High-throughput fluorometrica misura del potenziale di suolo extracellulari enzimi Attività

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le velocità massime potenziali con cui gli enzimi extracellulari nei suoli degradano i loro substrati bersaglio. Questo viene ottenuto innanzitutto mescolando suolo umido prelevato in campo e tampone in un frullatore, quindi trasferendo con pipetta i campioni miscelati in una piastra campioni a pozzetti profondi e in piastre standard a pozzetti profondi. Le piastre a pozzetti profondi vengono incubate e centrifugate prima che 250 microlitri vengano trasferiti da ciascun pozzetto delle piastre a pozzetti profondi ai pozzetti corrispondenti di una piastra nera a fondo piatto.

Piastre a 96 pozzetti. Le tre piastre vengono quindi lette al fluorimetro e i dati ottenuti vengono analizzati. Infine, le potenziali attività enzimatiche extracellulari del suolo sono determinate dalla velocità con cui il colorante fluorescente viene rilasciato dal substrato attraverso una reazione catalizzata da enzimi, in cui una fluorescenza maggiore indica una maggiore degradazione del substrato.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la capacità di misurare le attività enzimatiche in un elevato numero di campioni sfruttando il formato a piastra microtitolazione da 96 pozzetti profondi. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo notato la possibilità di aumentare il volume del campione rispetto alla piastra microtitolazione standard adattando altri protocolli al formato di piastre con pozzetti profondi. Le implicazioni di questa tecnica ci permettono di correlare in modo più efficace la fisiologia microbica ai processi su scala di ecosistema.

La dimostrazione visiva è fondamentale per questa tecnica poiché vi sono molte sfumature e operazioni di manipolazione del campione che non sono facili da seguire in una procedura scritta. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande chiave nei campi dell'ecologia microbica e della biogeochimica del suolo, ad esempio in che modo i microrganismi del suolo rispondono ai cambiamenti del loro ambiente e come le loro risposte fisiologiche influenzano processi ecologici essenziali, come la decomposizione e il ciclo dei nutrienti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla decomposizione della materia organica del suolo e sul ciclo dei nutrienti negli ecosistemi terrestri, può essere applicato anche a sistemi marini e di acqua dolce.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà nelle abilità di pipettaggio e nei problemi legati alla sensibilità al tempo associati a questo protocollo. Inoltre, la grande quantità di dati generata in questa procedura può risultare schiacciante per gli utenti alle prime armi. Per iniziare l'allestimento del saggio, etichettare tre piastre a pozzetti profondi come standard MUB per quattro metil e beone e standard MUC per sette amino quattro metil cumarina.

Versare ogni standard e substrato in serbatoi separati, puliti e pre-etichettati, disposti in file. Quindi pipettare lo standard MUB appropriato nei pozzetti corrispondenti della piastra standard MUB come indicato nel protocollo testuale. Ripetere questo procedimento per gli standard MUC nei pozzetti corrispondenti della piastra standard MUC per preparare le sospensioni di suolo.

Per ogni campione di suolo, pesare 2,75 grammi di suolo umido in campo prima di aggiungerlo a un frullatore. Aggiungere 91 millilitri di un buffer a 50 millimolari e frullare a velocità massima per un minuto. Versare il contenuto del frullatore in una ciotola di vetro pulita, larga almeno quanto una pipetta a otto canali, con un agitatore magnetico.

La sospensione di suolo può essere filtrata attraverso un setaccio di circa un millimetro prima di versarla nel contenitore. Posizionare il contenitore su una piastra magnetica e mescolare la sospensione di suolo. Quindi, pipettare 800 microlitri di sospensione di suolo nella prima colonna della piastra dei campioni.

Eseguire la stessa operazione per la prima colonna delle piastre standard MUB e standard MUC. Risciacquare il frullatore, il piatto magnetico e la barretta di agitazione con acqua deionizzata o tampone tra un campione di suolo e l'altro. Ripetere questo procedimento per ciascun campione di suolo.

Spostandosi sulla colonna successiva per ogni campione successivo. Successivamente, pipettare il substrato appropriato nei pozzetti corrispondenti della piastra dei campioni. Come indicato nel protocollo testuale, preparare una piastra di campioni per ogni temperatura di incubazione da testare.

Sigillare le piastre a pozzetti profondi con tappi per piastre. Capovolgere manualmente ogni piastra sigillata fino a quando la soluzione non sarà mescolata completamente. Posizionare le piastre nell'incubatore appropriato per il tempo di incubazione richiesto, come indicato nel protocollo testuale; registrare il tempo iniziale come tempo zero, nonché i tempi di incubazione appropriati alla fine di ciascun periodo di incubazione.

Centrifugare le piastre sigillate per tre minuti a circa 2.900 ×g. Dopo la centrifugazione, trasferire 250 microlitri da ciascun pozzetto delle piastre a pozzetti profondi incubate nei pozzetti corrispondenti di piastre nere piatte da 96 pozzetti con fondo piano. Una piastra nera verrà utilizzata per ciascuna piastra a pozzetti profondi incubata.

È importante trasferire i campioni dalle piastre a pozzetti profondi incubate ai pozzetti corrispondenti nelle piastre nere a fondo piatto a 96 pozzetti seguendo le istruzioni del produttore per il lettore di piastre flora metric utilizzato. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 365 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 450 nanometri.

Caricare una delle piastre standard, impostare il fluorimetro sull'amplificazione automatica e leggere la piastra. Successivamente, impostare l'amplificazione su manuale e ridurre il valore da quello ottimale al successivo valore più basso arrotondato al multiplo di cinque più vicino. Per ciascuna piastra standard, ripetere la misurazione due volte per ogni piastra.

Successivamente, caricare la piastra del campione. Impostare il guadagno su automatico ed eseguire la piastra del campione. Eseguire nuovamente manualmente la piastra del campione per abbinare il guadagno più alto per ciascuna delle piastre standard.

Iniziare l'analisi dei dati inserendo i dati di fluorescenza della curva standard in un foglio di calcolo per lo standard MUB e MUC. Convertire le concentrazioni micromolari in micromoli per ogni campione. Relativamente ai dati di fluorescenza della curva standard, calcolare i valori di pendenza, intercetta sull'asse y e coefficiente di determinazione (R quadro) per le concentrazioni standard di MUB e MUC.

I valori di r quadrato accettabili devono superare 0,98 per ogni campione. Le curve standard possono essere visualizzate in un diagramma a dispersione, con le letture di fluorescenza riportate come variabile dipendente e la concentrazione del campione standard riportata come variabile indipendente. Inserire i dati grezzi di fluorescenza del campione più il substrato in un nuovo foglio di calcolo.

Includere anche il tempo di incubazione e il peso secco del suolo per ogni campione, sottrarre dai valori di fluorescenza dei campioni corrispondenti i valori dell'intercetta della curva standard e quindi dividere per la pendenza della curva standard corrispondente. Utilizzando l'equazione della retta standard, moltiplicare le micromoli del campione per 91 millilitri, che è il volume di tampone utilizzato nella sospensione del suolo. Dividere il valore ottenuto per il tempo specifico di incubazione del campione e per la massa di suolo secco.

Infine, moltiplicare il valore ottenuto per 1000 per ottenere le unità desiderate. I risultati mostrati provengono da uno studio sperimentale sul clima che confronta suoli esposti a condizioni climatiche ambientali con suoli esposti a elevate concentrazioni di anidride carbonica e trattamenti di riscaldamento; qui sono riportate le attività potenziali degli enzimi extracellulari (EEA) presso il sito di riscaldamento della prateria e di arricchimento in anidride carbonica, in appezzamenti di controllo e in appezzamenti sottoposti a trattamento. In questo esempio, le attività enzimatiche potenziali di acquisizione di carbonio, azoto e fosforo, misurate a profondità del suolo comprese tra zero e cinque centimetri, non differivano in base al trattamento sperimentale.

Tuttavia, a profondità del suolo comprese tra cinque e quindici centimetri, diversi potenziali EEAs differivano in modo significativo. Ad esempio, gli enzimi degradanti il carbonio beta 1-4 glucosidasi e beta D-cellobiase erano inferiori nei terreni sottoposti a trattamento con anidride carbonica elevata e riscaldamento rispetto ai terreni con condizioni climatiche ambientali; anche gli enzimi mineralizzanti azoto e fosforo erano inferiori nei terreni di trattamento rispetto alle condizioni climatiche ambientali. A profondità del suolo comprese tra cinque e quindici centimetri.

Il calcolo e la rappresentazione grafica della somma di tutte le potenziali EEA coinvolte nel ciclo del carbonio, dell'azoto o del fosforo può essere un approccio utile per osservare schemi più ampi relativi ai potenziali cicli del carbonio, dell'azoto e/o del fosforo nel suolo. In questo esempio, la somma delle potenziali EEA beta uno quattro glucco, beta D cello, bio idrolasi, beta xlo e alfa uno quattro glucco è stata calcolata per rappresentare le attività potenziali di ciclo del carbonio. La somma della beta uno quattro N-acetilglucosaminidasi e della L-leucina aminopeptidasi è stata calcolata per rappresentare le attività potenziali di ciclo dell'azoto.

La fosfatasi è stata utilizzata per rappresentare le potenziali attività del ciclo del fosforo. Le potenziali EEA per il ciclo del carbonio totale, dell'azoto e del fosforo hanno mostrato un andamento inferiore nei terreni sottoposti a trattamento con anidride carbonica elevata e riscaldamento, rispetto ai terreni con condizioni climatiche ambientali, a profondità del suolo comprese tra cinque e quindici centimetri. Tuttavia, questa tendenza è risultata significativa soltanto per le attività di ciclo dell'azoto e del fosforo totale, e le EEA del suolo non hanno mostrato differenze significative tra i terreni sottoposti ai diversi trattamenti.

A profondità di suolo da zero a cinque centimetri. I risultati indicano andamenti contrastanti nell'attività enzimatica e nei gruppi funzionali tra le parcelle sottoposte a trattamento in risposta alla profondità del suolo; il rapporto tra potenziali attività enzimatiche extracellulari è un metodo per valutare le richieste microbiche di nutrienti. In questo caso, gli enzimi del suolo, la geometria tochi, le attività del rapporto carbonio azoto, carbonio fosforo o azoto fosforo differiscono significativamente tra le parcelle sottoposte a trattamento a profondità da zero a cinque centimetri.

Tuttavia, i rapporti potenziali tra enzimi di carbonio e fosforo e tra azoto e fosforo erano più elevati nei parcelle sottoposte a trattamenti di anidride carbonica elevata e riscaldamento. Rispetto alle condizioni climatiche ambientali, alla profondità del suolo compresa tra cinque e quindici centimetri la temperatura può influenzare fortemente le attività enzimatiche extracellulari del suolo. Tuttavia, nei tipici saggi di laboratorio, gli enzimi del suolo vengono misurati a una singola temperatura che potrebbe non corrispondere alle condizioni di temperatura in C due.

I grafici di Aran sono utilizzati per visualizzare l'energia di attivazione e vengono tracciati usando il logaritmo dell'attività enzimatica in funzione dell'inverso della temperatura, convertita in gradi kelvin, sull'asse x. L'energia di attivazione è comunemente definita come l'energia minima necessaria per catalizzare una reazione chimica e viene utilizzata in questo contesto come indicatore della sensibilità alla temperatura delle reazioni catalizzate dagli enzimi. Un'energia di attivazione più elevata indica una maggiore sensibilità alla temperatura dell'enzima.

Allo stesso modo, le energie di attivazione corrispondono direttamente al coefficiente termico Q10. I valori del coefficiente termico della cinetica enzimatica potenziale per le attività enzimatiche extracellulari (EEA) di carbonio, azoto e fosforo sono stati valutati in entrambi i tipi di parcelle sperimentali alle due profondità del suolo, e i risultati hanno dimostrato che la sensibilità alla temperatura delle EEA non differiva significativamente tra le parcelle sperimentali a nessuna delle due profondità. Una volta acquisita padronanza, 12 campioni possono essere inoculati nelle piastre microtitolatrici a 96 pozzetti in 30 minuti o meno.

Inoltre, dopo i tempi di incubazione prescritti, di solito è possibile centrifugare, trasferire e leggere nuovamente le piastre sul fotometro entro mezz'ora durante il tentativo di questa procedura. È importante pipettare in modo costante. Qualsiasi presenza di aria durante la pipettaggio influirà negativamente sui risultati seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'estrazione e il sequenziamento del DNA, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative al ruolo della composizione della comunità microbica del suolo nella funzionalità del suolo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ecologia microbica per esplorare il ciclo dei nutrienti e i processi biogeochimici negli ecosistemi terrestri. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea molto chiara di come quantificare le attività enzimatiche potenziali.

Inoltre, si dovrebbe essere in grado di interpretare i dati per evidenziare le possibili risposte microbiche a fattori come il clima e i diversi tipi di suolo all'interno di diversi ecosistemi. Non dimenticare che quando si lavora con materiali fluorescenti, è sempre necessario adottare precauzioni per minimizzare l'esposizione alla luce a causa della sensibilità alla luce del gruppo fluoro.