High-throughput fluorometrica misura del potenziale di suolo extracellulari enzimi Attività

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i tassi potenziali massimi con cui gli enzimi extracellulari nei suoli degradano i loro substrati bersaglio. Ciò si ottiene combinando prima il terreno umido del campo e il tampone in un miscelatore, quindi pipettando i campioni misti in una piastra per campioni a pozzetti profondi e piastre standard a pozzetti profondi. Le piastre a pozzetti profondi vengono incubate e centrifugate prima che 250 microlitri vengano trasferiti da ciascun pozzetto delle piastre a pozzetti profondi ai corrispondenti pozzetti di fondo piatto nero.

Piastre a 96 pozzetti. Le tre piastre vengono quindi rosse sul fluorimetro e i dati risultanti vengono analizzati. In definitiva, le potenziali attività enzimatiche extracellulari del suolo sono determinate dalla velocità con cui il colorante fluorescente viene rilasciato dal substrato da una reazione catalizzata da un enzima in cui una maggiore fluorescenza indica una maggiore degradazione del substrato.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la capacità di misurare le attività enzimatiche in un gran numero di campioni sfruttando il formato di micropiastra a 96 pozzetti. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo visto l'opportunità di aumentare il volume del campione rispetto alla micropiastra standard, adattando altri protocolli al formato della piastra a pozzetti profondi. Le implicazioni di questa tecnica ci permettono di collegare meglio la fisiologia microbica ai processi su scala ecosistemica.

La dimostrazione visiva è fondamentale per questa tecnica perché ci sono molte sfumature e gestione del campione che non sono facili da seguire in una procedura scritta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'ecologia microbica e della biogeochimica del suolo, come ad esempio come i microbi del suolo rispondono ai cambiamenti nel loro ambiente e in che modo le loro risposte fisiologiche influenzano i processi critici dell'ecosistema, come la decomposizione e il ciclo dei nutrienti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla decomposizione della materia organica del suolo e sul ciclo dei nutrienti e sugli ecosistemi terrestri, può essere applicato anche ai sistemi marini e di acqua dolce.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con le competenze di pipettaggio e i problemi di sensibilità al tempo relativi a questo protocollo. Inoltre, la grande quantità di dati generati in questa procedura è a volte travolgente per gli utenti alle prime armi. Per iniziare la configurazione del saggio, etichettare tre piastre a pozzetti profondi come standard MUB campione per quattro metile e beone e standard MUC per sette ammino quattro metil cumarina.

Versare ogni standard e substrato in serbatoi separati e puliti e pre-etichettati orientati in file. Quindi pipettare lo standard MUB appropriato nei pozzetti corrispondenti della piastra standard MUB come elencato nel protocollo di testo. Ripetere questo processo per gli standard MUC nei pozzetti corrispondenti della piastra standard MUC per preparare i fanghi di terreno.

Per ogni campione di terreno, pesare 2,75 grammi di terreno umido prima di aggiungerlo a un frullatore. Aggiungere 91 millilitri, un tampone da 50 millimolari, frullare alla massima potenza per un minuto. Versare il contenuto del frullatore in una ciotola di vetro pulita larga almeno quanto una pipetta a otto canali con una barra di agitazione.

Il liquame di terreno può essere sedato attraverso un colino di circa un millimetro prima di versarlo nella ciotola. Posiziona la ciotola su un piatto da scale e mescola l'impasto di terra. Quindi pipettare 800 microlitri di liquame di terreno nella prima colonna della piastra del campione.

Fare lo stesso per la prima colonna delle targhe standard MUB e MUC. Sciacquare il frullatore, la piastra di agitazione e la barra di agitazione con acqua deionizzata o tampone tra i campioni di terreno. Ripetere questo processo per ogni campione di terreno.

Passaggio alla colonna successiva con ogni campione successivo. Quindi, pipettare il substrato appropriato nei pozzetti corrispondenti della piastra del campione. Come elencato nel protocollo di testo, preparare una piastra campione per ogni temperatura di incubazione da testare.

Sigillare le piastre a pozzetti profondi con tappetini per piastre. Capovolgere a mano ogni piastra sigillata fino a quando la soluzione non è completamente miscelata. Posizionare le piastre nell'incubatrice appropriata per il periodo di incubazione richiesto, come elencato nel protocollo di testo, registrare il tempo iniziale come tempo zero, nonché i tempi di incubazione appropriati alla fine di ciascun periodo di incubazione.

Centrifugare le piastre sigillate per tre minuti a circa 2, 900 G.Dopo il trasferimento della centrifugazione, 250 microlitri da ciascun pozzetto delle piastre a pozzetti profondi incubati nei corrispondenti pozzetti di piano nero. Piastre inferiori a 96 pozzetti. Verrà utilizzata una piastra nera per ogni piastra a pozzetti profondi incubata.

È importante trasferire i campioni dalle piastre a pozzetti profondi incubati nei pozzetti corrispondenti nel piano nero. Piastre inferiori a 96 pozzetti seguendo le istruzioni del produttore per il lettore di piastre metrico flora utilizzato. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 365 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 450 nanometri.

Caricare una delle piastre standard, impostare il fluorimetro sul guadagno automatico e leggere la piastra. Quindi imposta il guadagno su manuale e diminuisci il valore da ottimale al numero più basso successivo arrotondato al cinque più vicino. Per ogni piastra standard, ripetere la misurazione due volte per ogni piastra.

Quindi, caricare la piastra del campione. Impostare il guadagno su automatico ed eseguire la piastra del campione. Eseguire nuovamente la piastra campione manualmente per ottenere il guadagno più alto per ciascuna delle piastre standard.

Inizia l'analisi dei dati inserendo i dati di fluorescenza della curva standard in un foglio di calcolo per gli standard MUB e MUC. Convertire le concentrazioni micromolari in micromoli per ogni campione. Dati di fluorescenza della curva standard, calcola la pendenza y dell'intercetta e i valori R al quadrato per le concentrazioni standard di MUB e MUC.

I valori accettabili di r al quadrato devono superare 0,98 per ciascun campione. Le curve standard possono essere visualizzate in un grafico a dispersione con le letture della fluorescenza tracciate come variabile dipendente e la concentrazione standard tracciata come variabile indipendente. Inserire il campione e i dati grezzi di fluorescenza del substrato in un nuovo foglio di calcolo.

Includi anche il tempo di incubazione e il peso secco del suolo per ciascun campione, sottrai i valori di intercetta della curva standard dai corrispondenti valori di fluorescenza del campione e quindi dividi per la pendenza della curva standard corrispondente. Utilizzando l'equazione della linea standard, moltiplicare le micromoli del campione per 91 millilitri, che è il volume tampone utilizzato nel liquame del suolo. Dividere il valore ottenuto per il tempo di incubazione specifico del campione e la massa del terreno asciutto.

Infine, moltiplica il valore ottenuto per 1000 per ottenere le unità desiderate. I risultati sono mostrati da uno studio sperimentale sul clima che confronta i suoli che hanno sperimentato condizioni climatiche ambientali con i suoli che sono stati esposti a un'elevata anidride carbonica e i trattamenti di riscaldamento mostrati qui sono potenziali attività enzimatiche extracellulari o EEA nel sito di riscaldamento della prateria e nell'elevato arricchimento di anidride carbonica nelle parcelle di controllo e nelle parcelle di trattamento. In questo esempio, le potenziali attività di acquisizione di enzimi carbonio, azoto e fosforo a profondità del suolo da zero a cinque centimetri non differivano dal trattamento sperimentale.

Tuttavia, a profondità del suolo da 5 a 15 centimetri, diversi potenziali EEA differivano in modo significativo. Ad esempio, gli enzimi di degradazione del carbonio beta uno quattro glucocide e beta D cello biolace erano più bassi nelle parcelle di biossido di carbonio elevato e di trattamento termico rispetto alle particelle delle condizioni climatiche ambientali, anche gli enzimi mineralizzanti di azoto e fosforo erano più bassi nella parcella di trattamento rispetto alle condizioni climatiche ambientali. Da cinque a 15 centimetri di profondità del suolo.

Calcolare e tracciare la somma di tutti i potenziali EEA del ciclo del carbonio, dell'azoto o del fosforo può essere un approccio utile per osservare modelli più ampi riguardanti i potenziali cicli del carbonio, dell'azoto e/o del fosforo nel suolo. In questo esempio, la somma degli EEA potenziali beta uno quattro glucco, beta D violoncello, bioidrolasi, beta xlo e alfa uno quattro glucco potenziale è stata calcolata per rappresentare le potenziali attività di ciclo del carbonio. La somma di beta uno quattro N acetil glucosio tra dasi e L leucina amminopeptidasi è stata calcolata per rappresentare le potenziali attività del ciclo dell'azoto.

La fosfatasi è stata utilizzata per rappresentare potenziali attività ciclistiche al fosforo. I potenziali EEA per il ciclo totale del carbonio, dell'azoto e del fosforo hanno registrato una tendenza al ribasso nei piani di trattamento dell'anidride carbonica e del riscaldamento elevati rispetto ai lotti delle condizioni climatiche ambientali a profondità del suolo comprese tra cinque e 15 centimetri. Tuttavia, questa tendenza è stata significativa solo per le attività cicliche totali di azoto e fosforo e le AEA del suolo non differivano significativamente tra le parcelle di trattamento.

Da zero a cinque centimetri di profondità del suolo. I risultati suggeriscono tendenze contrastanti nell'attività enzimatica, gruppo funzionale tra le parcelle di trattamento in risposta alla profondità del suolo, il rapporto tra i potenziali EEA è un modo per valutare le richieste microbiche di nutrienti. Qui, le attività degli enzimi del suolo, della geometria del tochi, del carbonio in azoto, del carbonio in fosforo o da azoto in fosforo differiscono significativamente tra le parcelle di trattamento a profondità del suolo da zero a cinque centimetri.

Tuttavia, i potenziali rapporti enzimatici carbonio/fosforo e azoto/fosforo erano più elevati nei lotti di anidride carbonica elevata e di trattamento termico. Rispetto alle condizioni climatiche ambientali, da 5 a 15 centimetri di profondità del suolo, la temperatura può influenzare fortemente l'EEA del suolo. Tuttavia, nei tipici test di laboratorio, gli enzimi del suolo vengono misurati a una singola temperatura che potrebbe non corrispondere a due condizioni di temperatura in C.

I grafici di Aran vengono utilizzati per visualizzare l'energia di attivazione e vengono tracciati utilizzando il logaritmo dell'attività enzimatica in funzione della temperatura inversa convertita in gradi kelvin sull'asse x. L'energia di attivazione è comunemente definita come l'energia minima richiesta per catalizzare una reazione chimica ed è qui utilizzata come proxy per la sensibilità alla temperatura delle reazioni catalizzate da enzimi. Un'energia di attivazione più elevata indica la sensibilità alla temperatura dell'enzima.

Allo stesso modo, le energie di attivazione corrispondono direttamente a Q 10. I valori dei coefficienti di temperatura e la potenziale cinetica enzimatica per gli EEA di carbonio, azoto e fosforo sono stati valutati tra entrambe le parcelle di trattamento alle due profondità del suolo e i risultati hanno dimostrato che la sensibilità alla temperatura delle EEA non era significativamente diversa tra le parcelle di trattamento a entrambe le profondità del suolo. Una volta padroneggiati, 12 campioni possono essere inoculati nelle piastre per microtitolazione a 96 ruote in 30 minuti o meno.

Inoltre, dopo i tempi di incubazione prescritti, in genere è possibile centrifugare, trasferire e leggere nuovamente le piastre sull'urometro entro mezz'ora durante il tentativo di questa procedura. È importante pipettare in modo coerente. L'eventuale presenza di aria nel pipettaggio influirà negativamente sui risultati Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'estrazione e il sequenziamento del DNA, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative al ruolo della composizione della comunità microbica del suolo nella funzione del suolo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ecologia microbica per esplorare il ciclo dei nutrienti e i processi biogeochimici negli ecosistemi terrestri. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea davvero buona di come quantificare le potenziali attività enzimatiche.

Inoltre, dovresti essere in grado di interpretare i dati per riflettere le potenziali risposte microbiche a fattori come il clima e i diversi tipi di suolo all'interno di diversi ecosistemi. Non dimenticare che quando si lavora con materiali fluorescenti, è necessario prendere sempre precauzioni per ridurre al minimo l'esposizione alla luce a causa della sensibilità alla luce della porzione fluoro.