LOX carenti) possono essere sfidati con una tossina che imita la lesione cellulare e la morte nel disturbo. Qui descriviamo l'uso di una neurotossina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP), che produce una lesione nigrostriatale per chiarire i distinti contributi degli isozimi LOX alla neurodegenerazione legata alla PD. L'uso dell'MPTP nel topo, e nel primate non umano, è ben consolidato per riassumere i danni nigrostriatale nella PD. L'estensione della lesioning indotta da MPTP è misurata dall'analisi HPLC della dopamina e dei suoi metaboliti e dall'analisi semi-quantitativa western dello striato per l'idrossilasi tirosina (TH), l'enzima limitante della velocità per la sintesi della dopamina. Per valutare i marcatori infiammatori, che possono dimostrare sensibilità isozima-selettiva LOX, le proteine acide fibrillari gliali (GFAP) e l'immunoistochimica Iba-1 vengono eseguite su sezioni cerebrali contenenti substantia nigra, e l'analisi gfap western blot viene eseguita su omogeneati striatoli. Questo approccio sperimentale può fornire nuove informazioni sulle interazioni gene-ambiente alla base della degenerazione nigrostriatale e della PD.

Questo paradigma di esposizione alla tossina può produrre un significativo e rilevabile esaurimento della dopamina striatale del 20% negli animali iniettati da MPTP rispetto a quello iniettato in soluzione salina. È importante notare che diversi lotti di MPTP possono produrre leggermente più o meno lesioni; pertanto, per una migliore precisione, si raccomanda un esperimento preliminare nei topi di tipo selvatico prima dell'uso in transgenica quando viene utilizzato un nuovo lotto di neurotossina. L'uso di lesioni da liev...

Gli isozimi lipossigenasi (LOX) possono generare prodotti che possono aumentare o diminuire la neuroinfiamminazione e la neurodegenerazione. Uno studio di interazione gene-ambiente potrebbe identificare effetti specifici dell'isozima LOX. L'uso del modello 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) del danno nigrostriatale in due linee transgeniche carenti di isozima LOX consente il confronto del contributo degli isozimi LOX sull'integrità dopaminergica e sull'infiammazione.

Modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è comprendere il ruolo degli enzimi isoformi della lipossigenasi nella degenerazione nigrostriatale associata alla malattia di Parkinson. A tal fine, viene preparata con attenzione una neurotossina che induce una lesione Nigro SAL. Successivamente, topi privi di LOCK vengono iniettati con la soluzione MPTP ogni giorno per quattro giorni consecutivi; sette giorni dopo l'ultimo iniezione, si procede all'analisi.I campioni vengono raccolti e utilizzati per analisi biochimiche o immunoistochimiche. I risultati mostrano che 1215 locks non influisce sulla tossicità NIGROSTRIATALE indotta da MPTP. Tuttavia, cinque locks contribuisce al danno in condizioni di tossicità.Il metodo TS può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della malattia di Parkinson. Suggerisce quale sia l'impatto delle interazioni tra geni e ambiente sulla vulnerabilità del nucleo striato. Utilizzando modelli di interazione tra geni e ambiente, siamo stati in grado di distinguere funzioni selettive ISO e di ottenere informazioni sul ruolo di cinque tipi.Il personale adeguatamente formato deve indossare idonei dispositivi di protezione individuale durante tutta

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